Tesis presentada para optar al grado de Doctor en Bioquímica / El Síndrome de Down se define como un desorden del desarrollo
causado por la presencia de una copia extra del cromosoma 21, que va
acompañado de anomalías multisistémicas principalmente a nivel del sistema
nervioso central, generando una discapacidad cognitiva. Se ha descrito que el
gen dscam, que codifica para la Molécula de Adhesión Celular del Síndrome de
Down (DSCAM), presente en el cromosoma extra, actúa como una molécula de
adhesión en el establecimiento y maduración de sinapsis y formación de
nuevas redes neuronales a través de quinasas relacionadas directamente en
procesos fisiológicos neuronales denominadas PAKs. Estas juegan un rol
central en los mecanismos de señalización celular mediante LIMK1, la cual a su
vez regula a Cofilina que reordenan el citoesqueleto en particular los filamentos
de actina. En esta tesis se trabajó con líneas neuronales trisómicas de corteza
cerebral de fetos de ratones Ts16, llamada CTb, y líneas control derivadas de
un ratón normal de la misma camada llamada CNh, donde se desconocía la
relación DSCAM-PAK sobre parámetros morfológicos neuronales. En este
trabajo hipotetizamos que el aumento en la expresión de la proteína DSCAM en
la línea celular CTb, en comparación con la línea normal CNh, produce una
hiperactivación de PAK y sus efectores río abajo en la vía de señalización, lo
que se traduce en una disminución del número y longitud de neuritas.
El objetivo general fue determinar los niveles de expresión del gen
dscam y su acción sobre la activación de PAK, analizando parámetros
morfológicos en la línea neuronal CTb, utilizando como control a la línea CNh.
Los objetivos específicos fueron: 1) Cuantificar los niveles de expresión de
DSCAM. 2) Estudiar parámetros morfológicos, número y longitud de neuritas.
3) Determinar el nivel de expresión de las proteínas PAK y su estado de
activación. 4) Determinar la activación de blancos moleculares río abajo de la
vía PAK como LIMK1 y Cofilina.
Se encontró en la línea CTb: 1) Un aumento en la expresión de DSCAM
en comparación a la línea CNh, en condiciones basales de proliferación y
diferenciación celular. 2) Menor complejidad neuronal, en cuanto al número y
largo de sus neuritas en comparación a la línea normal. El knockdown para
DSCAM en la línea CTb revirtió de manera parcial el fenotipo normal observado
en CNh. 3) Las quinasas PAK se expresan de manera similar en ambas líneas
celulares, con una mayor activación temporal de PAK1 en la línea CTb con
respecto a CNh, tras activar DSCAM a través de su ligando específico, Netrina.
La reducción de los niveles de DSCAM en la línea CTb a niveles comparables
a aquellos de CNh, revierten la mayor activación de PAK1 inducida por
Netrina. 4) Al igual que la activación temporal de LIMK1 y Cofilina.
En conclusión, en esta tesis se demuestra que DSCAM se encuentra
sobrexpresado en la condición trisómica, lo que lleva a una mayor sensibilidad
de efectores transduccionales de la vía PAK, traduciéndose finalmente en una
menor capacidad de extensión de procesos. Por lo tanto, en este trabajo
identificamos un circuito regulador clave dentro de la patología del Síndrome de
Down, donde PAK juega un rol relevante como potencial blanco terapéutico
específico / Down syndrome is defined as a developmental disorder caused by the
presence of an extra copy of chromosome 21, which is accompanied by
multisystem anomalies mainly in the central nervous system, which translates
into a feature cognitive impairment. A gene that has many implications for
development is dscam, which encodes for the Down Syndrome Cell Adhesion
Molecule (DSCAM), which is present in the triplicated chromosome and acts as
an adhesion molecule in the establishment and maturation of synapses,
formation of new neural networks through kinases called p21-activated kinases
(PAKs). PAKs play a central role in cell signaling mechanisms by LIMK1, which
in turn regulates Cofilin, that reorganizes the cytoskeleton in particular by
governing actin filament dynamics. In this thesis, we worked with trisomic neural
lines from cerebral cortex of fetal Ts16 mice, called CTb, and control lines
derived from the same tissue of a euploid littermate called CNh, where DSCAMPAK
relationship on neural morphological parameters was unknown. In this
work we hypothesized that the increased expression of DSCAM protein in the
cell line CTb, compared to that of the normal line CNh, produces a
hyperactivation of PAK and its effectors downstream in the signaling pathway,
resulting in a decreased number and length of neurites.
The overall objective was focused on determining the expression levels
of dscam gene and its effect on the activation of PAK, in terms of morphological
parameters regulating the latter, in neuronal line CTb using as controls CNh
line. The specific objectives were: 1) Quantification of DSCAM expression
levels. 2) Study of morphological parameters, number and length of neurites. 3)
Determination of the expression levels PAK proteins and their activation state;
and 4) to determine the activation of downstream molecular targets of the PAK
pathway, LIMK1 and Cofilin.
We found in line CTb: 1) An increase in the expression of DSCAM,
compared to the CNh line at both basal proliferation and differentiation
conditions. 2) Exhibits lower neuronal complexity by Sholl analysis, expressed
in a reduced number as well as length of their neurites compared to the normal
line. DSCAM knockdown, partially reversed to the normal phenotype observed
in CNh cells. 3) PAK kinases were expressed similarly in both cell lines, but
there is a greater temporal PAK1 activation in CTb line compared to on CNh
cells, in response to DSCAM activation by its specific ligand Netrin. Upon
knockdown-induced reduction of DSCAM levels in the CTb to levels comparable
to those of CNh cells, the Netrin-induced activity of PAK1 is reduced to levels
similar to those of CNh. 4) Similarly to the temporal activation way of LIMK1 and
Cofilin.
In conclusion, this thesis shows that DSCAM is overexpressed in the
trisomic condition, which in turn leads to an increased translational activation of
effectors of PAK pathway, finally resulting in a lower capacity to extend
processes. Therefore, we have identified a specific key regulator circuit in Down
Syndrome pathology, where PAK could play an important role as a potential
therapeutic target / Conicyt; Fondecyt / 31 de diciembre de 2017
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/140708 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Pérez Núñez, Ramón Daniel |
| Contributors | Caviedes Fernández, Pablo, Barnier, Jean-Vianney |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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