[ES] El sistema de melanocortinas es un sistema hormonal crítico en la respuesta al estrés y el control del balance energético. Sus péptidos agonistas, las hormonas estimuladoras de los melanocitos (MSHs) y la hormona adrenocorticotropa (ACTH) están codificados en un precursor común denominado proopiomelanocortina (POMC). Sus efectos se medían a través de 5 receptores (MCRs) que exhiben farmacologías y dominios de expresión particulares. Los efectos de los agonistas son contrarrestados por la acción de dos antagonistas endógenos, la proteína de señalización agutí (ASIP) y la proteína relacionada con agutí (AGRP), que pueden actuar como agonistas inversos de los receptores activados constitutivamente. Para aumentar la complejidad del sistema hormonal existen dos proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) que interaccionan físicamente con los receptores para permitir (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R) la expresión funcional de los mismos. La MRAP1 es imprescindible para la migración a la membrana plasmática del MC2R mientras que la MRAP2 interactúa con el resto de receptores para modular su actividad. Experimentos anteriores demostraron que, en el pez cebra, uno de los dos parálogos de MRAP2 (MRAP2a) es capaz de interactuar con el MC4R, un receptor canónico de la MSH, transformándolo en un receptor de ACTH. Los experimentos recogidos en esta tesis doctoral demuestran que esta función se ha conservado evolutivamente y esta conservación evolutiva sugiere la existencia de un rol fisiológico para la interacción MRAP2-MC4R. Este rol puede estar relacionado con la trasmisión de información desde el eje hipotálamo-hipófisis-interrenal, que regula la respuesta al estrés hacia los sistemas centrales que controlan el balance energético. Además, proponemos que dicha interacción oferta un mecanismo molecular potencial para la explicación de los beneficios de la terapia con ACTH en el síndrome de espasmos infantiles. Nuestro segundo objetivo fue caracterizar molecularmente la interacción entre ambas proteínas (MRAP2 y MC4R) utilizando una estrategia de receptores quiméricos. Experimentos previos en nuestro laboratorio habían demostrado que la interacción MRAP2a-MC1R no provocaban una alteración farmacológica del receptor. Por tanto, nuestra estrategia fue sustituir diferentes dominios del MC4R por aquellos homólogos del MC1R esperando una pérdida de función, es decir una pérdida de la sensibilidad a ACTH inducida por la MRPA2a en el receptor quimérico. Una vez detectados estos dominios fundamentales optamos por la estrategia contraria, es decir, la substitución de dominios del MC1R por aquellos homólogos del MC4R esperando una ganancia de función. Los resultados demuestran que la substitución conjunta de los dominios transmembranales (TM) 3, 5 y 7 conjuntamente con el segundo y tercer giros extracelulares (ECL) del MC4R sobre el MC1R confiere sensibilidad a ACTH al receptor quimérico. Basándonos en los modelos estructurales de la interacción de diversos agonistas con el MC4R, nuestros resultados otorgan luz sobre la relación funcional entre la MRPA2a y el MC4R y permiten inferir modelos de interacción especulativos. Resultados transcriptómicos previos del grupo de investigación habían sugerido la participación del sistema de melanocortinas en la regulación del reloj circadiano, por tanto, nuestro siguiente objetivo fue demostrar esta interrelación. Para ello utilizamos el paradigma de la actividad locomotora circadiana habitualmente utilizada para el estudio de los ritmos circadianos. En primer lugar, y para poner a punto el sistema de registro de la actividad, estudiamos las diferencias de actividad locomotora entre grupos aislados de machos y hembras mostrando que bajo estas condiciones de aislamiento los ritmos de actividad locomotora son dependientes del sexo, además también demostramos que la administración oral de esteroides opuestos al sexo fenotípico, es decir estradiol en machos y 11-ceto-androstenediona (como precursor de la 11- cetotestosterona) en hembras, revertía parcialmente los efectos del sexo sobre el perfil locomotor. Finalmente quisimos estudiar la posible interacción del sistema de melanocortinas y la regulación del reloj circadiano demostrando que la sobreexpresión de antagonistas endógenos en modelos de transgénesis en el pez cebra modifica el patrón de actividad de los animales. Los animales transgénicos exhiben una mayor actividad significativa especialmente durante el periodo nocturno. Estos datos concuerdan con datos ya publicados por nuestro grupo de investigación donde se demuestra la ausencia de diferencias significativas en los niveles de melatonina entre el día y la noche en animales transgénicos. / [CA] El sistema de melanocortines és un sistema hormonal crític en la resposta a l’estrès i el control del balanç energètic. Els seus pèptids agonistes, les hormones estimuladores dels melanòcits (MSHs) i l’hormona adrenocorticotropa (ACTH) estan codificats en un precursor comú denominat proopiomelanocortina (POMC). Els seus efectes es mesuraven a través de 5 receptors (MCRs) que exhibeixen farmacologies i dominis d’expressió particulars. Els efectes dels agonistes són contrarestats per lacció de dos antagonistes endògens, la proteïna de senyalització agutí (ASIP) i la proteïna relacionada amb agutí (AGRP), que poden actuar com agonistes inversos dels receptors activats constitutivament. Per a augmentar la complexitat del sistema hormonal existeixen dos proteïnes accessòries dels receptors de melanocortines (MRAPs) que interaccionen físicament amb els receptors per a permetre (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R) l’expressió funcional dels receptors. La MRAP1 és imprescindible per la migració a la membrana plasmàtica del MC2R mentres que la MRAP2 interactúa amb la resta de receptors per a modular la seua activitat. Experiments anteriors van demostrar que, en el peix zebra, un dels dos paràlegs de MRAP2 (MRAP2a) és capaç d’interactuar amb el MC4R, un receptor canònic de la MSH, transformant-lo en un receptor d’ACTH. Els experiments recollits en aquesta tesis doctoral demostren que aquesta funció s’ha conservat evolutivament i aquesta conservació evolutiva suggereix l’existència d’un rol fisiològic per a la interacció MRAP2-MC4R. Aquest rol pot estar relacionat amb la transmissió d’informació des de l’eix hipotàlam-hipòfisis-interenal que regula la resposta a l’estrès cap als sistemes centrals que control·len el balanç energètic. A més a més, proposem que l’esmentada interacció oferta un mecanisme molecular potencial per l’explicació dels beneficis de la teràpia amb ACTH en síndrome d’espasmes infantils. El nostre segon objectiu fou caracteritzar molecularment la interacció entre ambdues proteïnes (MRPA2 y MC4R) utilitzant una estratègia de receptors quimèrics. Experiments previs