Colorectal cancer is the third most common cancer type in the world with a mortality rate of around 2000 people in Sweden, year 2018. Women tend to have a lower risk of developing and progressing colorectal cancer, specifically premenopausal women. This indicates that Estrogen plays an important role in protecting from colorectal cancer. Estrogen has been shown to both inhibit colon cancer cell proliferation and stimulate cell apoptosis through several pathways. Estrogen signaling mediates through the estrogen receptors (ER) ERα, ERβ and GPER1. ERβ has been linked to suppression of colorectal cancer tumors but is downregulated in colon cancer tissue. The trans-membrane receptor GPER1 has also been found present in colorectal cells, however its effect on the CRC progression is still debated. It has been shown to both contribute to cell proliferation and the downregulation of cell proliferation, depending on the cell conditions. The location of the GPER1 receptor plays an important role to understand the signaling pathways and how the receptor could be a potential therapeutic target for cancer treatment. The localization of the receptor affects all types of molecular interactions with the protein and decides the cellular environment of the signaling protein. The location of GPER1 is still debatable and the localization has not been confirmed with a validated primary antibody. Anti-GPR30 703480 and three anti-FLAG (F7425, F1804, 14793) primary antibodies were used for detection on HT29, HCT116 and SiHa cells. Immunofluorescence (IF) followed by visualization with a confocal fluorescence microscope was used to localize the receptor tagged with a FLAG (Flag-GPER1). Western Blot (WB) and qPCR were used to validate the primary antibodies. The results obtained with the antibody anti-GPR30 show a signal mainly limited to the cytoplasm of the cells. However, the negative control SiHa presented a similar fluorescent signal while a low expression of GPER1 in WB and qPCR were measured, which indicates that the signal detected with the anti-GPR30 is not specific in IF. The anti-FLAG antibodies did not give sufficient signal detection for the FLAG protein on the different cellular populations. Further tests with different antibody dilutions for anti-GPR30 are required and new anti-Flag antibodies should be tested for IF detection. / Kolorektalcancer är den tredje vanligaste cancertypen i världen och hade år 2020 en dödlighet på omkring 2000 personer i Sverige. Risken att drabbas och utveckla kolorektalcancer är lägre för kvinnor, specifikt för kvinnor före klimakteriet. Detta indikerar att hormonet östrogen har en betydande roll vid utveckling av kolorektalcancer. Östrogen har kopplats till hämmande av cellspridning samt stimulering av celldöd vid koloncancer. Östrogen förmedlas via östrogenreceptorerna ERα, ERβ och GPER1. ERβ har kopplats till hämmande av kolorektalcancertumörer, men receptorns uttryck har samtidigt studerats minska då cancertumörerna ökar. Östrogenreceptorn GPER1 uttrycks även i kolorektalcancervävnad, men forskare har tidigare haft en delad syn på receptorns påverkan på cancerns utveckling då ett högt uttryck av receptorn både bidragit till ökad cellväxt och nedreglering av celltillväxt, beroende på cellens tillstånd. GPER1 receptorns cellulära placering har en viktig påverkan på receptorns signalvägar och är viktig för att förstå hur receptorn kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för cancerbehandling. Placeringen av receptorn påverkar alla molekylara interaktioner med proteinet och påverkar den cellulära miljön hos proteinet. Receptorns placering är ännu inte klarlagd och lokaliseringen har ännu inte studerats med en validerad antikropp. Immunfluorescens (IF) användes för att lokalisera receptorn. Western Blot (WB) och qPCR användas för att validera de primära antikropparna som användes vid IF. Anti- GPR30 703 480 och tre anti-FLAG (F7425, F1804, 14793) antikroppar användes för att studera cellinjerna HT29 och HCT116. Resultatet var att receptorn huvudsakligen är placerad omkring cellkärnan med en majoritet i cytoplasman när antikroppen anti-GPR30 användes. Samtidigt detekterades receptorn i den negativa cellinjen SiHa vilket kan indikera att receptorn inte är specifik för GPER1 vid användning av IF. Cellinjen SiHa innehåller en låg mängd av proteinet GPER1. Ytterligare studier krävs för att validera antikroppen. Framtida projekt kan använda en lägre koncentrationen på den primära antikroppen samt att använda en ny detergent för att minska eventuella ospecifika bindningar. Samtliga anti-FLAG antikroppar ansågs ej lämpliga vid IF användning. Samtidigt krävs det ytterligare studier för att fastställa detta. IF resultatet från mage, lunga och levervävnaderna vid användning av anti-GPER1 indikerar att antikroppen binder in specifikt till vävnaderna. Skillnaden mellan IF resultatet från vävnader och celler kan bero på olika fixeringsmetoder.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-322707 |
| Date | January 2022 |
| Creators | Lundvall, Malin |
| Publisher | KTH, Skolan för kemi, bioteknologi och hälsa (CBH) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds