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Colorectal cancer is the third most common cancer type in the world with a mortality rate of around 2000 people in Sweden, year 2018. Women tend to have a lower risk of developing and progressing colorectal cancer, specifically premenopausal women. This indicates that Estrogen plays an important role in protecting from colorectal cancer. Estrogen has been shown to both inhibit colon cancer cell proliferation and stimulate cell apoptosis through several pathways. Estrogen signaling mediates through the estrogen receptors (ER) ERα, ERβ and GPER1. ERβ has been linked to suppression of colorectal cancer tumors but is downregulated in colon cancer tissue. The trans-membrane receptor GPER1 has also been found present in colorectal cells, however its effect on the CRC progression is still debated. It has been shown to both contribute to cell proliferation and the downregulation of cell proliferation, depending on the cell conditions. The location of the GPER1 receptor plays an important role to understand the signaling pathways and how the receptor could be a potential therapeutic target for cancer treatment. The localization of the receptor affects all types of molecular interactions with the protein and decides the cellular environment of the signaling protein. The location of GPER1 is still debatable and the localization has not been confirmed with a validated primary antibody. Anti-GPR30 703480 and three anti-FLAG (F7425, F1804, 14793) primary antibodies were used for detection on HT29, HCT116 and SiHa cells. Immunofluorescence (IF) followed by visualization with a confocal fluorescence microscope was used to localize the receptor tagged with a FLAG (Flag-GPER1). Western Blot (WB) and qPCR were used to validate the primary antibodies. The results obtained with the antibody anti-GPR30 show a signal mainly limited to the cytoplasm of the cells. However, the negative control SiHa presented a similar fluorescent signal while a low expression of GPER1 in WB and qPCR were measured, which indicates that the signal detected with the anti-GPR30 is not specific in IF. The anti-FLAG antibodies did not give sufficient signal detection for the FLAG protein on the different cellular populations. Further tests with different antibody dilutions for anti-GPR30 are required and new anti-Flag antibodies should be tested for IF detection. / Kolorektalcancer är den tredje vanligaste cancertypen i världen och hade år 2020 en dödlighet på omkring 2000 personer i Sverige. Risken att drabbas och utveckla kolorektalcancer är lägre för kvinnor, specifikt för kvinnor före klimakteriet. Detta indikerar att hormonet östrogen har en betydande roll vid utveckling av kolorektalcancer. Östrogen har kopplats till hämmande av cellspridning samt stimulering av celldöd vid koloncancer. Östrogen förmedlas via östrogenreceptorerna ERα, ERβ och GPER1. ERβ har kopplats till hämmande av kolorektalcancertumörer, men receptorns uttryck har samtidigt studerats minska då cancertumörerna ökar. Östrogenreceptorn GPER1 uttrycks även i kolorektalcancervävnad, men forskare har tidigare haft en delad syn på receptorns påverkan på cancerns utveckling då ett högt uttryck av receptorn både bidragit till ökad cellväxt och nedreglering av celltillväxt, beroende på cellens tillstånd. GPER1 receptorns cellulära placering har en viktig påverkan på receptorns signalvägar och är viktig för att förstå hur receptorn kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål för cancerbehandling. Placeringen av receptorn påverkar alla molekylara interaktioner med proteinet och påverkar den cellulära miljön hos proteinet. Receptorns placering är ännu inte klarlagd och lokaliseringen har ännu inte studerats med en validerad antikropp. Immunfluorescens (IF) användes för att lokalisera receptorn. Western Blot (WB) och qPCR användas för att validera de primära antikropparna som användes vid IF. Anti- GPR30 703 480 och tre anti-FLAG (F7425, F1804, 14793) antikroppar användes för att studera cellinjerna HT29 och HCT116. Resultatet var att receptorn huvudsakligen är placerad omkring cellkärnan med en majoritet i cytoplasman när antikroppen anti-GPR30 användes. Samtidigt detekterades receptorn i den negativa cellinjen SiHa vilket kan indikera att receptorn inte är specifik för GPER1 vid användning av IF. Cellinjen SiHa innehåller en låg mängd av proteinet GPER1. Ytterligare studier krävs för att validera antikroppen. Framtida projekt kan använda en lägre koncentrationen på den primära antikroppen samt att använda en ny detergent för att minska eventuella ospecifika bindningar. Samtliga anti-FLAG antikroppar ansågs ej lämpliga vid IF användning. Samtidigt krävs det ytterligare studier för att fastställa detta. IF resultatet från mage, lunga och levervävnaderna vid användning av anti-GPER1 indikerar att antikroppen binder in specifikt till vävnaderna. Skillnaden mellan IF resultatet från vävnader och celler kan bero på olika fixeringsmetoder.