al nostre laboratori havien demostrat que la interacció MRAP2a-MC1R no provocaven una alteració farmacològica del receptor. Per tant, la nostra estratègia fou substituir diferents dominis del MC4R per aquells homòlegs del MC1R esperant una pèrdua de funció, és dir una pèrdua de la sensibilitat a ACTH induïda per la MRPA2a en el receptor quimèric. Una vegada detectats aquests dominis fonamentals optem per l’estratègia contrària, és a dir, la substitució de dominis del MC1R per aquells homòlegs del MC4R esperant una ganància de funció. Els resultats demostren que la substitució conjunta dels dominis transmembranals (TM) 3, 5 i 7 conjuntament amb el segon i tercer girs extracelulars (ECL) del MC4R sobre el MC1R confereix sensibilitat a ACTH al receptor quimèric. Basant-nos en els models estructurals de la interacció de diversos agonistes amb el MC4R els nostres resultats atorguen llum sobre la relació funcional entre la MRPA2a i el MC4R i permiteixen inferir models d’interacció especulatius. Resultats transcriptòmics previs del grup d’investigació havien suggerit la participació del sistema de melanocortines en la regulació del rellotge circadià, per tant, el nostre següent objectiu fou demostrar aquesta interrelació. Per a això utilitzem el paradigma de l’activitat locomotora circadiana habitualment utilitzada per l’estudi dels ritmes circadians. En primer lloc, i per posar a punt el sistema de registre de l’activitat, estudiem les diferències d’activitat locomotora entre grups aïllats de mascles i femelles mostrant que baix aquestes condicions d’aïllament els ritmes d’activitat locomotora són dependents del sexe, a més a més també demostrem que l’administració oral de esteroïdes oposats al sexe fenotípic, és a dir estradiol en mascles i 11-ceto-androstenediona (com a precursor de la 11- cetotestosterona) en femelles, revertia parcialment els efectes del sexe sobre el perfil locomotor. Finalment vam voler estudiar la possible interacció del sistema de melanocortines i la regulació del rellotge circadià demostrant que la sobreexpressió d’antagonistes endògens en models de transgènesis en el peix zebra modifica el patró d’activitat dels animals. Els animals transgènics exhibeixen una major activitat significativa especialment durant el període nocturn. Aquestes dades concorden amb dades publicades anteriorment pel nostre grup d’investigació on es demostra l’absència de diferències significatives en els nivells de melatonina entre el dia i la nit en animals transgènics. / [EN] Melanocortin system is a key hormonal system in the regulation of stress response and the control of energy balance. Peptide agonist, the melaninstimulating hormones (MSHs) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) are encoded in a common precursor named proopiomelancortin (POMC). Their effects are mediated through five receptors that exhibit different expression domains and pharmacological properties. Agonist effects are counterbalanced by the action of endogenous competitive antagonist, agouti-signalling protein (ASIP) and agoutirelated protein (AGRP) that can also work as inverse agonist at constitutive activated receptors. To increase the complexity of the hormonal system, two melanocortin receptor accessory proteins (MRAPs) physically interplay with the melanocortin receptors to allow (MC2R) or modulate (MC1R, MC3R, MC4R, and MC5R) the functional expression of the receptors. MRAP1 is critical for the MC2R traffic to the plasma membrane whereas MRAP2 interacts with the remaining receptors to modulate their activity. Our previous experiments demonstrated that, in the zebrafish, one of the two MRAP2 paralogues (MRAP2a) is able to physically interact with the MC4R, a canonical MSH receptor, to become an ACTH receptor. Experiments in the doctoral thesis demonstrate that this function is conserved and this evolutionary conservation suggests a physiological role for the MC4R-MRAP2 interaction. This role can be related to the information relay from the hypothalamic-pituitaryinterrenal axis, that regulates the stress response, to the central systems that controls energy balance. In addition, we propose that this interaction can be the molecular substrate explaining the ACTH therapy of the infantile spasm syndrome in humans. One second objective was to molecularly characterize the interaction between both proteins (MC4R and MRAP2a) using a receptor quimeras strategy. Previous experiments in our lab demonstrated that the interaction of MRAP2a with MC1R cannot modify the pharmacological profile of the receptor. Therefore, our strategy was to exchange different receptor domains of the MC4R with those homologues in the MC1R looking for a loss of function, i.e. a loss of the MRAP2ainduced ACTH sensitivity. Once characterized the main domains responsible for a loss of function in the MC4R quimeras, we follow the opposite strategy, i.e. exchange the critical domains of MC4R into MC1R waiting for a gain of function in the new MC1R quimeras. Our results demonstrate that integrated substitution of the transmembrane domains (TM) 3, 5, and 7 together with the external loops (ECL) 2 and 3 provides ACTH sensitivity to the new MC1R quimeras. Following several structural models of the interaction between different agonists with the melanocortin receptors, our results provides some light on the functional relationship between MRAP2a and MC4R and allow to infer some interactive and speculative models. Previous transcriptomic results in the research group suggested the involvement of the melanocortin system in the regulation of circadian clock, therefore, our following objective was to demonstrate this interaction. To that, we use the circadian locomotor activity paradigm usually utilized for the study of circadian rhythms. First and with the aim to set up the recording systems we studied the potential differences between the locomotor activity patterns between isolated groups of males and females showing that under these conditions of grouped-sex isolation the locomotor activity is sex-dependent, moreover we also demonstrate that the oral administration of opposed sex steroids to the phenotypic sex, i.e. 17-estradiol to males and 11-ketoandrostenedione (as 11-keto-testosterone precursor) to females was able to revert the sex effects on locomotor pattern. Finally, we wanted to study the potential interaction of the melanocortin system and the regulation of circadian clock using the previous setup thus demonstrating that the overexpression of ASIP in transgenic models modifies the locomotor activity. The transgenic animals exhibit higher global activity specially during the nocturnal period. These data are in well-agreement with those previously reported by our research group showing the absence of significant differences between brain melatonin levels during the light and dark period of the