Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar
al grado académico de Doctor en Farmacología / El trasplante de células troncales mesenquimáticas humanas (hMSC) derivadas de
médula ósea ha mostrado ser terapéutico en patologías como osteogénesis
imperfecta, reacción del injerto contra huésped e infarto agudo al miocardio.
Además, ha permitido recuperar las funciones motoras y sensoriales en animales
con infarto cerebral, la producción de insulina en animales diabéticos y evitar la
muerte neuronal en animales con enfermedad de Parkinson. En todas estas
patologías el daño tisular se vincula a estrés oxidativo (EO).
A la fecha, los mecanismos propuestos para explicar los efectos terapéuticos de las
MSC son: i) diferenciación a células del parénquima, ii) producción de factores
tróficos que promueven proliferación y diferenciación de progenitores locales,
iii) neovascularización, iv) inmunomodulación. Nosotros proponemos que las hMSC
además actuarían como “atrapadores” de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o
de nitrógeno (RNS), protegiendo así a las células del parénquima del daño oxidativo.
Para evaluar esta hipótesis hemos caracterizado a las hMSC con respecto a su
capacidad de manejar el EO. Primero, se determinó si las hMSC resisten a la
muerte inducida por la exposición a ROS (H2O2), a RNS (SNAP) o a ambas (SIN-1)
y se determinaron los niveles intracelulares de ROS/RNS cuando las células son
expuestas a SIN-1. Luego, se determinaron las herramientas que las hMSC poseen
para depurar las especies reactivas. Para ello, se cuantificó la expresión (RT-PCR
tiempo real) y actividad (espectrofotometría) de enzimas asociadas a la eliminación
de ROS y/o RNS: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión
peroxidasa (GPX1). Además, se evaluaron los niveles basales de glutatión total
(GSx). Finalmente, se determinó cual es la contribución del GSx dentro de los
mecanismos asociados al manejo del EO que poseen las hMSC. Para ello se evaluó la resistencia a la muerte inducida por la exposición a ROS y/o RNS de
hMSC a las cuales se les depletó de GSx.
Los resultados de esta tesis muestran que las hMSC son significativamente más
resistentes a la muerte inducida por ROS y/o RNS que las células INS-1 (modelo de
células susceptibles al EO) y tan resistentes como los fibroblastos de piel (modelo
de células resistentes al EO). Las hMSC constitutivamente expresan todas las
enzimas estudiadas y tienen altos niveles de GSx. Esto se correlaciona con una
baja acumulación intracelular de ROS/RNS y una baja susceptibilidad a la muerte
inducida por EO. Dentro de las herramientas para eliminar ROS y/o RNS
encontrados en las hMSC, el GSx es central de vital importancia, ya que cuando la
producción de éste es inhibida, las hMSC pierden su capacidad para resistir a la
muerte inducida por EO.
En conjunto estos resultados permiten concluir que, al menos in vitro, las hMSC
manejan eficientemente el EO. De mantenerse esta propiedad in vivo, las hMSC
contribuirían a la regeneración tisular disminuyendo el daño producido por el EO / Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (hMSC) transplantation is
therapeutic for osteogenesis imperfecta, graft versus host disease, and acute
myocardial infarction. Pre-clinical studies have shown that exogenous hMSC induces
recovery of motor and sensory functions after stroke, preventing neuronal death in
models of Parkinson's and promoting hyperglycemia reversion in diabetic rodents. With
these pathologies tissue damage is associated to oxidative stress (OS).
The mechanisms behind therapeutic effects of MSC are: i) differentiation into
parenchymal cells, ii) production of trophic factors that promote proliferation and
differentiation of local stem cells, iii) neovascularization, and iv) immuno modulation.
Here we propose that hMSC also might act as reactive oxygen species (ROS)
and/or reactive nitrogen species (RNS) scavenges. Hence, parenchymal cells could
be protected from oxidative damage and death.
To test this hypothesis we characterized the potential of hMSC to manage OS. First,
it was determined hMSC susceptibility to ROS (H2O2), RNS (SNAP) or both (SIN-1)
induced death. Also, intracellular levels of ROS/RNS were determined in cells
exposed to SIN-1. Then we identified hMSC tools to eliminate the reactive species.
To do this, gene expression coding enzymes associated to ROS and/or RNS
elimination (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione
peroxidase (GPX1)) were quantified by real time RT-PCR and enzymatic activity
was measured by spectrophotometry. In addition, baseline levels of total glutathione
(GSx) were evaluated. Finally we determined the importance of the GSx for hMSC
tools associated with the management of the OS. To do this, we evaluated hMSC
without GSx resistance to ROS and/or RNS induced death. Our results of this thesis show that hMSC are significantly more resistant to death
induced by ROS and/or RNS than INS-1 cell model (susceptible to OS) and stronger
as skin fibroblasts (cell model resistant to OS). hMSC constitutively express all the
enzymes studied and have high levels of GSx. This correlates with a low
accumulation of intracellular ROS/RNS and low susceptibility to death induced by
OS. Among the tools to eliminate ROS and/or RNS found in hMSC, GSx is critical,
because when this production is inhibited hMSC lose their resistance to the death
induced by OS.
Taken together these results allow to conclude that, at least in vitro, hMSC efficiently
managed the OS. If this property exists in vivo, hMSC could contributed to tissue
regeneration and decrease of the damage caused by OS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105190 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Valle Prieto, María Araceli |
| Contributors | Conget Molina, Paulette Andrea, Israel Jacard, Yedy, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Escuela de Graduados |
| Publisher | Universidad de Chile, CyberDocs |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Valle Prieto, María Araceli |
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