Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La vía de señalización del gen Wnt cumple importantes roles en el desarrollo y oncogénesis, es transducido por al menos dos vías: la vía canónica β-catenina dependiente y la cascada no canónica, independiente de β-catenina. La caseína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se le ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos 7 isoformas, de las cuales CK1α, CK1δ, CK1ε Y CK1γ han sido relacionadas con la vía canónica de Wnt. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de CK1γ y wnt3a en el desarrollo embrionario del pez zebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridación in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estos genes se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1γ presenta una expresión ubicua en los primeros estadios. La expresión de wnt3a es evidente desde las 12 horas post fecundación, de forma débil. En estadios más avanzados, ambos genes se expresan fuertemente en la región cefálica y en el primordio de las aletas pectorales. CK1γ además se expresa débilmente en el resto del embrión. Para analizar la función de ambos genes se realizaron estudios de sobreexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1γ y wnt3a y ensayos de bloqueo de función para wnt3a mediante la inyección del morfolino oligo antisentido, que silencia específicamente la actividad de este gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadio de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadios bajo lupa estereoscópica y clasificados según su fenotipo. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1γ y wnt3a están involucrados en el desarrollo ocular. CK1γ además, en los procesos que regulan la formación del eje dorso-ventral y los movimientos de convergencia y extensión embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra. wnt3a también participa en la formación de estructuras cefálicas y del eje antero-posterior, específicamente en el desarrollo de la cola / FONDECYT No. 1040697 y Millenium Nucleus in Development Biology ICM-PO2-05-OT

Magíster en ciencias biológicas mención biología celular / El primer movimiento morfogenético observado durante el desarrollo temprano del pez cebra es la epibolia. Durante este movimiento las blastómeras profundas emitirían protrusiones de manera polarizada hacia las capas más superficiales del blastodermo, interdigitándose entre células adyacentes. Este comportamiento es denominado intercalación radial, evidencia de este mecanismo proviene de estadios tardíos (80 % epibolia) sin embargo con evidencia proveniente de tinciones vitales se ha propuesto su existencia y se ha sugerido como un proceso con el cual se inicia la expansión del blastodermo. Durante estadios tempranos se han descrito moléculas de adhesión que estarían mediando este proceso. E-Cadherina participaría en el proceso de epibolia, sin embargo, el papel de N-Cadherina aún no es claro. Embriones de pez cebra mutantes para n-cadherina no presentan alteraciones aparentes durante la epibolia pero sí en estadios posteriores. Dicho mutante presenta alteraciones en la adhesión de células neuroepiteliales provocando problemas en el cierre del tubo neural. Embriones morfantes de n-cadherina demostraron el rol de esta molécula a nivel celular donde se observa una alteración de la polaridad, persistencia y número de protrusiones de células neuroepiteliales, lo que impide el correcto cierre del tubo neural, esto se traduce en defectos durante la intercalación medio lateral, fenómeno presente durante el cierre del tubo neural. Este trabajo describe un posible rol de N-Cadherina en la orientación del movimiento de intercalación radial, además de su participación en la regulación de la dinámica de las blastómeras profundas en etapas tempranas del desarrollo de pez cebra. / Epiboly is the first movement observed during the zebrafish development. During this process, deep cells exhibit polarize protrusions toward the superficial blastoderm layer, migrating through adjacent cells. This particular behavior has been called radial intercalation, the mechanism’s strongest evidence comes from late developmental stages (around 80% epiboly), nevertheless there are studies from vital staining that propose their existence and suggest it could be the first hallmark of development during the initial blastoderm expansion. In early stages of development it has been described that adhesion molecules mediate this process. E-Cadherin could be involved in epiboly, nevertheless NCadherin role is still unclear. n-cadherin mutant zebrafish embryo doesn’t exhibits apparent phenotype during epiboly, but they do in later stages. Those mutants show adhesion problems in neuroepithelial cells which induce problems during neural tube closure. n-cadherin morphants embryos exhibit problems with polarity, persistence and protrusion, demonstrating the molecule role at cellular level (neuroepithelial cells). These problems cause medio-lateral intercalation defects causing an aberrant neural tube closure. This thesis describes the that could have N-Cadherin in radial intercalation movement. Also, N-Cadherin could be related in the deep cell dynamics regulation in early stages of zebrafish development.