photoperiod in transgenic animals. / La presente Tesis Doctoral llevada a cabo en el Departamento de Fisiología de peces y biotecnología del Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC); se realizó con la ayuda del apoyo económico del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. Lucía Soletto Esteban ha sido beneficiaria de un contrato de Formación de Personal Investigador (FPI) ( BES-2014-070372) para la realización del proyecto “Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad” (AGL2013-46448-C3-3-R). Parte de la financiación ha sido obtenida de proyectos de investigación entre los cuales destaca: “Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los mecanismos temporales y conductuales de peces” (MELANOCONDUCT) (AGL2016-74857-C3-3-R) Proyectos I+D+I, RETOS. Parte del trabajo experimental fue realizado en colaboración con el Prof. Nicholas S. Foulkes, del Instituto de Toxicología y Genética (ITG) del Instituto Tecnológico de Karlsruhe (KIT) de Alemania. Los fondos económicos para la realización de esta estancia breve de investigación fueron proporcionados por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (EEBB-I-16-11803). / Soletto Esteban, L. (2020). Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/152296 / TESIS

Existem 2 análogos sintéticos do hormônio estimulante de melanócitos na fração alfa (α-MSH): o melanotan I (MT-I) e o melanotan II (MT-II). O MT-II é uma droga utilizada comercialmente que age sobre o metabolismo energético, relacionando-se principalmente com o controle da ingestão alimentar e da massa corporal. Além desses efeitos, em seres humanos e em roedores, é capaz de produzir ereção peniana de forma espontânea. As funções do MT-I são menos conhecidas. Este estudo verificou a ação do análogo do MT-II, o Melanotan I, pela realização dos testes de Preferência ou Motivação Sexual e Desempenho Sexual. Foram avaliados 3 grupos (grupo teste –injetado intracerebroventricularmente - ICV- com 1μg de melanotan I diluído em 5 μl de água destilada, grupo controle – injetado ICV com 1μg de melanotan II diluído em 5 μl de água destilada e grupo controle negativo – injetado ICV com 1μg de γ-MSH diluído em 5 μl de água destilada). O teste de desempenho sexual verificou que o MT-I foi capaz de produzir ereções penianas nos animais avaliados, porém em menores proporções (36% dos animais) que o conhecido análogo MT-II (65% dos animais testados). A média do total de ereções (± EPM), ocorridas durante os 60 minutαs de observação após a injeção do MT-I, também se revelou inferior à provocada após a injeção do MT-II (1,6 ± 0,6 versus 5,2 ± 1,1) Observou-se que o MT-I reduziu a preferência sexual do macho por fêmea sexualmente ativa, uma medida de motivação sexual. O conjunto dos resultados deste trabalho permite concluir que o MT-I atua sobre o circuito neural do comportamento sexual de ratos machos, no entanto de forma menos efetiva que o MT-II com relação ao desempenho sexual (ereção). O MT-I injetado intracerebroventricularmente (ICV) surpreendentemente afetou negativamente a motivação sexual, nem o MT-II nem o γ-MSH afetaram esse comportamento.

Existem 2 análogos sintéticos do hormônio estimulante de melanócitos na fração alfa (α-MSH): o melanotan I (MT-I) e o melanotan II (MT-II). O MT-II é uma droga utilizada comercialmente que age sobre o metabolismo energético, relacionando-se principalmente com o controle da ingestão alimentar e da massa corporal. Além desses efeitos, em seres humanos e em roedores, é capaz de produzir ereção peniana de forma espontânea. As funções do MT-I são menos conhecidas. Este estudo verificou a ação do análogo do MT-II, o Melanotan I, pela realização dos testes de Preferência ou Motivação Sexual e Desempenho Sexual. Foram avaliados 3 grupos (grupo teste –injetado intracerebroventricularmente - ICV- com 1μg de melanotan I diluído em 5 μl de água destilada, grupo controle – injetado ICV com 1μg de melanotan II diluído em 5 μl de água destilada e grupo controle negativo – injetado ICV com 1μg de γ-MSH diluído em 5 μl de água destilada). O teste de desempenho sexual verificou que o MT-I foi capaz de produzir ereções penianas nos animais avaliados, porém em menores proporções (36% dos animais) que o conhecido análogo MT-II (65% dos animais testados). A média do total de ereções (± EPM), ocorridas durante os 60 minutαs de observação após a injeção do MT-I, também se revelou inferior à provocada após a injeção do MT-II (1,6 ± 0,6 versus 5,2 ± 1,1) Observou-se que o MT-I reduziu a preferência sexual do macho por fêmea sexualmente ativa, uma medida de motivação sexual. O conjunto dos resultados deste trabalho permite concluir que o MT-I atua sobre o circuito neural do comportamento sexual de ratos machos, no entanto de forma menos efetiva que o MT-II com relação ao desempenho sexual (ereção). O MT-I injetado intracerebroventricularmente (ICV) surpreendentemente afetou negativamente a motivação sexual, nem o MT-II nem o γ-MSH afetaram esse comportamento.

Existem 2 análogos sintéticos do hormônio estimulante de melanócitos na fração alfa (α-MSH): o melanotan I (MT-I) e o melanotan II (MT-II). O MT-II é uma droga utilizada comercialmente que age sobre o metabolismo energético, relacionando-se principalmente com o controle da ingestão alimentar e da massa corporal. Além desses efeitos, em seres humanos e em roedores, é capaz de produzir ereção peniana de forma espontânea. As funções do MT-I são menos conhecidas. Este estudo verificou a ação do análogo do MT-II, o Melanotan I, pela realização dos testes de Preferência ou Motivação Sexual e Desempenho Sexual. Foram avaliados 3 grupos (grupo teste –injetado intracerebroventricularmente - ICV- com 1μg de melanotan I diluído em 5 μl de água destilada, grupo controle – injetado ICV com 1μg de melanotan II diluído em 5 μl de água destilada e grupo controle negativo – injetado ICV com 1μg de γ-MSH diluído em 5 μl de água destilada). O teste de desempenho sexual verificou que o MT-I foi capaz de produzir ereções penianas nos animais avaliados, porém em menores proporções (36% dos animais) que o conhecido análogo MT-II (65% dos animais testados). A média do total de ereções (± EPM), ocorridas durante os 60 minutαs de observação após a injeção do MT-I, também se revelou inferior à provocada após a injeção do MT-II (1,6 ± 0,6 versus 5,2 ± 1,1) Observou-se que o MT-I reduziu a preferência sexual do macho por fêmea sexualmente ativa, uma medida de motivação sexual. O conjunto dos resultados deste trabalho permite concluir que o MT-I atua sobre o circuito neural do comportamento sexual de ratos machos, no entanto de forma menos efetiva que o MT-II com relação ao desempenho sexual (ereção). O MT-I injetado intracerebroventricularmente (ICV) surpreendentemente afetou negativamente a motivação sexual, nem o MT-II nem o γ-MSH afetaram esse comportamento.

Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortinas es un sistema hormonal, autocrino, paracrino y endocrino compuesto por agonistas (hormonas), receptores y paradójicamente, por antagonistas del mismo sistema. A estos componentes del sistema se le ha adicionado recientemente sus proteínas accesorias, las cuales conforman un nuevo punto de regulación conocido. La actividad de este sistema hormonal está relacionada con diversas funciones fisiológicas que incluyen principalmente: el control de la pigmentación, la regulación del balance energético y la regulación de la respuesta al estrés. Los experimentos realizados en el laboratorio donde he desarrollado mi tesis doctoral, fueron pioneros en la descripción de las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) en peces. Durante la experimentación se demostró la existencia de dos proteínas accesorias en el genoma del pez cebra (MRAP1 y MRAP2), la segunda de las cuales está duplicada en esta especie (MRAP2a y MRAP2b), modelo que ha sido utilizado en la experimentación presentada. La MRAP1 interacciona con el receptor 2 de melanocortinas (MC2R) para permitir su expresión funcional, pero la función de las MRAP2s era desconocida y acotar su función ha sido el principal objetivo de la tesis doctoral. Los resultados presentados demuestran que el MC2R de la lubina también requiere de la interacción con MRAP1 para poder responder a la hormona adrenocorticotropa (ACTH), adquiriendo así su expresión funcional. Además, demostramos que los glucocorticoides son capaces de inhibir la expresión del MC2R en las glándulas interrenales, lo que supone un mecanismo de retroalimentación con posible relevancia en la adaptación al estrés. Por su parte las MRAP2 no tienen efectos sobre la actividad del MC2R, pero como demostramos en la tesis doctoral, la MRAP2a, pero no la MRPA2b, es capaz de convertir al MC4R, un receptor canónico de la hormona estimuladora de los melanocitos (MSH) expresado en el cerebro, en un receptor de ACTH. La ACTH se libera desde la hipófisis en respuesta a estímulos hipotalámicos que integran información relativa a condiciones estresantes. Mientras que el MC4R está fundamentalmente implicado en el control central de la regulación de la ingesta. Por tanto, la modificación del perfil farmacológico del MC4R tras interacción con MRAP2a otorga un mecanismo molecular para la integración de la información del estrés sobre los circuitos centrales que controlan la ingesta. Es decir, otorga una base molecular directa para las relaciones estrés-ingesta. Este cambio del perfil farmacológico no se observa tras la interacción con el MC1R ni con el MC5R, si bien la interacción MC1R-MRAP2a provoca una disminución de la sensibilidad del receptor a la MSH. Finalmente, hemos caracterizado la respuesta central y periférica del pez cebra al estrés agudo evaluando los niveles de expresión de diversos componentes del sistema de melanocortinas y demostrando la sensibilidad de este sistema a los elementos estresantes. / [EN] The melanocortin system is an endocrine, paracrine and autocrine hormonal system composed by agonist (hormones), receptors, and atypically endogenous antagonists. Recently, the so-called melanocortin receptor-accessory proteins (MRAPs) have been integrated as a part of the system. These proteins conform a new regulatory point of the system. The activity of the hormonal system is related to several physiological functions including control of pigment patters as well as the regulation of energy balance and the stress response. Experiments done in the lab in which I have run my PhD studies were pioneer in the description of fish MRAPs. It was demonstrated that the genome of zebrafish includes two accessory proteins (MRAP1 and MRAP2) and the second one is duplicated into MRAP2a and MRAP2b forms. MRAP1 interacts with the melanocortin 2 receptor (MC2R) allowing its functional expression but the function of MRAP2 was unknown and delimiting its function has been the main objective of this doctoral thesis. Results demonstrated that sea bass MC2R also requires the interaction with MRAP1 in order to be activated by the adrenocorticotropic hormone (ACTH), reaching therefore its functional expression. We also demonstrated that glucocorticoids are able to inhibit MC2R expression in the interrenal tissue suggesting the existence of a negative feedback with potential relevance in the stress adaptation. The MPRA2 has no effects on MC2R activity, but as we demonstrate, the MRAP2a, but not MRAP2b, in able to transform the MC4R, a canonical melanocyte- stimulating hormone (MSH) receptor expressed in the brain, into an ACTH receptor. ACTH is released form the pituitary in response to stressful stimuli integrated in the hypothalamus. On the other hand, MC4R is mainly involved in the central control of food intake and energy balance. Therefore, the MC4R pharmacological profile after interaction with MRAP2a provides a molecular mechanism for the integration of stress information into the central circuits controlling energy balance. That means, molecular basis for the stress-food intake interaction. This pharmacological modification seems to be specific for MC4R since the interaction of MRAP2a with MC5R or MC1R does not provide ACTH sensitivity to the receptor. However, MC1R-MRAP2a interaction induces a decrease in the sensibility of the receptor to MSH. Finally, we have characterized the central and peripheral response of zebrafish to acute stress by evaluating the expression levels of several components of the melanocortin system thus demonstrating the sensibility of this system to stressful agents. / [CA] El sistema de melanocortines és un sistema hormonal, autocrí, paracrí i endocrí compost per agonistes (hormones), receptors i paradóxicament, per antagonistes del mateix sistema. A aquests components del sistema se'ls ha addicionat recentement les seues proteïnes accesòries, les quals conformen un noa punt de regulació conegut. L'activitat d'aquest sistema hormonal està relacionada amb diverses funcions fisiològiques que inclouen principalment: el control de la pigmentació, la regulació del balanç energètic i la regulació de la resposta a l'estrès. Els experiments realitzats al laboratori on he desenvolupat la meua tesi doctoral, van ser pioners en la descripció de les proteïnes accesòries dels receptors de melanocortines (MRAPs) en peixos. Durant l'experimentació se va demostrar l'existència de dues proteïnes accesòries en el genoma del peix zebra (MRAP1 y MRAP2), la segona de les quals està duplicada en aquesta espècie (MRAP2a y MRAP2b), model que ha sigut utilitzat en l'experimentació presentada. La MRAP1 interacciona amb el receptor 2 de melanocortines (MC2R) per a permetre la seua expressió funcional, però la funció de les MRAP2s era desconeguda i acotar la seua funció ha sigut el principal objectiu de la tesi doctoral. Els resultats presentats demostren que el MC2R del llobarro també requeireix de la interacció amb MRAP1 per a poder respondre a la hormona adrenocorticotropa (ACTH), adquirint així la seua expressió funcional. A més a més, demostrem que els glucocorticoides son capaços d'inhibir l'expressió del MC2R a les glàndules interrenals, la qual