Les ARNs interagissant avec Piwi (ARNpi ou piRNA en anglais pour Piwi-interacting RNAs) interagissent avec les protéines de la branche PIWI de la famille des Argonautes. Ils participent à la répression des transposons dans la ligne germinale. Les ARNpi sont produits à partir de deux mécanismes: la biogenèse primaire et le cycle d'amplification Ping-Pong. Plusieurs questions fondamentales sur la biogenèse et la fonction des piRNAs sont encore ouvertes. Le travail de ce mémoire est concentré sur deux caractéristiques au niveau de la séquence dans les populations des ARNpi, le U1-biais et le biais de brin, dont les origines restent mystérieuses. Nos analyses ont révélé de nouvelles fonctions au protéines Piwi, dont les domaines MID et PIWI jouent un rôle essentiel dans la définition des deux biais. La structure cristalline du domaine MID de MIWI montre que l'uridine peut être favorisé comme premier nucléotide au niveau de l'extrémité 5' des ARNpi. De la même manière, nos résultats obtenus grâce aux études in vivo des protéines Piwi de Bombyx mori démontrent que le module MID-PIWI est essentiel pour déterminer le bias de brin des ARNpi s'associant avec les protéines Piwi. De plus, nous avons confirmé le rôle de la méthylation de la région N-terminale des protéines Piwi pour leur localisation dans la cellule. Ensemble, ces résultats offrent de nouveaux détails pour la compréhension de la biogenèse des ARNpi.Les protéines Piwi ne sont pas les seuls composants dans la voie des ARNpi. Des tests génétiques ainsi que des analyses biochimiques ont identifié plusieurs éléments impliqués dans la voie des ARNpi, cependant leurs fonctions restent obscures. J'ai étudié la protéine Vreteno, contenant des domaines Tudor, qui est impliquée dans le processus de biogenèse primaire des ARNpi. En utilisant la lignée cellulaire BmN4, nous avons identifié in vivo un complexe contenant Vreteno, des longues molécules d'ARN antisens, pouvant representer les précurseurs des ARNpi associés avec Siwi, ainsi que d'autres composants de la voie ARNpi, comme Ago3, BmTdrd12 et Spindle-E. De plus amples analyses sont nécessaires pour comprendre les fonctions de Vreteno dans la voie des ARNpi.Enfin, nous avons également étudié le rôle de l'hélicase à ARN Vasa dans la voie des piRNAs. Nos résultats démontrent que Vasa assemble un complexe régulé par l'ATP sur le ARN messager des transposons, afin de produire de nouveaux ARNpi secondaires avec orientation sens. En étudiant les différentes étapes de la voie des ARNpi, nos analyses ont fourni des informations importantes pour la compréhension de la biogénèse des ARNpi. / Piwi-interacting RNAs (piRNAs) associate to members of the PIWI clade of Argonaute proteins and are responsible for silencing of transposable elements in animal germ lines. piRNAs are produced through two biogenesis pathways, known as primary processing and Ping-Pong amplification cycle. There are many fundamental questions regarding piRNA biogenesis and function that are unsolved. In this thesis I have been focusing on the presence of two sequences features in piRNA populations, the U1-bias and the strand-bias, whose determination is not understood. Our analyses have revealed new features of the Piwi proteins, whose MID and PIWI domains play an essential role in the definition of both piRNA biases. The crystal structure of the MID domain of MIWI shows that uridine can be favored as the first nucleotide at the 5' end, while our in vivo results on Bombyx mori Piwi proteins demonstrate that the MID-PIWI module is essential to determine the strand bias of piRNAs that associate to the Piwi protein. Moreover we have confirmed the role of the methylation status of the N-terminus of Piwi protein for determining their localization. Altogether these findings provide new insights in the understanding of piRNA biogenesis.Piwi proteins are not the only components acting in the piRNA pathway. Genetic screenings and biochemical analyses have identified several other factors, which have been involved in the piRNA pathway, but whose functions remain elusive. I have focused on the Tudor domain-containing protein Vreteno, which has been involved in the primary biogenesis pathway. Using BmN4 cells, we have identified an in vivo complex of Vreteno, containing long antisense RNA molecules, which might represent the precursor of Siwi-piRNAs, and other piRNA known factors, like Ago3, BmTdrd12 and Spindle-E. Further analyses are required for the understanding of Vreteno functions in the piRNA pathway.Finally, we have also investigated the role of the RNA helicase Vasa in the piRNA pathway. Our results show that Vasa assembles an ATP-gated Ping-pong complex on transposon mRNAs to generate new sense-oriented secondary piRNAs. By looking at different step in the piRNA pathway our analyses have provided important insights for the understanding of the piRNA biogenesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014GRENV002 |
| Date | 17 January 2014 |
| Creators | Cora, Elisa |
| Contributors | Grenoble, Pillai, Ramesh |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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