Memoria para optar el título de Bioquímico / El hongo filamentoso Sphaceloma rhois sintetiza giberelinas, principalmentela giberelina A4, metabolitos secundarios diterpénicos activos como fitohormonas.En esta memoria de título se caracterizó la biosíntesis de giberelinas por estehongo a nivel de las reacciones químicas, de las enzimas que las catalizan y de suregulación. Mediante la administración de precursores marcados con 14C a cultivoslíquidos de S. rhois, se determinó la secuencia de reacciones de oxidación de labiosíntesis de GA4a partir del ácido ent-kaurenoico. Los precursores previos alGA12aldehído fueron metabolizados completamente por cultivos líquidos delhongo y se transformaron en los productos 3β-hidroxilados [14C]GA14(giberelinade 20 carbonos) y [14C]GA4(giberelina 19, γ10 lactónica de 19 carbonos). Además,al realizar incubaciones a tiempos cortos, se detectaron los intermediarios ácidoent-7α-hidroxi[14C]kaurenoico y el [14C]GA12aldehído. No se detectaron productosno hidroxilados. La giberelina [14C]GA14agregada a los cultivos fue convertida en[14C]GA4, el producto final de la secuencia. Todo esto permite concluir que el ácidoent 7α-hidroxikaurenoico, el GA12aldehído y el GA14son intermediarios en lasíntesis de GA4. Todos los intermediarios posteriores al GA12aldehído son 3β-hidroxilados debido a que la reacción de hidroxilación en C3 ocurre sobre esteprecursor. No se forman productos no hidroxilados a partir de GA12aldehído, porlo tanto, en este sistema está presente exclusivamente la vía 3β-hidroxilada. Lareacción de oxidación del C20 hasta CO2que forma el producto final GA4, fueinvestigada en detalle a partir de [14C]GA12, encontrándose que los cultivos delhongo metabolizan este sustrato para dar el producto lactónico [14C]GA9(derivadode la oxidación a CO2) junto con el producto C20 carboxilato [14C]GA25. Además,se forma el intermediario C20 aldehído, [14C]GA24, que sería el precursor delproducto lactónico y del producto C20 carboxilato. El nitrato de amonio o laglutamina, presentes en el medio de cultivo, reducen 3 veces la velocidad deoxidación del ácido ent-7α-hidroxikaurenoico, lo que sugiere que la biosíntesis deGAs podría ser regulada por compuestos nitrogenados en este microorganismo.
En fracciones microsomales obtenidas del micelio se determinó el requerimiento de cofactores de las reacciones de oxidación del ácido ent- [14C]kaurenoico hasta [14C]GA14, las que dependen en forma absoluta de NADPH, FAD y O2. Esto, junto con la demostración en los cultivos de las reacciones de síntesis de [14C]kaurenolidos y ácidos [14C]fujenoicos a partir de ácido ent- [14C]kauradienoico y de ácido ent-6α,7α-dihidroxi[14C]kaurenoico, indica que la síntesis de [14C]GA14es catalizada por una o más monooxigenasas P450.
La secuencia biosintética de GA4encontrada en S. rhois es similar a la descrita en Fusarium fujikuroi que produce principalmente GA3y concentraciones menores GA4y GA7. Las rutas de biosíntesis son similares en cuanto a la reacción de 3β-hidroxilación (que ocurre en una etapa temprana), en los intermediarios de la secuencia y en la naturaleza de las oxidasas. Por otra parte, esta secuencia difiere de la del otro hongo productor de giberelinas, Phaeosphaeria sp., que produce GA4y GA1a través de intermediarios no hidroxilados / The filamentous fungus Sphaceloma rhois synthesizes gibberellins, mainly GA4, diterpenoid secondary metabolites active as phytohormones. In this work, gibberellin biosynthesis by this fungus was characterized at the chemical, enzymatic and regulatory levels. The oxidative reaction sequence of GA4 biosynthesis from ent-kaurenoic acid was determined by adding 14C-labeled precursors to liquid cultures of S. rhois. These were completely metabolized and transformed into the 3-hydroxylated products [14C]GA14 (C20 gibberellin) and [14C]GA4 (C19 lactonic gibberellin). Furthermore, in short term incubations ent-7α-hydroxy[14C]kaurenoic acid and [14C]GA12 aldehyde were detected as intermediates. Non-hydroxylated products were not detected in any incubation. [14C]GA14 added to the cultures was converted into [14C]GA4, the final product of the sequence. This indicates that ent-7α-hydroxykaurenoic acid, GA12 aldehyde and GA14 are intermediates in GA4 synthesis. All intermediates after GA12 aldehyde are 3-hydroxylated due to 3-hydroxylation reaction over this precursor. Non-hydroxylated products are not formed from GA12 aldehyde, thus, the 3-hydroxylated pathway is present exclusively in this fungal system. C20 oxidation to CO2 which gives the lactonic C19 product, was investigated in detail from [14C]GA12. S. rhois cultures metabolized this substrate to the lactonic product [14C]GA9 (derived from oxidation to CO2) together with the C20 carboxylic acid product [14C]GA25. In addition the C20 aldehyde intermediate, [14C]GA24, accumulated, which would be precursor of both the lactonic and C20-carboxylic acid products. Ammonium nitrate or glutamine present in the cultures reduced by a factor of 3 the oxidation rate of ent-7α-hydroxykaurenoic acid, suggesting that GA biosynthesis in S. rhois would be regulated by nitrogen compounds.
The cofactor requirement of oxidation reactions involved in [14C]GA14 synthesis from ent-[14C]kaurenoic acid was determined in mycelial microsomal fractions. An absolute requirement of NADPH, FAD and O2 was found for these steps, which together with the demonstration of [14C]kaurenolide and [14C]fujenoic acid synthesis from ent-[14C]kauradienoic acid or ent-6α,7α-dihydroxy[14C]kaurenoic acid, indicate that GA14 synthesis is catalyzed by a P450 monooxygenase in S. rhois.
The biosynthetic pathway to GA4 in S. rhois is similar to that described in Fusarium fujikuroi, a GA3, GA4 and GA7 producing fungus. Both microorganisms utilize similar intermediates and the same kind of oxidases. In contrast, this sequence differ from that found in Phaeosphaeria sp. which produces GA4 and GA1 through non-hydroxylated intermediates
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/105689 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Fuentes Azócar, Paula Andrea |
| Contributors | Valenzuela Pedevila, María Antonieta, Rojas Garrido, María Cecilia, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular |
| Publisher | Universidad de Chile, Programa Cybertesis |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Fuentes Azócar, Paula Andrea |
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