Define-se como bócio um aumento benigno de volume da tireoide não relacionado a doenças autoimunes, infiltrativas ou neoplasias. A causa mais comum é carência de iodo, no entanto, mesmo em áreas com suficiência de iodo, os bócios ocorrem, por mecanismos desconhecidos, e são mais comuns nas mulheres. A presença dos receptores clássicos do estrogênio (ERα e ERβ) no tecido tireoidiano já foi descrita, bem como o efeito direto do estradiol na glândula. Porém, a presença do receptor de estrogênio acoplado a proteína G (GPER1) em bócio ainda não foi descrita. Esse estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica e protéica de GPER1 em tecido de tireoide humano normal e bócio, e estimar a prevalência de expressão gênica ou protéica do GPER1 nesses tecidos. As metodologias utilizadas para avaliar a expressão gênica e protéica do GPER1 foram a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real a partir de Transcrição Reversa (RT-qPCR) e o Western Blot, respectivamente. A fim de realizar uma acurada comparação dos níveis de mRNA em amostras de tecido de tireoide normal e bócio, realizou-se a escolha de um gene de referência para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. Dentre os seis genes avaliados, a beta-actina foi o mais estável, calculado pelo programa NormFinder, sendo adequada sua utilização como gene de referência, a fim de minimizar o efeito das variações experimentais inerentes ao método. Na análise da expressão gênica, o mRNA do GPER1 estava presente em todas as amostras avaliadas (normal=16 e bócio=19), com um nível de expressão maior em tecido normal de tireoide, quando comparado ao bócio (p=0,01). Na análise da expressão protéica, em todas as amostras de tecido normal avaliadas (n=15), verificou-se a presença da proteína do GPER1 (banda com peso molecular ~38 KDa). Porém, em 28% das amostras de bócio (n=13), não foi identificada a expressão protéica desse receptor. Além disso, os níveis de proteína do GPER1 foram significativamente menores no bócio, quando comparados aos do tecido normal de tireoide (p=0,002). Esses dados sugerem que o GPER1 está presente em células normais na tireoide, e que, o desenvolvimento do bócio pode desencadear, ou ser consequência, da perda de expressão desse receptor. / Goiter is an enlarged thyroid not related to autoimmune, infiltrative or neoplastic diseases. Iodine deficiency is its most common cause. But, even in areas with sufficient iodine, the goiter occurs by unknown mechanisms, and it is more frequent in women. The presence of classical estrogen receptors (ERα and ERβ) in thyroid tissue has been described, indicating a direct effect on the gland. However, in goiter, the presence of the G-protein coupled estrogen receptor (GPER1) has not been described. The aims of this study were to evaluate GPER1 gene and protein expressions in normal human thyroid tissue and goiter, and to estimate the prevalence of gene expression or protein GPER1 in these tissues. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to evaluate GPER1 gene and protein expressions, respectively. In order to perform an accurate comparison of mRNA levels in tissue samples from normal thyroid and goiter a reference gene was validated to normalize RT-qPCR. Among the six genes analyzed, beta-actin was the most stable, as calculated by the NormFinder program. In gene expression analysis, GPER1 mRNA was present in all samples (normal=16 and goiter=19), with a higher expression level in normal thyroid than in goiter (p= 0.01). In all normal samples tested (n=15) the presence of GPER1 protein (band with molecular weight ~ 38 kDa) was identified by Western blot. However, it was not found in 28% of goiter samples (n=13). Furthermore, GPER1 protein levels were significantly lower in goiter than in normal thyroid (p=0.002). These data suggest that GPER1 is present in normal thyroid cells, and goiter development could trigger or be a consequence of the loss of this receptor expression.

