[ES] El sistema de melanocortinas es un sistema hormonal crítico en la respuesta
al estrés y el control del balance energético. Sus péptidos agonistas, las hormonas
estimuladoras de los melanocitos (MSHs) y la hormona adrenocorticotropa (ACTH)
están codificados en un precursor común denominado proopiomelanocortina
(POMC). Sus efectos se medían a través de 5 receptores (MCRs) que exhiben
farmacologías y dominios de expresión particulares. Los efectos de los agonistas
son contrarrestados por la acción de dos antagonistas endógenos, la proteína de
señalización agutí (ASIP) y la proteína relacionada con agutí (AGRP), que pueden
actuar como agonistas inversos de los receptores activados constitutivamente.
Para aumentar la complejidad del sistema hormonal existen dos proteínas
accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) que interaccionan
físicamente con los receptores para permitir (MC2R) o modular (MC1R, MC3R,
MC4R, MC5R) la expresión funcional de los mismos. La MRAP1 es imprescindible
para la migración a la membrana plasmática del MC2R mientras que la MRAP2
interactúa con el resto de receptores para modular su actividad.
Experimentos anteriores demostraron que, en el pez cebra, uno de los dos
parálogos de MRAP2 (MRAP2a) es capaz de interactuar con el MC4R, un receptor
canónico de la MSH, transformándolo en un receptor de ACTH. Los experimentos
recogidos en esta tesis doctoral demuestran que esta función se ha conservado
evolutivamente y esta conservación evolutiva sugiere la existencia de un rol
fisiológico para la interacción MRAP2-MC4R. Este rol puede estar relacionado con
la trasmisión de información desde el eje hipotálamo-hipófisis-interrenal, que
regula la respuesta al estrés hacia los sistemas centrales que controlan el balance
energético. Además, proponemos que dicha interacción oferta un mecanismo
molecular potencial para la explicación de los beneficios de la terapia con ACTH en
el síndrome de espasmos infantiles.
Nuestro segundo objetivo fue caracterizar molecularmente la interacción
entre ambas proteínas (MRAP2 y MC4R) utilizando una estrategia de receptores
quiméricos. Experimentos previos en nuestro laboratorio habían demostrado que
la interacción MRAP2a-MC1R no provocaban una alteración farmacológica del
receptor. Por tanto, nuestra estrategia fue sustituir diferentes dominios del MC4R por aquellos homólogos del MC1R esperando una pérdida de función, es decir una
pérdida de la sensibilidad a ACTH inducida por la MRPA2a en el receptor
quimérico. Una vez detectados estos dominios fundamentales optamos por la
estrategia contraria, es decir, la substitución de dominios del MC1R por aquellos
homólogos del MC4R esperando una ganancia de función. Los resultados
demuestran que la substitución conjunta de los dominios transmembranales (TM)
3, 5 y 7 conjuntamente con el segundo y tercer giros extracelulares (ECL) del MC4R
sobre el MC1R confiere sensibilidad a ACTH al receptor quimérico. Basándonos en
los modelos estructurales de la interacción de diversos agonistas con el MC4R,
nuestros resultados otorgan luz sobre la relación funcional entre la MRPA2a y el
MC4R y permiten inferir modelos de interacción especulativos.
Resultados transcriptómicos previos del grupo de investigación habían
sugerido la participación del sistema de melanocortinas en la regulación del reloj
circadiano, por tanto, nuestro siguiente objetivo fue demostrar esta interrelación.