cosa suposa un mecanisme de retroalimentació amb possible relevància en l'adaptació a l'estrès. Per la seua part les MRAP2 no tenen efectes sobre l'activitat del MC2R, però com demostrem a la tesi doctoral, la MRAP2a, però no la MRPA2b, és capaç de convertir al MC4R, un receptor canònic de la hormona estimuladora dels melanocitos (MSH) expressat en el cervell, en un receptor de ACTH. La ACTH es allibera des de la hipòfisi com a resposta a estímuls hipotalàmics que integren informació relativa a condicions estressants. Mentres que el MC4R està fonamentalment implicat en el control central de la regulació de la ingesta. Per tant, la modificació del perfil farmacològic del MC4R tras interacció amb MRAP2a atorga un mecanisme molecular per la integració de la informació de l'estrès sobre els circuits centrals que controlen la ingesta. És a dir, atorga una base molecular directa per a les relacions estrès-ingesta. Aquest canvi del perfil farmacològic no s'observa tras la interacció amb el MC1R ni amb el MC5R, encara que la interacció MC1R-MRAP2a provoca una disminució de la sensibilitat del receptor a la MSH. Finalment, hem caracteritzat la resposta central i perifèrica del peix zebra a l'estrès agut avaluant els nivels d'expressió de diversos components del sistema de melanocortines i demostrant la sensibilitat d'aquest sistema als elements estressants. / La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a la obtención de una beca predoctoral FPI (BES-2011-048425) y gracias a la financiación obtenida del proyecto “Participación de las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPS) en la regulación de la respuesta al estrés en peces (AGL2010-22247-C03-01)” del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Así como otros proyectos de investigación obtenidos por mi director de tesis doctoral entre los cuales destacan: Mejora de la producción en acuicultura mediante herramientas de biotecnología” (Aquagenomics) (CSD2007-00002) e “Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación del crecimiento de peces: estudio de las interacciones estrés-ingesta (MELANOGROWTH) AGL2013-46448-C3-3-R, Proyectos I+D+I, RETOS. / Cortés Barrera, RA. (2020). Implicación de la MRAP2s en el sistema de melanocortinas de peces usando como modelos a la lubina europea y el pez cebra [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/147861 / TESIS / Compendio

Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortinas es un complejo sistema hormonal implicado en la regulación de diversas funciones fisiológicas. Todas las melanocortinas derivan de un mismo precursor peptídico denominado proopiomelanocortina (POMC), en el que están integradas las diferentes hormonas estimuladoras de los melanocitos (MSHs), la hormona adrenocorticotropa (ACTH), y el péptido opioide ¿-endorfina. Las melanocortinas señalizan a través de 5 receptores (MC1R-MC5R), con diferentes grados de especificidad hormona-receptor, lo que supone un buen ejemplo de su coevolución. El sistema de melanocortinas es el único sistema hormonal que presenta antagonistas endógenos: la proteína de señalización agouti (ASIP) y la proteína relacionada con agouti (AGRP). En mamíferos, ASIP actúa como un antagonista de MC1R. La modificación de la señalización del MC1R desequilibra la síntesis de pigmentos en el folículo piloso, potenciando la síntesis de feomelanina (pigmento amarillo-naranja) en lugar de eumelanina (pigmento negro-marrón). La expresión tegumentaria de ASIP es responsable del patrón de pigmentación dorso-ventral polarizado que tienen muchas especies de mamíferos. Esta polaridad puede observarse incluso cuando la especie presenta patrones más complejos. AGRP actúa como antagonista de MC4R, uno de los receptores de sistema nervioso central implicados en el control del metabolismo energético; a través de la regulación de la saciedad. Se ha demostrado que ASIP es capaz de antagonizar la actividad del MC4R, lo que no ocurre en condiciones normales, ya que ASIP sólo se expresa de forma local en el tegumento, y nunca alcanza el MC4R cerebral. En la cepa de ratones mutantes yellow [A(vy)/a], la expresión de ASIP queda bajo el control de un promotor de expresión ubicua que permite su síntesis en todos los tejidos incluyendo el cerebro, accediendo al MC4R central. El bloqueo/disminución de la actividad constitutiva del MC4R en esta cepa de ratones, disminuye la sensación de saciedad, aumentando los niveles de ingesta que conllevan una tasa de crecimiento, mayor pero también el desarrollo de obesidad. En los peces teleósteos los antagonistas endógenos del sistema de melanocortinas están duplicados debido a una tercera duplicación genómica (R3) específica de su rama evolutiva. Los cuatro péptidos antagonistas se identificaron inicialmente como ASIP1, ASIP2, AGRP1, y AGRP2. El principio de parsimonia asocia la expresión polarizada de ASIP1 en el tegumento de estos peces con el desarrollo del patrón de pigmentación dorsoventral que se puede observar en muchas especies y la expresión hipotalámica de AGRP1 con el control de la ingesta. El objetivo de esta tesis doctoral es demostrar la implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de la pigmentación y el balance energético de peces mediante relaciones causas-efecto de sus antagonistas endógenos. Para alcanzar este objetivo, en primer lugar, caractericé los genes ASIP1 en dos especies de peces planos: el rodaballo (Scophthalmus maximus) y el lenguado senegalés (Solea senegalensis). La elección de este grupo de teleósteos se debe a la extrema polaridad pigmentaria dorsoventral que presentan los peces planos, las numerosas malformaciones pigmentarias que aparecen en cultivo, y a la carencia de secuencias génicas caracterizadas de ASIP1 de pleuronectiformes. Los experimentos demostraron que ASIP1 se expresa masivamente en la región ventral y apenas es detectable en la región dorsal. Además, los resultados sugieren que la expresión ectópica de ASIP1 podría ser la responsable del pseudoalbinismo observado en los peces planos de cultivo. En segundo lugar, desarrollamos una nueva línea transgénica de peces cebra (Danio rerio) (tgASIP1) que expresa el gen ASIP1 de pez dorado (Carassius auratus) de forma constitutiva. Esta expresión ubicua rompía la polaridad de la expresión de ASIP1 en el tegumento y, permitía que este antagonista / [CA] El sistema de melanocortines és un complex sistema hormonal implicat en la regulació de diverses funcions fisiològiques. Totes les hormones melanocortines deriven d'un mateix pèptid precursor denominat propiomelanocortina (POMC), al qual estan integrades les diferents hormones estimuladores dels melanocits (MSHs), la hormona adrenocorticotropa (ACTH), i el pèptid opioide ß-endorfina. Les melanocortines senyalitzen a través de 5 receptors (MC1R-MC5R), amb diferents graus d'especificitat hormona-receptor, la qual cosa suposa un bon exemple de coevolució. El sistema de melanocortines és l'únic sistema hormonal que presenta antagonistes endògens: la proteïna de senyalització agouti (ASIP) i la proteïna relacionada con agouti (AGRP). En mamífers, ASIP actua com antagonista de MC1R: La modificasió de la senyalització de MC1R desequilibra la síntesi de pigments en el