Define-se como bócio um aumento benigno de volume da tireoide não relacionado a doenças autoimunes, infiltrativas ou neoplasias. A causa mais comum é carência de iodo, no entanto, mesmo em áreas com suficiência de iodo, os bócios ocorrem, por mecanismos desconhecidos, e são mais comuns nas mulheres. A presença dos receptores clássicos do estrogênio (ERα e ERβ) no tecido tireoidiano já foi descrita, bem como o efeito direto do estradiol na glândula. Porém, a presença do receptor de estrogênio acoplado a proteína G (GPER1) em bócio ainda não foi descrita. Esse estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica e protéica de GPER1 em tecido de tireoide humano normal e bócio, e estimar a prevalência de expressão gênica ou protéica do GPER1 nesses tecidos. As metodologias utilizadas para avaliar a expressão gênica e protéica do GPER1 foram a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real a partir de Transcrição Reversa (RT-qPCR) e o Western Blot, respectivamente. A fim de realizar uma acurada comparação dos níveis de mRNA em amostras de tecido de tireoide normal e bócio, realizou-se a escolha de um gene de referência para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. Dentre os seis genes avaliados, a beta-actina foi o mais estável, calculado pelo programa NormFinder, sendo adequada sua utilização como gene de referência, a fim de minimizar o efeito das variações experimentais inerentes ao método. Na análise da expressão gênica, o mRNA do GPER1 estava presente em todas as amostras avaliadas (normal=16 e bócio=19), com um nível de expressão maior em tecido normal de tireoide, quando comparado ao bócio (p=0,01). Na análise da expressão protéica, em todas as amostras de tecido normal avaliadas (n=15), verificou-se a presença da proteína do GPER1 (banda com peso molecular ~38 KDa). Porém, em 28% das amostras de bócio (n=13), não foi identificada a expressão protéica desse receptor. Além disso, os níveis de proteína do GPER1 foram significativamente menores no bócio, quando comparados aos do tecido normal de tireoide (p=0,002). Esses dados sugerem que o GPER1 está presente em células normais na tireoide, e que, o desenvolvimento do bócio pode desencadear, ou ser consequência, da perda de expressão desse receptor. / Goiter is an enlarged thyroid not related to autoimmune, infiltrative or neoplastic diseases. Iodine deficiency is its most common cause. But, even in areas with sufficient iodine, the goiter occurs by unknown mechanisms, and it is more frequent in women. The presence of classical estrogen receptors (ERα and ERβ) in thyroid tissue has been described, indicating a direct effect on the gland. However, in goiter, the presence of the G-protein coupled estrogen receptor (GPER1) has not been described. The aims of this study were to evaluate GPER1 gene and protein expressions in normal human thyroid tissue and goiter, and to estimate the prevalence of gene expression or protein GPER1 in these tissues. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to evaluate GPER1 gene and protein expressions, respectively. In order to perform an accurate comparison of mRNA levels in tissue samples from normal thyroid and goiter a reference gene was validated to normalize RT-qPCR. Among the six genes analyzed, beta-actin was the most stable, as calculated by the NormFinder program. In gene expression analysis, GPER1 mRNA was present in all samples (normal=16 and goiter=19), with a higher expression level in normal thyroid than in goiter (p= 0.01). In all normal samples tested (n=15) the presence of GPER1 protein (band with molecular weight ~ 38 kDa) was identified by Western blot. However, it was not found in 28% of goiter samples (n=13). Furthermore, GPER1 protein levels were significantly lower in goiter than in normal thyroid (p=0.002). These data suggest that GPER1 is present in normal thyroid cells, and goiter development could trigger or be a consequence of the loss of this receptor expression.