[ES] El sistema de melanocortinas es un sistema hormonal crítico en la respuesta al estrés y el control del balance energético. Sus péptidos agonistas, las hormonas estimuladoras de los melanocitos (MSHs) y la hormona adrenocorticotropa (ACTH) están codificados en un precursor común denominado proopiomelanocortina (POMC). Sus efectos se medían a través de 5 receptores (MCRs) que exhiben farmacologías y dominios de expresión particulares. Los efectos de los agonistas son contrarrestados por la acción de dos antagonistas endógenos, la proteína de señalización agutí (ASIP) y la proteína relacionada con agutí (AGRP), que pueden actuar como agonistas inversos de los receptores activados constitutivamente. Para aumentar la complejidad del sistema hormonal existen dos proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) que interaccionan físicamente con los receptores para permitir (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R) la expresión funcional de los mismos. La MRAP1 es imprescindible para la migración a la membrana plasmática del MC2R mientras que la MRAP2 interactúa con el resto de receptores para modular su actividad. Experimentos anteriores demostraron que, en el pez cebra, uno de los dos parálogos de MRAP2 (MRAP2a) es capaz de interactuar con el MC4R, un receptor canónico de la MSH, transformándolo en un receptor de ACTH. Los experimentos recogidos en esta tesis doctoral demuestran que esta función se ha conservado evolutivamente y esta conservación evolutiva sugiere la existencia de un rol fisiológico para la interacción MRAP2-MC4R. Este rol puede estar relacionado con la trasmisión de información desde el eje hipotálamo-hipófisis-interrenal, que regula la respuesta al estrés hacia los sistemas centrales que controlan el balance energético. Además, proponemos que dicha interacción oferta un mecanismo molecular potencial para la explicación de los beneficios de la terapia con ACTH en el síndrome de espasmos infantiles. Nuestro segundo objetivo fue caracterizar molecularmente la interacción entre ambas proteínas (MRAP2 y MC4R) utilizando una estrategia de receptores quiméricos. Experimentos previos en nuestro laboratorio habían demostrado que la interacción MRAP2a-MC1R no provocaban una alteración farmacológica del receptor. Por tanto, nuestra estrategia fue sustituir diferentes dominios del MC4R por aquellos homólogos del MC1R esperando una pérdida de función, es decir una pérdida de la sensibilidad a ACTH inducida por la MRPA2a en el receptor quimérico. Una vez detectados estos dominios fundamentales optamos por la estrategia contraria, es decir, la substitución de dominios del MC1R por aquellos homólogos del MC4R esperando una ganancia de función. Los resultados demuestran que la substitución conjunta de los dominios transmembranales (TM) 3, 5 y 7 conjuntamente con el segundo y tercer giros extracelulares (ECL) del MC4R sobre el MC1R confiere sensibilidad a ACTH al receptor quimérico. Basándonos en los modelos estructurales de la interacción de diversos agonistas con el MC4R, nuestros resultados otorgan luz sobre la relación funcional entre la MRPA2a y el MC4R y permiten inferir modelos de interacción especulativos. Resultados transcriptómicos previos del grupo de investigación habían sugerido la participación del sistema de melanocortinas en la regulación del reloj circadiano, por tanto, nuestro siguiente objetivo fue demostrar esta interrelación. Para ello utilizamos el paradigma de la actividad locomotora circadiana habitualmente utilizada para el estudio de los ritmos circadianos. En primer lugar, y para poner a punto el sistema de registro de la actividad, estudiamos las diferencias de actividad locomotora entre grupos aislados de machos y hembras mostrando que bajo estas