Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διπλωματικής ερευνητικής εργασίας
αποτελεί η ταυτοποίηση και η διερεύνηση της βιολογικής δράσης του
πεπτιδίου που αποκόπτεται από τον υποδοχέα PAR1 μετά την ενεργοποίηση
του από την θρομβίνη.
Το υπεύθυνο γονίδιο για την έκφραση του υποδοχέα PAR1
κωδικοποιεί μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μήκους 425 αμινοξέων. Έχει
προταθεί ότι τα πρώτα 21-23 αμινοξέα του αμινοτελικού άκρου του μορίου
αυτού πιθανόν να αποτελούν σηματοδοτική αλληλουχία υπεύθυνη για την
μεταφορά και τοποθέτηση του υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη. Η
σηματοδοτική αυτή αλληλουχία είναι άγνωστο προς το παρόν αν παραμένει
στον ώριμο PAR1 υποδοχέα ή απομακρύνεται με πρωτεόλυση πριν την
εμφάνιση του PAR1 στην κυτταρική μεμβράνη.
Ο υποδοχέας PAR1 ανήκει στην μεγάλη οικογένεια υποδοχέων των
επτά διαμεμβρανικών τμημάτων (seven transmembrane domain receptor
family) που διασυνδέονται με G πρωτεΐνες (G protein-coupled receptors,
GPCRs). Επιπλέον, επειδή η ενεργοποίηση του υποδοχέα απαιτεί την
ενζυμική δράση της θρομβίνης, ορίζεται με αυτόν τον τρόπο μία νέα
οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες
(Proteinase-Activated Receptors, PARs).
Η θρομβίνη αναγνωρίζει για πέψη μια θέση στην αλληλουχία του
εξωκυττατικού αμινοτελικού άκρου μεταξύ των αμινοξέων Arg41-Ser42 του
υποδοχέα PAR1. Η πέψη αυτού του πεπτιδικού δεσμού οδηγεί στην
απελευθέρωση ενός πεπτιδίου (Thrombin Receptor Peptide, TR) και στην
δημιουργία ενός νέου αμινοτελικού άκρου για τον υποδοχέα, που λειτουργεί
ως αγωνιστής και ενεργοποιεί τον PAR1.
Έχει δειχθεί ότι η θρομβίνη και ο υποδοχέας PAR1 εμπλέκονται σε
αρκετές παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Ωστόσο δεν υπάρχουν επαρκείς
πληροφορίες για την δράση του πεπτιδίου που αποκόπτεται.
Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία HPLC/MS έγινε προσπάθεια για την
ταυτοποίηση του πραγματικού μεγέθους του πεπτιδίου που αποκόπτεται από
τον PAR1 υποδοχέα. Τα πρώτα αποτελέσματα της εφαρμογής αυτής
55
οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι κρίνεται απαραίτητη η περεταίρω βελτίωση
των συνθηκών ανίχνευσης του πεπτιδίου, ώστε να επιτρέπεται η ανίχνευση
του κατά την φόρτωση 1 ng στην στήλη της υγρής χρωματογραφίας. Πιο
συγκεκριμένα η αντιμετώπιση της υψηλής πολικότητας του TR23-41 και η
ενίσχυση ευαισθησίας του TR1-41 με την χρήση διαφορετικού διαλύτη ή με την
χρήση διαφορετικής στήλης ή και ακόμα ο συνδυασμός διαφορετικού διαλύτη
και στήλης, που αποτελεί και την μέχρι τώρα πιο πιθανή εκδοχή
αντιμετώπισης των παραπάνω προβλημάτων, πιθανόν να δώσουν λύση στο
πρόβλημα ανίχνευσης σε χαμηλές συγκεντρώσεις πεπτιδίου.
