Η συγκόλληση των αιμοπεταλίων προάγεται από το ινωδογόνο, μια εξωκυττάρια πρωτεΐνη, η οποία δεσμεύεται εκλεκτικά στον υποδοχέα GP IIb/IIIa. Το τριπεπτίδιο RGD (Arg-Gly-Asp) συνιστά τη μικρότερη αλληλουχία, η οποία είναι απαραίτητη για την αναγνώριση και πρόσδεση του ινωδογόνου στον υποδοχέα και απαντάται και σε άλλες συγκολλητικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι παρούσες στον εξωκυττάριο χώρο και στο αίμα, όπως η ινοσυνδετίνη, το κολλαγόνο, ο παράγοντας Von Willebrand, κτλ.
Η αντιπηκτική θεραπεία έχει βασιστεί σε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις του προβλήματος. Η μία προσέγγιση αφορά την εμπόδιση της πρωταρχικής διέγερσης των αιμοπεταλίων από διάφορους αγωνιστές, όπως θρομβίνη, επινεφρίνη, κολλαγόνο, κτλ. Η άλλη προσέγγιση περιλαμβάνει την διακοπή του μηχανισμού μεταγωγής σήματος, ο οποίος ακολουθεί την πρόσδεση του αγωνιστή στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Η ασπιρίνη, παράγωγο του σαλικυλικού οξέος, αναστέλλει το πρώτο βήμα στη βιοσύνθεση της θρομβοξάνης Α2 από αραχιδονικό οξύ μέσω ακετυλίωσης του ενζύμου κυκλοοξυγενάση 1.
Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση γραμμικών και κυκλικών αναλόγων του τριπεπτιδίου RGD με ενσωματωμένο σαλικυλικό οξύ ή παράγωγά του. Τα διάφορα ανάλογα συντέθηκαν με κλασικές μεθόδους πεπτιδικής σύνθεσης σε υγρή και στερεά φάση.
Τη σύνθεση των αναλόγων ακολούθησε καθαρισμός τους (HPLC) και προσδιορισμός της δομής τους με (ESI-MS). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε in vitro με φωτομετρική μέθοδο στους 37C και συνεχή καταγραφή της διερχόμενης ακτινοβολίας με ειδικό όργανο (Dual Channel Aggregometer) η ανασταλτική τους δράση στη συγκολλητικότητα των αιμοπεταλίων του ανθρώπου. Προς περαιτέρω επιβεβαίωση των πειραμάτων συσσώρευσης και μελέτη της πρόσδεσης των αναλόγων στις ιντεγκρίνες χρησιμοποιήθηκε η κυτταρομετρία ροής με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των υποδοχέων Gp Ia, Gp IIb/IIIa, Gp IIIa και GMp 140.
Αναλύοντας τα αποτελέσματα των βιολογικών μελετών, τόσο της αναστολής της συσσωμάτωσης των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro όσο και της κυτταρομετρίας ροής σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια για τα δραστικά πεπτίδια, οδηγούμαστε στα επόμενα συμπεράσματα:
1. Από τη σειρά των RGD γραμμικών αναλόγων που μελετήθηκαν, βρέθηκαν δραστικά μόνο στην περίπτωση που τα πεπτίδια έχουν στο C-τελικό τους άκρο αμίδιο.
2. Η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος στο τριπεπτίδιο - αμίδιο RGD ενισχύει την αντισυγκολλητική του δράση έναντι των αιμοπεταλίων in vitro. Από αυτά τα ανάλογα 26 (IC50= 50μΜ), 27 (38μΜ) και 28 (53μΜ) (ενσωματωμένο σαλικυλικό οξύ στο τριπεπτίδιο) έχουν την ισχυρότερη δράση, ενώ μόνο το τριπεπτίδιο 23 έχει IC50= 540μΜ
3. Η προστασία του β-καρβοξυλίου του Asp με βενζυλομάδα αυξάνει τη δράση του πεπτιδίου σε σχέση με την ύπαρξη ελεύθερου β-καρβοξυλίου. Αυτό διαπιστώνεται από το γεγονός ότι όλα τα βιολογικώς δραστικά ανάλογα έχουν το β-καρβοξύλιο προστατευμένο με βενζυλομάδα και αυτό έρχεται σε συμφωνία με βιβλιογραφικά δεδομένα άλλων ερευνητών περί αναγκαιότητας ύπαρξης λιπόφιλης ομάδας στο C-τελικό άκρο του πεπτιδίου.
4. Αντίθετα, η ενσωμάτωση σαλικυλο-παραγώγων (βρώμο-, χλώρο-, νίτρο-, άμινο-, κτλ) στα ανάλογα δίνει πολύ μικρή αντισυγκολλητική δράση στα αιμοπετάλια του ανθρώπου in vitro σε σχέση με το σαλικυλικό οξύ.