fol·licle pilós potenciant la síntesi de feomelanina (pigment groc-taronja) en lloc de eumelanina (pigment negre-marró). L'expressió tegumentària de ASIP és la responsable del patró de pigmentació dors-ventral polaritzat que tenen moltes espècies de mamífers. Aquesta polaritat és observable fins i tot quan l'espècia presenta patrons més complexos. AGRP actua com antagonista de MC4R, un dels receptors del sistema nerviós central implicats en el control del metabolisme energètic; en concret a través de la regularització de la sacietat. S'ha demostrat que ASIP és capaç d'antagonitzar l'activitat del MC4R, la qual cosa no succeeixen condicions normals a causa de que ASIP sols s'expressa en el tegument, i mai arriba al MC4R cerebral. En la soca de ratolins mutants yellow A(yy)/a a l'expressió d'ASIP resta baix el control d'un promotor d'expressió ubiqua que permet la síntesi en tots els teixits incloent el cervell, accedint MC4R central. El bloqueig/disminució de l'activitat constitutiva del MC4R en aquesta soca de ratolins, disminueix la sensació de sacietat, augmentant els nivells d'ingesta, produint un major taxa de creixement, però també obesitat. Als peixos teleostis els antagonistes endògens del sistema de melacortines estan duplicats a causa d'una tercera duplicació genòmica (R 3) específica de la seua branca evolutiva. Els quatre pèptids antagonistes en els teleostis foren identificats inicialment com a ASIP1, ASIP2, AGRP1 y AGRP2. El principi de parsimònia associa l'expressió polaritzada de ASIP1 en el tegument d'aquests peixos amb el desenvolupament del patró de pigmentació dors-ventral que es pot observar en moltes espècies; i l'expressió d'AGRP1 al hipotàlem amb el control de la ingesta. L'objectiu d'aquesta tesis doctoral és demostrar l'implicació del sistema de melanocortines en la regulació de la pigmentació i el balanç energètic de peixos mitjançant relacions causa-efecte dels seus antagonistes endògens. Per assolir aquest objectiu, en primer lloc, caracteritzaré ASIP1 en dues espècies de peixos plans: rèmol (Scophthalmus maximus) i el llenguado (Solea senegalensis). L'elecció d'aquest grup de teleostis es deu a l'extrema polaritat de pigmentació dors-ventral presenten els peixos plans, les nombroses malformacions pigmentàries que apareixen en en cultiu, i a la manca de seqüències gèniques caracteritzades d'ASIP1 de Pleuronectiforme. Els experiments demostraren que ASIP1 s'expressa massivament en la regió ventral i a penes és detectable en la regió dorsal. A més a més, els resultats demostren que l'expressió ectòpica d'ASIP1 podria ser la responsable del pseudealbinisme observat en els peixos en cultiu. En segon lloc, vaig desenvolupar una nova línia estratègica de peixos zebra (Danio rerio) (tgASIP1) que expressa el gen ASIP1 de carpa daurada (Carassius auratus) de forma constitutiva. Aquesta expressió ubícua trencava la polaritat de l'expressió d'ASIP1 en el tegument i, permetia que aquest antagonista accedira al MC4R cerebral. L'antagonisme competitiu d'ASIP sobre MC1R i M / [EN] Melanocortin system is a complex hormonal system involved in the regulation of several physiological functions. All melanocortin peptides are encoded by the same precursor called proopiomelanocortin (POMC) that integrates the different melanocyte-stimulating hormones (MSHs), the adrenocorticotropic hormones (ACTH) and the opioid peptide b-endorphin. Melanocortin signals through five different receptors (MC1R-MC5R) with different specificity showing a good example of co-evolutiorary processes. The melanocortin system is unique because the presence of endogenous antagonist the so-called: agouti-signalling protein (ASIP) and agouti-related protein(AGRP). In mammal species, ASIP works as an antagonist of MC1R thus unbalancing the pigment synthesis in the hair follicle from eumelanin (brown-black pigment) to pheomelanin (a yellow-red pigment). ASIP is responsible of the polarized dorsoventral pigment pattern present in most mammalian species. This polarity can be observed even when some other colour patterns are present. On the other hand, AGRP works as an antagonist of MC4R, a central receptor involved in the regulation of energy balance, throughout the regulation of satiety ASIP1 is also able to antagonize MC4R. This interaction does not occurs in the regular situation since ASIP is exclusively expressed in the tegument as a local protein and never reach the central MC4R. In the yellow mutant mouse strain [A(vy)/a], ASIP expression remains under the control of the Rely promotor that allow ubicuosly ASIP expression, including the brain, thus acting on MC4R. Disruption of MC4R signalling decrease satiety sensing thus promoting food intake, obesity and increased linear growth. In teleost fish endogenous antagonist are duplicated thanks to a specific extra genome duplication (R3). The four antagonist are initially identified as AGRP1, AGRP2, ASIP1 and ASIP2. Parsimony principle associated the skin expression of ASIP1 with the ventral pigmentary polarity of many species and the hypothalamic expression of AGRP with the control of food intake. The main goal of this doctoral thesis in to demonstrate the involvement of the melanocortin system in the regulation of pigment patterns and energy balance in fish by means of cause-effect relationships of this endogenous antagonist. To reach this objective, firstly I characterized ASIP1 in two different flatfish species, i.e. turbot (Scophthalmus maximus) and sole (Solea senegalensis). The selection of this teleost group is due to the extreme pigment dorsoventral polarity, the numerous pigment malformations in culture and the absence of characterized ASIP sequences in pleuronectiforms. The experiments demonstrate that ASIP1 is massively expressed in the ventral region and basically undetectable in the dorsal skin. Results also suggest that ectopic ASIP1 expression could be responsible of the flatfish pseudoalbinism. Subsequently, we developed a new transgenic zebrafish (Danio rerio) strain constitutively and ubicuosly overexpressing goldfish (Carassius auratus) ASIP1. The ubicuosly expression would break the dorsoventral polarity of ASIP expression in the tegumentum but also would allow reaching central MC4R. It would me allow to study at the same time the competitive antagonism on MC1R and MC4R and by extension the involvement of the melanocortin system in the regulation of pigmentation and energy balance. The experiments revealed that ASIP1 overexpression induces a ventralization of the dorsal skin by inhibiting the melanophore differentiation thus showing the existence of two differnnt pigment patterns. An ancestral dorsoventral pigment pattern on that the new stripped pattern is overimposed. Both pigment patterns are regulated in a different way since we can modify the dorsoventral pigment pattern without affecting the stripped pattern. In addition, the ubicuosly ASIP expression demonstrate the involvement of melanocortin system in the regulation of food intake and growth in fish. Food intake / La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en su mayor parte con los datos obtenidos gracias a la actividad desarrollada durante el contrato, como titulado medio de actividades