Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / Tradicionalmente se ha abordado el estudio del control del metabolismo analizando las propiedades de los componentes de un sistema (enzimas, transportadores y otros) aislados del sistema completo. Durante las dos últimas décadas se han desarrollado algunas teorías para analizar el comportamiento de sistemas metabólicos completos con una aproximación sistémica, entre ellas la llamada análisis del control metabólico. Esta teoría considera los sistemas metabólicos como un todo; así, la respuesta del flujo original (δJ) a un pequeño cambio en la actividad de una enzima (δe) será entonces consecuencia de todas las variaciones de las concentraciones de intermediarios. Esta respuesta puede ser cuantificada por el coeficiente de control del flujo. En este trabajo se intentó determinar qué grado de control ejercen en la regulación del flujo de la vía directa de síntesis de glicógeno las enzimas UDP-glucosa pirofosforilasa (UGPasa) y glicógeno sintasa (GS), usando como modelo experimental los oocitos en estadio VI de rana Caudiverbera caudiverbera. UGPasa cataliza la reacción UTP + glucosa-1-P ⇔ UDP-glucosa + PPi. Ésta es una reacción que se encuentra en todos los organismos hasta ahora estudiados. Además de su función clave en la síntesis de disacáridos y polisacáridos, la enzima es esencial en la síntesis de la parte carbohidrato de glicolípidos, glicoproteínas y una variedad de metabolitos secundarios. La actividad de UGPasa en extractos crudos de oocitos de C. caudiverbera se midió en el sentido de la formación de UDP-glucosa por electroforesis capilar. Las corridas se realizaron en un capilar no protegido de 57 cm de longitud y 50 μm de diámetro, a un voltaje de 22 kV. La señal del nucleótido se determinó a 254 nm. Cuando se aplicó el método para medir la actividad de la enzima en extractos crudos se obtuvo una curva de tiempo lineal durante un tiempo experimental apropiado. La reacción reversa se midió por el método espectrofotométrico, acoplando y cuantificando la formación de NADPH a 340 nm. La actividad endógena de la enzima en oocitos resultó ser alrededor de 12 mU/oocito. La enzima presenta actividad máxima a pH 8,5. En relación a las constantes cinéticas para los sustratos de la reacción reversa, se encontró que la enzima tiene cinética sigmoidea para pirofosfato, con un K0,5 de alrededor de 460 μM y un nH mayor que 2,0. La cinética para UDP-glucosa es hiperbólica, con una Kmapp de 50 μM. Para la determinación del coeficiente de control de la enzima se procedió a inyectar en los oocitos cantidades crecientes de UGPasa pura. Se usó la enzima comercial de Sigma. Dado que ésta contenía impurezas, se procedió a purificarla por medio de una columna de exclusión molecular. La enzima microinyectada en los oocitos permaneció activa durante el tiempo que duraban los experimentos. El coeficiente de control para la enzima UGPasa en la vía directa de síntesis de glicógeno fué 0,15 y en la vía indirecta, 0,05. La glicógeno sintasa ha sido considerada tradicionalmente la enzima reguladora de la síntesis de glicógeno, pero estudios in vivo han puesto en duda esta afirmación. No existe enzima comercial disponible y no fue posible obtener enzima pura en la concentración adecuada para la microinyección. Como alternativa se procedió a la activación de la enzima por medio de glucosa-6- P. Los experimentos para determinar el efecto de la glucosa-6-P sobre la GS se realizaron microinyectando diferentes concentraciones de glucosa-6-P. Después de 8 min se procedió a la microinyección de UDP-[U-3H]glucosa 3 mM. Después de 12 min de incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. La activación máxima de la enzima fue entre 2 y 3 veces a 2 mM de glucosa-6-P inyectada. El efecto del éster fue transitorio, siendo máximo entre 5 a 10 min. Para la determinación del coeficiente de control se microinyectaeon diferentes concentraciones de glucosa- 6-P. Después de 8 min de incubación los oocitos recibieron [U-14C]glucosa (6 nmoles). Después de 12 min incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. El coeficiente de control para GS en la vía directa de síntesis de glicógeno fue igual a 0,01. Los coeficientes de control de las otras enzimas de la vía han sido previamente determinados en el laboratorio. Para hexoquinasa resultó ser de 0,6 y para fosfoglucomutasa de 0,2. Según el teorema de la suma, la suma de los coeficientes de control de todas las enzimas en una vía metabólica es igual a 1. Para el caso de la síntesis de glicógeno, la suma de los coeficientes de control de las enzimas en la vía directa