Επιπλέον με την χρήση τεχνικής ελέγχου DNA σύνθεσης εξετάστηκε η
επίδραση του TR1-41 πεπτιδίου σε HUVECs. Σκοπός αυτών των πειραμάτων
δεν ήταν μόνο η εύρεση τυχόν βιολογικής δράσης του πεπτιδίου αλλά και η
εύρεση ελάχιστης συγκέντρωσης του πεπτιδίου που προκαλεί αναστολή στην
σύνθεση του DNA σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων στις οποίες έχει
προηγηθεί συνθήκες νηστείας. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το TR1-41
πεπτίδιο προκαλεί αναστολή στην σύνθεση του DNA και μάλιστα σε ελάχιστη
συγκέντρωση 30nM, παρουσία ή μη του αυξητικού παράγοντα VEGF.
Μελλοντικές έρευνες με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούν
να οδηγήσουν στην ταυτοποίηση του πραγματικού μεγέθους του πεπτιδίου
που αποκόπτεται μετά την τοποθέτηση και ενεργοποίηση του PAR1 στην
κυτταρική μεμβράνη και κατ’ επέκταση στην λεπτομερή διερεύνηση της
βιολογικής δράσης του πεπτιδίου αυτού. Γνωρίζοντας την ανάμιξη της
θρομβίνης και του υποδοχέα της σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις η
ταυτοποίηση του πεπτιδίου και η γνώση της βιολογικής του δράσης
μελλοντικά θα αποτελέσει ένα χρήσιμο προγνωστικό και διαγνωστικό δείκτη. / In the context of the MSc dissertation described herein, the objective of
the research work constitutes in the identification of the real number of amino
acids of the peptide that is being released after the activation of PAR1 by
thrombin and the examination of its biological action.
The responsible gene for the PAR1 expression codifies a polypeptide
chain of 425 amino acids. It is under consideration that the first 21-23 amino
acids of the exodomain N-terminal sequence of the receptor may be a
signaling sequence, responsible for the transfer and placement of the receptor
to the cell membrane. It is not known so far if the signaling sequence remains
on the receptor after its placement on the cell membrane.
PAR1 belongs to the family of the seven transmembrane domain
receptor, the G protein-coupled receptors (GPCRs). PAR1 requires the
enzymic activity of thrombin for its activation, and so a new family of
transmembrane receptors is being defined, the Proteinase-Activated
Receptors (PARs).
Thrombin recognizes and cleaves the N-terminal exodomain of PAR1
between Arg41-Ser42 amino acids. This cleavage event releases a peptide
(Thrombin Receptor Peptide, TR) and so unmasks a new N-terminus of the
receptor, which acts as PAR1 agonist and activates the receptor.
It has been proved that thrombin and PAR1 are being involved in many
pathophysiological situations. So far there isn’t enough information of the
biological action of the peptide that is being realized from PAR1. The use of
HPLC/MS technology wasn’t able to reveal the real number of this peptide
because of the intensity of TR1-41 in 1ng on column and the extreme polarity of
TR24-41. instead of these results we strongly believe that the use of different
solvents will increase the intensity of TR1-41 in 1ng on column. Also the use of
C8 column instead of C4 probably will contribute in the traceability of TR24-41.
The biological action of TR1-41 was examined with the use of DNA
synthesis control technique in HUVECs cultivation after starvation. These
experiments showed that the use of TR1-41 caused reduction of the DNA
synthesis in HUVECs. We also examined the lower concentration of TR1-41
57
that was able to reduce the DNA synthesis in HUVECs. TR1-41 was able to
reduce DNA synthesis in minimum concentration of 30 nM even in the
presence of VEGF.
The above results in association with future research can constitute in
the identification of the real size of the peptide that is being released after the
activation of PAR1, as in the biological action of this peptide. Knowing so far
that thrombin and PAR1 are being involved in pathophysiological situations
this peptide will constitute in the future as a useful prognostic and diagnostic
marker.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/894 |
| Date | 29 August 2008 |
| Creators | Τσιλιμιδού, Αναστασία |
| Contributors | Τσοπάνογλου, Νικόλαος, Tsilimidou, Anastasia, Τσοπάνογλου, Νικόλαος, Γιαννοπούλου, Ελευθερία, Ζαρκάδης, Ιωάννης |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0032 seconds