Define-se como bócio um aumento benigno de volume da tireoide não relacionado a doenças autoimunes, infiltrativas ou neoplasias. A causa mais comum é carência de iodo, no entanto, mesmo em áreas com suficiência de iodo, os bócios ocorrem, por mecanismos desconhecidos, e são mais comuns nas mulheres. A presença dos receptores clássicos do estrogênio (ERα e ERβ) no tecido tireoidiano já foi descrita, bem como o efeito direto do estradiol na glândula. Porém, a presença do receptor de estrogênio acoplado a proteína G (GPER1) em bócio ainda não foi descrita. Esse estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica e protéica de GPER1 em tecido de tireoide humano normal e bócio, e estimar a prevalência de expressão gênica ou protéica do GPER1 nesses tecidos. As metodologias utilizadas para avaliar a expressão gênica e protéica do GPER1 foram a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real a partir de Transcrição Reversa (RT-qPCR) e o Western Blot, respectivamente. A fim de realizar uma acurada comparação dos níveis de mRNA em amostras de tecido de tireoide normal e bócio, realizou-se a escolha de um gene de referência para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. Dentre os seis genes avaliados, a beta-actina foi o mais estável, calculado pelo programa NormFinder, sendo adequada sua utilização como gene de referência, a fim de minimizar o efeito das variações experimentais inerentes ao método. Na análise da expressão gênica, o mRNA do GPER1 estava presente em todas as amostras avaliadas (normal=16 e bócio=19), com um nível de expressão maior em tecido normal de tireoide, quando comparado ao bócio (p=0,01). Na análise da expressão protéica, em todas as amostras de tecido normal avaliadas (n=15), verificou-se a presença da proteína do GPER1 (banda com peso molecular ~38 KDa). Porém, em 28% das amostras de bócio (n=13), não foi identificada a expressão protéica desse receptor. Além disso, os níveis de proteína do GPER1 foram significativamente menores no bócio, quando comparados aos do tecido normal de tireoide (p=0,002). Esses dados sugerem que o GPER1 está presente em células normais na tireoide, e que, o desenvolvimento do bócio pode desencadear, ou ser consequência, da perda de expressão desse receptor. / Goiter is an enlarged thyroid not related to autoimmune, infiltrative or neoplastic diseases. Iodine deficiency is its most common cause. But, even in areas with sufficient iodine, the goiter occurs by unknown mechanisms, and it is more frequent in women. The presence of classical estrogen receptors (ERα and ERβ) in thyroid tissue has been described, indicating a direct effect on the gland. However, in goiter, the presence of the G-protein coupled estrogen receptor (GPER1) has not been described. The aims of this study were to evaluate GPER1 gene and protein expressions in normal human thyroid tissue and goiter, and to estimate the prevalence of gene expression or protein GPER1 in these tissues. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to evaluate GPER1 gene and protein expressions, respectively. In order to perform an accurate comparison of mRNA levels in tissue samples from normal thyroid and goiter a reference gene was validated to normalize RT-qPCR. Among the six genes analyzed, beta-actin was the most stable, as calculated by the NormFinder program. In gene expression analysis, GPER1 mRNA was present in all samples (normal=16 and goiter=19), with a higher expression level in normal thyroid than in goiter (p= 0.01). In all normal samples tested (n=15) the presence of GPER1 protein (band with molecular weight ~ 38 kDa) was identified by Western blot. However, it was not found in 28% of goiter samples (n=13). Furthermore, GPER1 protein levels were significantly lower in goiter than in normal thyroid (p=0.002). These data suggest that GPER1 is present in normal thyroid cells, and goiter development could trigger or be a consequence of the loss of this receptor expression.