Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Lactato deshidrogenasa es una enzima que clásicamente se ha descrito como citoplasmática. Pese a ello, algunos autores han aportado evidencia que sugiere la presencia de esta enzima en mitocondrias, lo que ha generado controversia respecto a su localización subcelular. Con el ánimo de aportar información que permita comprender el funcionamiento de la vía indirecta de síntesis de glicógeno en oocitos de rana, se decidió estudiar la localización de la enzima así como algunas de sus características. Para determinar la localización subcelular se compararon los resultados obtenidos de actividad de LDH con los resultados de actividad de enzimas marcadoras de fracción citoplasmática y mitocondrial en fracciones subcelulares obtenidas por centrifugación diferencial de extractos de oocitos de rana. La caracterización parcial de la enzima se realizó determinando los valores de Km para los sustratos, el pH óptimo de actividad de la enzima y el peso molecular nativo mediante cromatografía de exclusión molecular y el peso molecular de la subunidad por electroforesis desnaturante en geles de poliacrilamida (PAGE). Además, se observó la existencia de isoformas mediante cromatografía de intercambio iónico y electroforesis nativa en geles de poliacrilamida. Se determinó que lactato deshidrogenasa está presente en la fracción citoplasmática de los oocitos de rana y que está ausente en la fracción mitocondrial. Se caracterizaron las dos fracciones obtenidas mediante cromatografía de intercambio iónico observando una gran similitud en las características cinéticas de la enzima presente en cada fracción. Se calculó el peso molecular nativo de 131 KDa mediante cromatografía de filtración en gel y el peso molecular de la subunidad de la enzima de 33 KDa mediante electroforesis desnaturante. Se determinó la presencia de dos isoformas de la enzima mediante cromatografía de intercambio iónico.

Memoria para optar al titulo profesional de Bioquímico / En la vía directa de la síntesis de glicógeno en oocitos de rana participan cuatro enzimas que son la hexoquinasa (HK), la fosfoglucomutasa (PGM), la UDP-glucosa pirofoforilasa (UDPGPPasa) y la glicógeno sintasa (GS). La fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2) cataliza la conversión reversible de glucosa-6-fosfato (glc-6-P) en glucosa-1-fosfato (glc-1-P). Por otro lado, la glicógeno sintasa (EC 2.4.1.11) cataliza la incorporación de glucosa en glicógeno, transfiriendo un residuo glucosilo desde UDP-glucosa a un extremo no reductor del glicógeno. El análisis del control metabólico (MCA) proporciona un enfoque particular para estudiar la regulación del metabolismo, ya que permite cuantificar el efecto que ejerce una enzima sobre el flujo de una vía metabólica, en términos de su coeficiente de control de flujo. En este trabajo se aplicaron los postulados del análisis del control metabólico para estudiar el control que ejercen la PGM y la GS sobre el flujo de la vía directa de la síntesis de glicógeno. La actividad de la PGM se midió espectrofotométricamente cuantificando el NADH producido al acoplar la reacción de la glucosa-6-P deshidrogenasa a la producción de glc-6-P. La actividad endógena de PGM en oocitos resultó ser igual a 41 ± 3,1 mU por oocito, medida entre los meses de septiembre y enero, y de 9,4 ± 0,93 mU por oocito, medida entre los meses de abril y agosto. Su actividad máxima es a pH 7,5. La cinética para el sustrato glc-1-P es hiperbólica, con una Km app de 0,16 mM. Para determinar el control que ejerce la PGM sobre el flujo metabólico de la vía directa de la síntesis de glicógeno, se aumentó la actividad intracelular de la PGM por medio de microinyección de enzima exógena a oocitos de Caudiverbera caudiverbera en estadio VI de desarrollo. El coeficiente de control medido para la PGM resultó ser igual a 0,19. Este valor indica que la PGM ejercería un bajo control sobre el flujo metabólico de la vía directa. La actividad de la GS se midió usando un radioensayo que cuantifica la incorporación de glucosa marcada en glicógeno a partir de UDP-glucosa radiactiva. La actividad endógena de la GS en oocitos resultó ser igual a 0,7 ± 0,03 mU por oocito, independiente de la época del año en que se mide. No se logró determinar el control que ejerce la GS sobre el flujo metabólico de la vía directa de síntesis de glicógeno. Ello debido a que, por una parte, no hay disponibilidad de la enzima comercial en el mercado. Por otro lado, tampoco fue posible tener la cantidad de enzima requerida al intentar purificarla a partir de músculo de rana. La purificación consistía en tres etapas, que incluían la obtención de un pellet rico en glicógeno, y dos cromatografias en DEAEcelulosa y Sephacryl S-200. La enzima se purificó 684 veces, pero no se logró concentrar lo suficiente como para poder ser microinyectada dentro del oocito y determinar así el coeficiente de control para la GS / In amphibian oocytes, the direct pathway for glycogen synthesis includes four enzymes which are hexokinase (HK), phosphoglucomutase (PGM), UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and glycogen synthase (GS). Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) catalyzes the reversible conversion of glucose-6-phosphate (glc-6-P) into glucose-1-phosphate (glc-1-P). Glycogen synthase (EC 2.4.1.11) catalyzes the addition of a glucose residue to the non-reducing end of glycogen, using UDP-glucose as the substrate. Metabolic Control Analysis (MCA) provides a singular vision to the study of metabolic control. It allows quantification of the effect that a particular enzyme exerts upon the flux through the pathway in terms of the flux control coefficient. In this work we have applied MCA in order to study the control that PGM and GS exert over the flux in the direct pathway for glycogen synthesis. PGM activity was spectrophotometrically measured by quantifying NADH produced, in a coupled reaction catalyzed by glucose-6-P dehydrogenase. The endogenous PGM activity measured in the oocytes between september and january was 41 ± 3.1 mU per oocyte, while between april and august it was 9.4 ± 0.93 mU per oocyte. The maximal activity was found at pH 7.5. The kinetic for glc-1-P was hyperbolic, with a Km app of 0.16 mM. In order to determine the control that PGM exerts over the metabolic flux in the direct pathway for glycogen synthesis, we increased PGM activity by microinjecting exogenous enzyme into Caudiverbera caudiverbera stage VI oocytes. A control coefficient value of 0.19 was found for PGM. This value indicates that PGM exerts a low control over the metabolic flux in the direct pathway for glycogen synthesis. GS activity was measured using a radioactive assay that quantifies the incorporation of glucose into glycogen, using radiolabelled UDP-glucose as the substrate. The endogenous activity found for GS in the oocytes was about 0.7 ± 0.03 mU per oocyte, irrespective of the season of the year. To determine the control that GS exerts over the metabolic flux in the direct pathway for glycogen synthesis, and due to the lack of a pure commercial enzyme, we intended to purify the enzyme from frog´s muscle. The purification procedure involved three steps, beginning with the obtention of a glycogen-rich pellet, and continuing with a DEAE-cellulose and Sephacryl S-200 chromatographies. We obtained an enzyme that was purified 684 times, but efforts to concentrate the enzyme to obtain the amount required for microinjection were unsuccesful