en oocitos de anfibio fue 0,96. Esta es la primera vez que se determinan todos los coeficientes de control de una vía metabólica completa en un sistema in vivo. / Traditionally metabolic control and regulation has been studied by analysing the properties of the system components (enzymes, transporters and others) isolated from the whole system. During the last two decades, new proposals have emerged to analyze the behaviour of complete metabolic systems with a systemic approximation. Among them is the so called Metabolic Control Analysis. This approach considers the metabolic system as a whole; thus, the response of the original flux (δJ) to a small change in the activity of one enzyme (δe) will be then the consequence of all the variations of the intermediate concentrations. This response may be quantified by the flux control coefficient. The aim of this work was to determine the involvement of the enzymes UPD-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and glycogen synthase (GS) on the control of the flux through the direct path way for glycogen synthesis. Oocytes stage VI from C. caudiverbera were used as an in vivo experimental model. UGPase catalyzes the reaction UTP + glucose-1-phosphate ⇔ UDP-glucose + PPi. This is a reaction found in all the organisms so far studied. Besides its key function in the synthesis of disccharides and polysaccharides, the enzyme is essential in the synthesis of the carbohydrate part of glycolipids, glycoproteins and a variety of secondary metabolites. The activity of UGPase in crude extracts from C. caudiverbera oocytes was measured in the forward formation of UDP-glucose by capillary electrophoresis. Separations were performed in a non protected capillary of 57 cm long and 50 μm diameter, at a voltage of 22 kV. The signal of the nucleotide was determined at 254 nm. When the method was applied to measure the enzyme activity in crude extracts, a linear time curve was obtained during an appropiate experimental time. The reverse reaction was measured by the spectrophotometric method, coupling and quantitating the formation of NADPH at 340 nm. The endogenous activity of the enzyme in oocytes was about 12 mU/oocyte. The enzyme presents maximum activity at pH 8,5. In relation to the kinetic constants for the substrates of the reverse reaction, it was found that the enzyme has sigmoidal kinetics for pyrophosphate, with a K0,5 of about 460 μM and a nH higher than 2.0. The kinetic for UDP-glucose is hyperbolic, with a Kmapp of 50 μM. To determine the control coefficient of the enzyme, increasing quantities of pure commercial UGPase, were microinjected into the oocytes. Because the enzyme was not homogenous, it was purified by molecular exclusion. The microinjected enzyme inside the oocytes remained active during the time of the experiments. The control coefficient for UGPase in the direct path way for glycogen synthesis was 0.15 and 0,05 in the indirect way. Glycogen synthase has been traditionally considered the regulatory enzyme of glycogen synthesis, but studies in vivo have questioned this statement. There is no commercial enzyme available and it was not possible to obtain pure enzyme in the proper concentration for microinjection in our laboratory. As an alternative, activation of the enzyme by glucose-6-P was chosen. The experiments to determine the effect of glucose-6-P on GS were carried out by microinjecting into the oocytes different concentrations of glucose-6-P. After 8 min, microinjection of 3 mM UDP- [U-3H]glucose was performed. After 12 min incubation, the radioactivity on glycogen was measured. The maximum activation of the enzyme was between 2-3 times at 2 mM glucose-6-P. The effect of the ester was temporary, being maximum between 5 to 10 min. To determine the control coefficient into the cells, different concentrations of glucose-6-P were microinjected . After 12 minutes incubation, the radioactivity in glycogen was measured. The control coefficient for GS in the direct pathway for synthesis glycogen was 0.01. The control coefficient of the other enzymes of the pathway have been previously determined in the laboratory. For hexokinase it was 0.6 and for phosphoglucomutase, 0.2. According to the summation theorem, the sum of the control coefficients of all the enzymes involved in a metabolic path is equal to 1. In the case of glycogen synthesis pathway, the sum of the control coefficients of the enzymes in the direct route in amphibian oocytes was 0.96. This is the first time that all control coefficients for a complete metabolic pathway are determined in a system under in vivo conditions.