Para ello utilizamos el paradigma de la actividad locomotora circadiana
habitualmente utilizada para el estudio de los ritmos circadianos. En primer lugar,
y para poner a punto el sistema de registro de la actividad, estudiamos las
diferencias de actividad locomotora entre grupos aislados de machos y hembras
mostrando que bajo estas condiciones de aislamiento los ritmos de actividad
locomotora son dependientes del sexo, además también demostramos que la
administración oral de esteroides opuestos al sexo fenotípico, es decir estradiol
en machos y 11-ceto-androstenediona (como precursor de la 11-
cetotestosterona) en hembras, revertía parcialmente los efectos del sexo sobre el
perfil locomotor. Finalmente quisimos estudiar la posible interacción del sistema
de melanocortinas y la regulación del reloj circadiano demostrando que la
sobreexpresión de antagonistas endógenos en modelos de transgénesis en el pez
cebra modifica el patrón de actividad de los animales. Los animales transgénicos
exhiben una mayor actividad significativa especialmente durante el periodo
nocturno. Estos datos concuerdan con datos ya publicados por nuestro grupo de
investigación donde se demuestra la ausencia de diferencias significativas en los
niveles de melatonina entre el día y la noche en animales transgénicos. / [CA] El sistema de melanocortines és un sistema hormonal crític en la resposta a
l’estrès i el control del balanç energètic. Els seus pèptids agonistes, les hormones
estimuladores dels melanòcits (MSHs) i l’hormona adrenocorticotropa (ACTH)
estan codificats en un precursor comú denominat proopiomelanocortina (POMC).
Els seus efectes es mesuraven a través de 5 receptors (MCRs) que exhibeixen
farmacologies i dominis d’expressió particulars. Els efectes dels agonistes són
contrarestats per lacció de dos antagonistes endògens, la proteïna de senyalització
agutí (ASIP) i la proteïna relacionada amb agutí (AGRP), que poden actuar com
agonistes inversos dels receptors activats constitutivament. Per a augmentar la
complexitat del sistema hormonal existeixen dos proteïnes accessòries dels
receptors de melanocortines (MRAPs) que interaccionen físicament amb els
receptors per a permetre (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R)
l’expressió funcional dels receptors. La MRAP1 és imprescindible per la migració a
la membrana plasmàtica del MC2R mentres que la MRAP2 interactúa amb la resta
de receptors per a modular la seua activitat.
Experiments anteriors van demostrar que, en el peix zebra, un dels dos
paràlegs de MRAP2 (MRAP2a) és capaç d’interactuar amb el MC4R, un receptor
canònic de la MSH, transformant-lo en un receptor d’ACTH. Els experiments
recollits en aquesta tesis doctoral demostren que aquesta funció s’ha conservat
evolutivament i aquesta conservació evolutiva suggereix l’existència d’un rol
fisiològic per a la interacció MRAP2-MC4R. Aquest rol pot estar relacionat amb la
transmissió d’informació des de l’eix hipotàlam-hipòfisis-interenal que regula la
resposta a l’estrès cap als sistemes centrals que control·len el balanç energètic. A
més a més, proposem que l’esmentada interacció oferta un mecanisme molecular
potencial per l’explicació dels beneficis de la teràpia amb ACTH en síndrome
d’espasmes infantils.
El nostre segon objectiu fou caracteritzar molecularment la interacció entre
ambdues proteïnes (MRPA2 y MC4R) utilitzant una estratègia de receptors
quimèrics. Experiments previs al nostre laboratori havien demostrat que la
interacció MRAP2a-MC1R no provocaven una alteració farmacològica del
receptor.
Per tant, la nostra estratègia fou substituir diferents dominis del MC4R per aquells
homòlegs del MC1R esperant una pèrdua de funció, és dir una pèrdua de la
sensibilitat a ACTH induïda per la MRPA2a en el receptor quimèric. Una vegada
detectats aquests dominis fonamentals optem per l’estratègia contrària, és a dir,
la substitució de dominis del MC1R per aquells homòlegs del MC4R esperant una
ganància de funció. Els resultats demostren que la substitució conjunta dels
dominis transmembranals (TM) 3, 5 i 7 conjuntament amb el segon i tercer girs
extracelulars (ECL) del MC4R sobre el MC1R confereix sensibilitat a ACTH al
receptor quimèric. Basant-nos en els models estructurals de la interacció de
diversos agonistes amb el MC4R els nostres resultats atorguen llum sobre la
relació funcional entre la MRPA2a i el MC4R i permiteixen inferir models
d’interacció especulatius.