técnicas y profesiones en el Instituto de Acuicultura de Torre de la Sal (IATS-CSIC), asociado al proyecto “Mejora de la producción en acuicultura mediante herramientas de biotecnología” (Aquagenomics) (CSD2007-00002), dentro del convenio CONSOLIDER 2010, financiado por el Ministerio de ciencia e Innovación y coordinado por el Dr. Antonio Figueras. Además, también se han utilizado recursos y resultados de los proyectos “Activación del sistema central de melanocortinas en la lubina (Dicentrarchus labrax): implicación en los efectos del estrés sobre la ingesta” (AGL2007- 65744-C03-02) financiado por el del Ministerio de Ciencia e Innovacion dentro de las ayudas del Ministerio a proyectos I+D y coordinado por el Dr. Jesús Miguez; y “Bases moleculares de la malformaciones pigmentarias en peces: Implicación en el cultivo de peces planos” (Incite09 402 193 PR) financiado por la Xunta de Galicia dentro del marco de ayudas a la Investigación Básica de la Xunta Gallega y dirigido por el Dr. Josep Rotllant. / Guillot Miralles, RV. (2019). IMPLICACIÓN DEL SISTEMA DE MELANOCORTINAS EN LA REGULACIÓN DE LA PIGMENTACIÓN Y EL CRECIMIENTO DE LOS PECES: PAPEL DE LOS ANTAGONISTAS ENDÓGENOS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/134059 / TESIS / Compendio

Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortina es una estructura clave en la regulación de una amplia gama de funciones fisiológicas que incluyen la melanogénesis, la respuesta al estrés y el equilibrio energético, mediante la unión a una familia de receptores acoplados a la proteína G específicos (MC1R-MC5R). La sobreexpresión de agonistas inversos, la proteína de señalización agutí (Asip) y la proteína relacionada con agutí (Agrp) da como resultado un aumento de la ingesta de alimentos, de crecimiento lineal y de peso corporal. Asip regula la polaridad de pigmentación dorsoventral a través del MC1R, y la sobreexpresión induce obesidad en ratones al unirse al Mc4r central. La sobreexpresión de asip1 en el pez cebra transgénico (asip1-Tg) mejora el crecimiento, sin afectar la acumulación lipídica (obesidad), incluso cuando se alimentan bajo regímenes inductores severos. Los peces asip1-Tg no necesitan comer más para crecer más y más rápido, lo que sugiere una mayor eficiencia alimentaria. Además, los peces asip1-Tg criados en alta densidad son capaces de crecer mucho más que los peces de tipo salvaje (WT) criados en baja densidad, aunque los peces asip1-Tg parecen ser más sensibles al estrés por hacinamiento que los peces WT. El análisis transcriptómico comparativo del intestino de asip1-Tg refleja una expresión diferencial de transportadores aminoácidicos, monocarboxilatos, transportadores iónicos y de vitaminas. La sobreexpresión reduce la integridad del epitelio intestinal aumentando su permeabilidad paracelular y potencia el transporte electrogénico de aminoácidos. Así, los peces transgénicos poseen mayor capacidad para la absorción de nutrientes y, por extensión una mejora en la eficiencia alimenticia que podría explicar, en parte, ese crecimiento diferencial bajo tasas de ingesta similares. Esta tesis tuvo también como objetivo investigar si los asip1-Tg mantienen un fenotipo dominante asociado con una mayor tasa de alimentación. Los resultados muestran, por el contrario, un carácter reactivo/subordinado en los asip1-Tg que aboga por una participación del sistema de melanocortinas en la regulación del comportamiento de peces. El perfil subordinado de los animales asip1-Tg, junto con una activación del eje del estrés, sugiere que estos animales pueden mostrar un comportamiento de ansiedad. Los resultados indicaron que los peces asip1-Tg muestran un comportamiento de ansiedad que además relacionado con una severa disminución de los niveles centrales de serotonina (5HT) y dopamina y elevación de su recaptación neuronal y degradación. La administración de un inhibidor de la recaptación de 5HT, recupera el fenotipo comportamental salvaje, mitigando el comportamiento de ansiedad en los peces transgénicos y rescatando los niveles de 5HT. Esta ansiedad podría repercutir en una alteración del comportamiento locomotor de los animales, por ello estudiamos los ritmos circadianos de actividad locomotora. Los resultados muestran que los animales asip1-Tg exhiben una disrupción completa del ritmo de actividad, con una actividad muy elevada, especialmente durante la noche. Esta disrupción es concomitante con una desaparición del ritmo diario de serotonina y melatonina. Además, los resultados muestran una pérdida de ritmos de expresión de genes reloj (per1a y clock1a). La incubación, in vitro, de glándulas pineales con Asip1 produjo una inhibición de la secreción de melatonina replicando los resultados obtenidos in vivo y demostrando un efecto directo de Asip1, sobre la fisiología de la pineal. En esta tesis, se utilizó el pez cebra como modelo para investigar los efectos de la obesidad sobre la ansiedad y la memoria. La obesidad no tuvo ningún efecto sobre la ansiedad, pero produjo una disminución de la memoria a corto plazo, estudiada mediante test de condicionamiento aversivo. Este estudio proporciona, un protocolo fiable para evaluar el efecto de las enfermedades metabólica en la función cognitiva y conductual. / [CA] El sistema de melanocortina és una estructura clau en la regulació d'una ampla gamma de funcions fisiològiques que inclouen la melanogènesi, la resposta a l'estrès i l'equilibri energètic, mitjançant la unió a una família de receptors acoblats a la proteïna G específics (MC1R-MC5R). La sobreexpressió d'agonistes inversos, la proteïna de senyalització agutí (Asip) y la proteïna relacionada con agutí (Agrp) dona com a resultat un augment de la ingesta d'aliments, de creixement lineal i de pes corporal. Asip regula la polaritat de pigmentació dors-ventral a través del MC1R, y la sobreexpressió indueix obesitat en ratolins en unir-se al MC4R central. La sobreexpressió de asip1 en el peix zebra transgènic (asip1-Tg) millora el creixement, sense afectar l'acumulació lipídica (obesitat), inclús quan s'alimenten sota règims inductors severs. Los peces asip1-Tg no necessiten menjar més per a créixer més i més ràpid, lo qual suggereix una major eficiència alimentària. A més a més, els peixos asip1-Tg criats en alta densitat són capaces de créixer molt més que els peixos de tipus salvatge (WT) criats en baixa densitat, malgrat que els peixos asip1-Tg semblen ser més sensibles a l'estrès per amuntegament que els peixos WT. L'anàlisi transcriptòmic comparatiu de l'intestí de asip1-Tg reflecteix una expressió diferencial de transportadors aminoacídics, monocarboxilats, transportadors iònics i de vitamines. La sobreexpressió redueix la integritat de l'epiteli intestinal augmentant la seua permeabilitat paracel·lular i potencia el transport electrogènic d'aminoàcids. Per tant, els peixos transgènics posseeixen major capacitat per l'absorció de nutrients i, per extensió una millora en la eficiència alimentària que podria explicar, en part, eixe creixement diferencial sota taxes d'ingesta similars. Aquesta tesi tingué també com a objectiu investigar si els asip1-Tg mantenien un fenotip dominant associat amb una major taxa d'alimentació. Els