Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y optar al título de Bioquímico / Las hemocianinas de moluscos son enormes glicoproteínas que al ser inoculadas en mamíferos, generan una potente respuesta inmune del tipo Th1, caracterizada por la secreción de IFN-y. Es así que se han usado como carrier en el desarrollo de anticuerpos contra haptenos, como carrier/adyuvante en vacunas terapéuticas contra patógenos y cáncer y además, como inmunoestimulante no específico en la inmunoterapia del carcinoma superficial de vejiga. Sin embargo, los mecanismos inmunológicos involucrados en las etapas tempranas de la respuesta inmune anti-hemocianina, conducentes a sus notables propiedades inmunoestimulantes, son muy poco conocidos. Es así que ha sido escasamente abordado su efecto sobre las redes de comunicación coordinadas por citoquinas, las proteínas que median las interacciones entre las células del sistema inmune. Esta información, ampliará no solo el conocimiento básico para comprender los efectos inmunoestimulantes de las hemocianinas en mamíferos, sino que también contribuirá a nuevas aplicaciones.
En esta tesis se propuso estudiar el efecto de tres hemocianinas sobre macrófagos peritoneales murinos, como modelo para entender la respuesta inmune innata que inducen en dichas células presentadoras de antígeno. Específicamente, se estudiaron la hemocianina clásica, originaria de California y conocida como KLH, obtenida de Megathura crenulata y dos descubiertas más recientemente que corresponde a CCH de Concholepas concholepas y FLH de Fissurella latimarginata, especies que habitan las costas de nuestro país. Se propuso que las hemocianinas al ser incorporadas por las células presentadoras de antígenos, inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias, un evento fundamental para dar el inicio a una respuesta inmune. Para demostrarlo, cultivos in vitro de macrófagos peritoneales murinos, previamente caracterizados morfológicamente, fenotípicamente (F4/80+) y funcionalmente, fueron incubados con las distintas hemocianinas en concentraciones de hasta 1 mg/ml; LPS y medio de cultivo fueron usados como control positivo y negativo, respectivamente. Posteriormente, se estudió la correlación entre los niveles de mRNA y los niveles de proteína de un panel de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias mediante dos tipos de PCR y ELISA, respectivamente.
Los principales resultados demuestran que: 1. Las hemocianinas fueron fagocitadas por los macrófagos peritoneales cultivados in vitro. Sin embargo, FLH y KLH estimularon más tempranamente que CCH el aumento en la expresión de quimioquinas claves en la extravasación de leucocitos, tales como MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) y LIX (CXCL-5), las cuales son indicativas de un proceso inflamatorio agudo. 2. Las hemocianinas estimularon la expresión de IL-6, IL-12p40 y TNF-α en distintos tiempos e intensidades, como indican los resultados de RT-qPCR y ELISA, sugiriendo la inducción de mecanismos de señalización diferentes, cuya explicación es atribuible a las diferencias estructurales que presentan las hemocianinas entre ellas y especialmente, en aquellas que dicen relación con su composición de oligosacáridos. 3. Las hemocianinas muestran la inducción de un perfil inmunológico Th1 marcado, al mantener reguladas a la baja citoquinas claves de la respuesta Th2, como son IL-4, IL-5, IL-13, TGF-ß2. Finalmente, los resultados presentados en esta tesis permiten concluir que los macrófagos también participan en los mecanismos inmunológicos tempranos que acompañan el reconocimiento de las hemocianinas, induciendo un ambiente proinflamatorio que puede explicar sus notables propiedades inmunomoduladoras en los mamíferos / Molluskan hemocyanins are huge glycoproteinscapable of induce a potent Th1-dominant immune response, characterized by the secretion of IFN-y, when are inoculated in mammals. By this reason, they have been used as a carrier protein in the development of antibodies against pathogens and cancers and also, as non-specific immunostimulant in the immunotherapy of superficial bladder cancer. However, the immunological mechanisms involved in the early phases of the anti-hemocyanin immune response, that leads to its remarkable immunostimulatoryt effects, are scarcely known. Thus, it has been poorly addressed their effects on the communication network coordinated by cytokines, the proteins which mediate interactions between cells from the immune system. This information will allow expand the basic comprehension to understand its immunostimulatory effects, but also will contribute to new applications.
In this thesis, we proposed to examine the effects of three hemocyanins on murine peritoneal macrophages, as a model for understanding the earliest immune responses induced by these antigen presenting cells (APC). Specifically, we studied the classical hemocyanin, native from California and obtained from Megathura crenulata, known as KLH and two recently discovered hemocyanins, CCH collected from Concholepas concholepas and FLH from Fissurella latimarginata, both species natives of our coasts. It was proposed that once hemocyanins are incorporated by APC, would induce the expression of proinflammatory cytokines, a key event in the initiation of an immune response. To demostrate this, in vitro cultures of murine peritoneal macrophages, previously characterized morphologically, phenotypically (F4/80+) and functionally, were incubated with hemocyanins in concentrations up to 1 mg/ml for different times; as positive and negative control, LPS and culture médium were used, respectively. Subsequently, we studied the correlation between mRNA and protein levels from a panel of proinflammatory cytokines and chemokines using two types of PCR and ELISA, respectively.
The main results show that: 1. Hemocyanins were endocyted by peritoneal macrophages cultured in vitro, but only FLH and KLH and not CCH can induced an increased in the expression of key chemokines related to leukocyte extravasation, such as MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) and LIX (CXCL-5), wich are indicative of an acute inflammatory process. 2. Hemocyanins simulated the expression of IL-6, IL-12p40and TNF-α at different times and intensities, as indicated by the results of RT-qPCR and ELISA, suggesting different signaling pathways of induction, which can be explained by strutural differences between them, and specially those concerns to their oligosaccharides composition. 3. Hemocyanins showed induction of a Th1-dominant immune profile, maintaining downregulated key Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-13 and TGF-ß2. Finally, the results presented in this thesis, allow to conclude that macrophages are involved in the early phases of immunes recognition of hemocyanins, inducing a proinflammatory milieu that may explain its enhanced immunomodulatory properties in mammals / Fondecyt, Biosonda, Fucited
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/138352 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Zhong Hu, Ta Ying |
| Contributors | Becker Contreras, María Inés, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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