Resultats transcriptòmics previs del grup d’investigació havien suggerit la
participació del sistema de melanocortines en la regulació del rellotge circadià, per
tant, el nostre següent objectiu fou demostrar aquesta interrelació. Per a això
utilitzem el paradigma de l’activitat locomotora circadiana habitualment utilitzada
per l’estudi dels ritmes circadians. En primer lloc, i per posar a punt el sistema de
registre de l’activitat, estudiem les diferències d’activitat locomotora entre grups
aïllats de mascles i femelles mostrant que baix aquestes condicions d’aïllament els
ritmes d’activitat locomotora són dependents del sexe, a més a més també
demostrem que l’administració oral de esteroïdes oposats al sexe fenotípic, és a
dir estradiol en mascles i 11-ceto-androstenediona (com a precursor de la 11-
cetotestosterona) en femelles, revertia parcialment els efectes del sexe sobre el
perfil locomotor. Finalment vam voler estudiar la possible interacció del sistema
de melanocortines i la regulació del rellotge circadià demostrant que la
sobreexpressió d’antagonistes endògens en models de transgènesis en el peix
zebra modifica el patró d’activitat dels animals. Els animals transgènics exhibeixen
una major activitat significativa especialment durant el període nocturn. Aquestes
dades concorden amb dades publicades anteriorment pel nostre grup
d’investigació on es demostra l’absència de diferències significatives en els nivells
de melatonina entre el dia i la nit en animals transgènics. / [EN] Melanocortin system is a key hormonal system in the regulation of stress
response and the control of energy balance. Peptide agonist, the melaninstimulating hormones (MSHs) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) are
encoded in a common precursor named proopiomelancortin (POMC). Their effects
are mediated through five receptors that exhibit different expression domains and
pharmacological properties. Agonist effects are counterbalanced by the action of
endogenous competitive antagonist, agouti-signalling protein (ASIP) and agoutirelated protein (AGRP) that can also work as inverse agonist at constitutive
activated receptors. To increase the complexity of the hormonal system, two
melanocortin receptor accessory proteins (MRAPs) physically interplay with the
melanocortin receptors to allow (MC2R) or modulate (MC1R, MC3R, MC4R, and
MC5R) the functional expression of the receptors. MRAP1 is critical for the MC2R
traffic to the plasma membrane whereas MRAP2 interacts with the remaining
receptors to modulate their activity.
Our previous experiments demonstrated that, in the zebrafish, one of the
two MRAP2 paralogues (MRAP2a) is able to physically interact with the MC4R, a
canonical MSH receptor, to become an ACTH receptor. Experiments in the
doctoral thesis demonstrate that this function is conserved and this evolutionary
conservation suggests a physiological role for the MC4R-MRAP2 interaction. This
role can be related to the information relay from the hypothalamic-pituitaryinterrenal axis, that regulates the stress response, to the central systems that
controls energy balance. In addition, we propose that this interaction can be the
molecular substrate explaining the ACTH therapy of the infantile spasm syndrome
in humans.
One second objective was to molecularly characterize the interaction
between both proteins (MC4R and MRAP2a) using a receptor quimeras strategy.
Previous experiments in our lab demonstrated that the interaction of MRAP2a
with MC1R cannot modify the pharmacological profile of the receptor. Therefore,
our strategy was to exchange different receptor domains of the MC4R with those
homologues in the MC1R looking for a loss of function, i.e. a loss of the MRAP2ainduced ACTH sensitivity. Once characterized the main domains responsible for a loss of function in the MC4R quimeras, we follow the opposite strategy, i.e.
exchange the critical domains of MC4R into MC1R waiting for a gain of function in
the new MC1R quimeras. Our results demonstrate that integrated substitution of
the transmembrane domains (TM) 3, 5, and 7 together with the external loops
(ECL) 2 and 3 provides ACTH sensitivity to the new MC1R quimeras. Following
several structural models of the interaction between different agonists with the
melanocortin receptors, our results provides some light on the functional
relationship between MRAP2a and MC4R and allow to infer some interactive and
speculative models.