5. Από τα συντεθέντα κυκλικά ανάλογα μόνο το ανάλογο 61, που φέρει δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ της κυστεΐνης και του θειοσαλικυλικού οξέος, επέδειξε ισχυρή αντισυγκολλητική δράση έναντι των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro με τιμή IC50= 8μΜ, που είναι και η καλύτερη τιμή IC50 για όλα τα ανάλογα που συντέθηκαν (γραμμικά και κυκλικά).
6. Και στην περίπτωση των κυκλικών πεπτιδίων, τα ανάλογα με το προστατευμένο β-καρβοξύλιο εμφανίζουν ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι εκείνων που φέρουν το β-καρβοξύλιο ελεύθερο.
7. Από όλα τα γραμμικά ανάλογα που περιέχουν παράγωγα του σαλικυλικού οξέος το ανάλογο 39 που περιέχει το 5-χλωρο σαλικυλικό οξύ εμφανίζει ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι του υποδοχέα Gp Ib.
8. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί ότι είναι η πρώτη φορά που συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα του RGD εμφανίζουν ισχυρή πρόσδεση στον υποδοχέα Gp Ib, o οποίος ευθύνεται για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο κυτταρικό τοίχωμα. / Integrins constitute a large family of heterodimeric cell-surface, transmembrane receptors, which play a major role in cell/cell and cell/matrix adhesive interactions. The Arg-Gly-Asp (RGD) sequence is known to be the integrin recognition site of many extracellular matrix proteins such as fibronectin, osteopontin, collagen, fibrinogen, von Willebrand factor, laminin, etc. On the other hand, it is well known that low doses of aspirin (acetyl salicylic acid) decrease platelet aggregation by causing an inhibitory effect on thromboxane A2 production by platelets. Several antiplatelet strategies have already been developed and are under preclinical or clinical investigation. In the present thesis, the synthesis of linear and cyclic RGD analogs incorporating salicylic acid derivatives is reported. The syntheses of the new analogs were carried out by using classic methods of peptide synthesis in liquid or solid phase. The synthesized compounds were purified by RP-HPLC and lyophilised to give fluffy solid, identified by ESI-MS spectra.
These compounds were tested for inhibitory activity on human platelet aggregation in vitro, by adding common aggregation reagents to citrated platelet rich plasma (PRP). The aggregation was determined using a dual channel electronic aggregometer by recording the increase of light transmission. Their specificity for the Gp receptors was checked by using flow cytometry with monoclonal antibodies against Gp Ib, Gp IIb/IIIa, Gp IIIa and GMP140 receptors.
Based on the results of the biological studies we could report the next inferences:
1. From the studied synthetic RGD analogs only peptides – amides are active against human platelet aggregation in vitro.
2. The coupling of salicylic acid with the RGD peptides enforces the antiplatelet activity in vitro of the single tripeptide. From the above peptides, the analog 26 (tripeptide incorporating salicylic acid) shows strong antiplatelet activity (IC50=50 μΜ), whereas the analog 23 (only tripeptide) has IC50= 540μΜ.
3. The protection of the β-carboxy group of Asp as benzylester increases the activity of the peptides in comparison with those having the β-carboxy group unprotected. Thus, our results ensure the theory of necessity of the existence a lipophile center on the C-terminal side of the peptide.
4. The incorporation of salicylic acid derivatives in the RGD peptide does not increase further the antiplatelet activity than the incorporation of salicylic acid does.
5. Among the cyclic RGD peptides only the analog 61, having the disulfide bridge between the cysteine and the thiosalicylic acid, shows strong antiplatelet activity in vitro (IC50= 8μΜ).
6. Most of the analogs show high binding affinity for the Gp Ib receptor. The cyclic analog 61 shows special selectivity for this receptor at concetrations of 110 μΜ.
7. The analog 39, although it shows low antiplatelet activity, has high binding affinity for the Gp Ib receptor. Probably, this activity is due to the atom of Cl at the 5 position of aromatic ring of salicylic acid.
8. According to the literature data, it is the first time that synthetic RGD peptides show strong binding affinity for the Gp Ib receptor, which is responsible for the platelet adhesion to the subenthothelium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/3681 |
| Date | 20 September 2010 |
| Creators | Σαρηγιάννης, Ιωάννης |
| Contributors | Σταυρόπουλος, Γεώργιος, Sarigiannis, Ioannis, Ματσούκας, Ιωάννης, Λιακοπούλου-Κυριακίδου, Μαρία, Πούλος, Κωνσταντίνος, Τσεγενίδης, Θεόδωρος, Μακρής, Παντελής, Μαγκαφά, Βασιλική |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0157 seconds