Memoria para optar al titulo profesional de Bioquímico / En la vía directa de la síntesis de glicógeno en oocitos de rana participan cuatro enzimas que son la hexoquinasa (HK), la fosfoglucomutasa (PGM), la UDP-glucosa pirofoforilasa (UDPGPPasa) y la glicógeno sintasa (GS). La fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2) cataliza la conversión reversible de glucosa-6-fosfato (glc-6-P) en glucosa-1-fosfato (glc-1-P). Por otro lado, la glicógeno sintasa (EC 2.4.1.11) cataliza la incorporación de glucosa en glicógeno, transfiriendo un residuo glucosilo desde UDP-glucosa a un extremo no reductor del glicógeno. El análisis del control metabólico (MCA) proporciona un enfoque particular para estudiar la regulación del metabolismo, ya que permite cuantificar el efecto que ejerce una enzima sobre el flujo de una vía metabólica, en términos de su coeficiente de control de flujo. En este trabajo se aplicaron los postulados del análisis del control metabólico para estudiar el control que ejercen la PGM y la GS sobre el flujo de la vía directa de la síntesis de glicógeno. La actividad de la PGM se midió espectrofotométricamente cuantificando el NADH producido al acoplar la reacción de la glucosa-6-P deshidrogenasa a la producción de glc-6-P. La actividad endógena de PGM en oocitos resultó ser igual a 41 ± 3,1 mU por oocito, medida entre los meses de septiembre y enero, y de 9,4 ± 0,93 mU por oocito, medida entre los meses de abril y agosto. Su actividad máxima es a pH 7,5. La cinética para el sustrato glc-1-P es hiperbólica, con una Km app de 0,16 mM. Para determinar el control que ejerce la PGM sobre el flujo metabólico de la vía directa de la síntesis de glicógeno, se aumentó la actividad intracelular de la PGM por medio de microinyección de enzima exógena a oocitos de Caudiverbera caudiverbera en estadio VI de desarrollo. El coeficiente de control medido para la PGM resultó ser igual a 0,19. Este valor indica que la PGM ejercería un bajo control sobre el flujo metabólico de la vía directa. La actividad de la GS se midió usando un radioensayo que cuantifica la incorporación de glucosa marcada en glicógeno a partir de UDP-glucosa radiactiva. La actividad endógena de la GS en oocitos resultó ser igual a 0,7 ± 0,03 mU por oocito, independiente de la época del año en que se mide. No se logró determinar el control que ejerce la GS sobre el flujo metabólico de la vía directa de síntesis de glicógeno. Ello debido a que, por una parte, no hay disponibilidad de la enzima comercial en el mercado. Por otro lado, tampoco fue posible tener la cantidad de enzima requerida al intentar purificarla a partir de músculo de rana. La purificación consistía en tres etapas, que incluían la obtención de un pellet rico en glicógeno, y dos cromatografias en DEAEcelulosa y Sephacryl S-200. La enzima se purificó 684 veces, pero no se logró concentrar lo suficiente como para poder ser microinyectada dentro del oocito y determinar así el coeficiente de control para la GS / In amphibian oocytes, the direct pathway for glycogen synthesis includes four enzymes which are hexokinase (HK), phosphoglucomutase (PGM), UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) and glycogen synthase (GS). Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) catalyzes the reversible conversion of glucose-6-phosphate (glc-6-P) into glucose-1-phosphate (glc-1-P). Glycogen synthase (EC 2.4.1.11) catalyzes the addition of a glucose residue to the non-reducing end of glycogen, using UDP-glucose as the substrate. Metabolic Control Analysis (MCA) provides a singular vision to the study of metabolic control. It allows quantification of the effect that a particular enzyme exerts upon the flux through the pathway in terms of the flux control coefficient. In this work we have applied MCA in order to study the control that PGM and GS exert over the flux in the direct pathway for glycogen synthesis. PGM activity was spectrophotometrically measured by quantifying NADH produced, in a coupled reaction catalyzed by glucose-6-P dehydrogenase. The endogenous PGM activity measured in the oocytes between september and january was 41 ± 3.1 mU per oocyte, while between april and august it was 9.4 ± 0.93 mU per oocyte. The maximal activity was found at pH 7.5. The kinetic for glc-1-P was hyperbolic, with a Km app of 0.16 mM. In order to determine the control that PGM exerts over the metabolic flux in the direct pathway for glycogen synthesis, we increased PGM activity by microinjecting exogenous enzyme into Caudiverbera caudiverbera stage VI oocytes. A control coefficient value of 0.19 was found for PGM. This value indicates that PGM exerts a low control over the metabolic flux in the direct pathway for glycogen synthesis. GS activity was measured using a radioactive assay that quantifies the incorporation of glucose into glycogen, using radiolabelled UDP-glucose as the substrate. The endogenous activity found for GS in the oocytes was about 0.7 ± 0.03 mU per oocyte, irrespective of the season of the year. To determine the control that GS exerts over the metabolic flux in the direct pathway for glycogen synthesis, and due to the lack of a pure commercial enzyme, we intended to purify the enzyme from frog´s muscle. The purification procedure involved three steps, beginning with the obtention of a glycogen-rich pellet, and continuing with a DEAE-cellulose and Sephacryl S-200 chromatographies. We obtained an enzyme that was purified 684 times, but efforts to concentrate the enzyme to obtain the amount required for microinjection were unsuccesful