Previous transcriptomic results in the research group suggested the
involvement of the melanocortin system in the regulation of circadian clock,
therefore, our following objective was to demonstrate this interaction. To that, we
use the circadian locomotor activity paradigm usually utilized for the study of
circadian rhythms. First and with the aim to set up the recording systems we
studied the potential differences between the locomotor activity patterns
between isolated groups of males and females showing that under these
conditions of grouped-sex isolation the locomotor activity is sex-dependent,
moreover we also demonstrate that the oral administration of opposed sex
steroids to the phenotypic sex, i.e. 17-estradiol to males and 11-ketoandrostenedione (as 11-keto-testosterone precursor) to females was able to
revert the sex effects on locomotor pattern. Finally, we wanted to study the
potential interaction of the melanocortin system and the regulation of circadian
clock using the previous setup thus demonstrating that the overexpression of ASIP
in transgenic models modifies the locomotor activity. The transgenic animals
exhibit higher global activity specially during the nocturnal period. These data are
in well-agreement with those previously reported by our research group showing
the absence of significant differences between brain melatonin levels during the
light and dark period of the photoperiod in transgenic animals. / La presente Tesis Doctoral llevada a cabo en el Departamento de Fisiología de
peces y biotecnología del Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo
Superior de Investigaciones Científicas (CSIC); se realizó con la ayuda del apoyo
económico del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad.
Lucía Soletto Esteban ha sido beneficiaria de un contrato de Formación de
Personal Investigador (FPI) ( BES-2014-070372) para la realización del proyecto
“Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de
melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de
melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de
los ritmos circadianos de actividad” (AGL2013-46448-C3-3-R).
Parte de la financiación ha sido obtenida de proyectos de investigación entre los
cuales destaca: “Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los
mecanismos temporales y conductuales de peces” (MELANOCONDUCT)
(AGL2016-74857-C3-3-R) Proyectos I+D+I, RETOS.
Parte del trabajo experimental fue realizado en colaboración con el Prof. Nicholas
S. Foulkes, del Instituto de Toxicología y Genética (ITG) del Instituto Tecnológico
de Karlsruhe (KIT) de Alemania. Los fondos económicos para la realización de esta
estancia breve de investigación fueron proporcionados por el Ministerio de
Economía, Industria y Competitividad (EEBB-I-16-11803). / Soletto Esteban, L. (2020). Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/152296 / TESIS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/152296 |
| Date | 19 October 2020 |
| Creators | Soletto Esteban, Lucía |
| Contributors | Cerda Reverter, Jose Miguel, Universitat Politècnica de València. Departamento de Ciencia Animal - Departament de Ciència Animal, Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Economía y Competitividad |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | info:eu-repo/grantAgreement/MINECO//BES-2014-070372/ES/BES-2014-070372/, info:eu-repo/grantAgreement/MINECO//AGL2013-46448-C3-3-R/ES/IMPLICACION DEL SISTEMA DE MELANOCORTINAS EN LA REGULACION DEL CRECIMIENTO DE PECES: ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES ESTRES-INGESTA/, info:eu-repo/grantAgreement/AEI//AGL2016-74857-C3-3-R/ES/IMPLICACION DEL SISTEMA DE MELANOCORTINAS EN LA REGULACION DE LOS MECANISMOS TEMPORALES Y CONDUCTUALES DE PECES/, info:eu-repo/grantAgreement/MINECO//EEBB-I-16-11803/ES/EEBB-I-16-11803/ |
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