resultats mostren, pel contrari, un caràcter reactiu/subordinat en los asip1-Tg que advoca per una participació del sistema de melanocortines en la regulació del comportament de peixos. El perfil subordinat dels animals asip1-Tg, junt amb una activació de l'eix de l'estrès, suggereix que aquests animals poden mostrar un comportament d'ansietat. Els resultats indicaren que els peixos asip1-Tg mostren un comportament d'ansietat relacionat amb una severa disminució dels nivells centrals de serotonina (5HT) i dopamina i elevació de la seua recaptació neuronal i degradació. L'administració de un inhibidor de la recaptació de 5HT recupera el fenotip comportamental salvatge, mitigant el comportament d'ansietat en els peixos transgènics i rescatant els nivells centrals de 5HT. Esta ansietat podria repercutir en una alteració del comportament locomotor dels animals, per la qual cosa vam estudiar els ritmes circadians d'activitat locomotora. Els resultats mostren que els animals asip1-Tg exhibeixen una disrupció completa del ritme d'activitat, amb una activitat molt elevada durant tot el cicle diari, especialment durant la nit. Esta disrupció es concomitant amb una desaparició del ritme diari de serotonina i melatonina. A més a més, els resultats mostren una pèrdua de ritmes de expressió de gens rellotge (per1a y clock1a). La incubació, in vitro, de glàndules pineals con Asip1 va produir una inhibició de la secreció de melatonina replicant els resultats obtinguts in vivo y demostrant un efecte directe de Asip1 sobre la fisiologia de la pineal. En esta tesi, se va utilitzar el peix zebra com a model per investigar els efectes de la obesitat sobre la ansietat i la memoria. L'obesitat no va tindre cap efecte sobre l'ansietat, però va produir una disminució de la memòria a curt termini, estudiada mitjançant tests de condicionament aversiu. Aquest estudi proporciona, un protocol fiable per a avaluar l'efecte de les malalties metabòliques en la funció cognitiva i conductual. / [EN] The melanocortin system plays a key role in the regulation of a wide range of physiological functions including melanogenesis, stress response and energy balance, through binding to a family of specific G protein-coupled receptors (MC1R-MC5R). Overexpression of inverse agonists, agouti-signalling protein (Asip) and agouti-related protein (Agrp) results in increased food intake, linear growth and body weight. Asip regulates dorso-ventral pigmentation polarity through MC1R, and over-expression induces obesity in mice by binding to the central MC4R. Overexpression of asip1 in transgenic zebrafish (asip1-Tg) enhances growth, without affecting lipid accumulation (obesity), even when fed under severe inducing regimens. The asip1-Tg fish do not need to eat more to grow bigger and faster, suggesting increased feed efficiency. In addition, asip1-Tg fish reared at high density are able to grow much larger than wild-type (WT) fish reared at low density, although asip1-Tg fish appear to be more sensitive to overcrowding stress than WT fish. Comparative transcriptomic analysis of asip1-Tg gut reflects differential expression of amino acid, monocarboxylate, ionic and vitamin transporters. Overexpression reduces the integrity of the intestinal epithelium by increasing its paracellular permeability and enhances electrogenic amino acid transport. Thus, transgenic fish possess a greater capacity for nutrient absorption and, by extension, an improvement in feed efficiency that could explain, in part, this differential growth under similar intake rates. This thesis also aimed to investigate whether asip1-Tg maintain a dominant phenotype associated with a higher feeding rate. Experimental results show, on the contrary, a reactive/subordinate character in asip1-Tg which argues for an involvement of the melanocortin system in the regulation of fish behaviour. Improving feeding motivation without promoting aggression in fish, thus avoiding the threat to native populations in case of an escape, makes the inhibition of the melanocortin system, through the overexpression of asip1, a feasible target for the development of genetically modified lines. The subordinate profile of the asip1-Tg animals, together with an activation of the stress axis, suggests that these animals may exhibit anxiety-like behaviour. The results indicated that asip1-Tg fish show a behaviour similar to our concept of anxiety related to a severe decrease in central serotonin (5HT) and dopamine levels as well as the elevation of their neuronal reuptake and degradation. The administration of fluoxetine, a serotonin reuptake inhibitor, recovers the wild-type behavioural phenotype, mitigating anxiety behaviour in transgenic fish and restoring central 5HT levels. This anxiety could have repercussions on the locomotor behaviour of the animals, so we studied circadian rhythms of locomotor activity. The results show that asip1-Tg animals exhibit a complete disruption of the activity rhythm, with very high activity levels throughout the daily cycle, especially during the night. This disruption is concomitant with a disappearance of the daily rhythm of serotonin and melatonin. In addition, the results show a loss of clock gene expression rhythms (per1a and clock1a). Incubation, in vitro, of pineal glands with Asip1 produced an inhibition of melatonin secretion replicating the results obtained in vivo and demonstrating a direct effect of Asip1 on pineal physiology. In this PhD thesis, zebrafish was used as a model to investigate the effects of overfeeding-induced obesity on anxiety-like behaviour and memory. Obesity had no effect on anxiety, but produced a decrease in short-term memory, studied by means of aversive conditioning tests. This study also provides a reliable protocol for assessing the effect of metabolic diseases on cognitive and behavioural function, supporting zebrafish as a model for cognitive and behavioural neuroscience. / Esta tesis ha sido realizada a través del programa de ‘Ayudas para la formación de personal investigador’ (FPI) BES‐2017‐082424 de la Agencia Estatal de Investigación, en Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Grupo de investigación de Control de la Ingesta en Peces dirigido por José Miguel Cerdá Reverter, director de esta tesis. Los trabajos llevados a cabo en esta tesis han sido financiados por Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICIU) a través de los siguientes proyectos: MELANOCONDUCT: Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los mecanismos temporales y conductuales de peces AGL2016-74857-C3-3-R; Cronopeces: Red temática de cronobiología de peces y sus aplicaciones en acuicultura RED2018-102487-T; MacForFish: Nuevos aspectos homeostáticos y comportamentales de la regulación de la ingesta en peces PID2019-103969RB-C33; FISHTASTE: Implicación de los mecanismos sensoriales del gusto en la regulación de la ingesta de peces - Involvement of taste sensing mechanisms in the regulation of feed intake of fish PID2022-136288OB-C33 / Godino Gimeno, A. (2024). Involvement of the Melanocortin System in the Regulation of Circadian and Behavioural Mechanisms in Zebrafish [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203148 / Compendio