condiciones de aislamiento los ritmos de actividad locomotora son dependientes del sexo, además también demostramos que la administración oral de esteroides opuestos al sexo fenotípico, es decir estradiol en machos y 11-ceto-androstenediona (como precursor de la 11- cetotestosterona) en hembras, revertía parcialmente los efectos del sexo sobre el perfil locomotor. Finalmente quisimos estudiar la posible interacción del sistema de melanocortinas y la regulación del reloj circadiano demostrando que la sobreexpresión de antagonistas endógenos en modelos de transgénesis en el pez cebra modifica el patrón de actividad de los animales. Los animales transgénicos exhiben una mayor actividad significativa especialmente durante el periodo nocturno. Estos datos concuerdan con datos ya publicados por nuestro grupo de investigación donde se demuestra la ausencia de diferencias significativas en los niveles de melatonina entre el día y la noche en animales transgénicos. / [CA] El sistema de melanocortines és un sistema hormonal crític en la resposta a l’estrès i el control del balanç energètic. Els seus pèptids agonistes, les hormones estimuladores dels melanòcits (MSHs) i l’hormona adrenocorticotropa (ACTH) estan codificats en un precursor comú denominat proopiomelanocortina (POMC). Els seus efectes es mesuraven a través de 5 receptors (MCRs) que exhibeixen farmacologies i dominis d’expressió particulars. Els efectes dels agonistes són contrarestats per lacció de dos antagonistes endògens, la proteïna de senyalització agutí (ASIP) i la proteïna relacionada amb agutí (AGRP), que poden actuar com agonistes inversos dels receptors activats constitutivament. Per a augmentar la complexitat del sistema hormonal existeixen dos proteïnes accessòries dels receptors de melanocortines (MRAPs) que interaccionen físicament amb els receptors per a permetre (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R) l’expressió funcional dels receptors. La MRAP1 és imprescindible per la migració a la membrana plasmàtica del MC2R mentres que la MRAP2 interactúa amb la resta de receptors per a modular la seua activitat. Experiments anteriors van demostrar que, en el peix zebra, un dels dos paràlegs de MRAP2 (MRAP2a) és capaç d’interactuar amb el MC4R, un receptor canònic de la MSH, transformant-lo en un receptor d’ACTH. Els experiments recollits en aquesta tesis doctoral demostren que aquesta funció s’ha conservat evolutivament i aquesta conservació evolutiva suggereix l’existència d’un rol fisiològic per a la interacció MRAP2-MC4R. Aquest rol pot estar relacionat amb la transmissió d’informació des de l’eix hipotàlam-hipòfisis-interenal que regula la resposta a l’estrès cap als sistemes centrals que control·len el balanç energètic. A més a més, proposem que l’esmentada interacció oferta un mecanisme molecular potencial per l’explicació dels beneficis de la teràpia amb ACTH en síndrome d’espasmes infantils. El nostre segon objectiu fou caracteritzar molecularment la interacció entre ambdues proteïnes (MRPA2 y MC4R) utilitzant una estratègia de receptors quimèrics. Experiments previs al nostre laboratori havien demostrat que la interacció MRAP2a-MC1R no provocaven una alteració farmacològica del receptor. Per tant, la nostra estratègia fou substituir diferents dominis del MC4R per aquells homòlegs del MC1R esperant una pèrdua de funció, és dir una pèrdua de la sensibilitat a ACTH induïda per la MRPA2a en el receptor quimèric. Una vegada detectats aquests dominis fonamentals optem per l’estratègia contrària, és a dir, la substitució de dominis del MC1R per aquells homòlegs del MC4R esperant una ganància de funció. Els resultats demostren que la substitució conjunta dels dominis transmembranals (TM) 3, 5 i 7 conjuntament amb el segon i tercer girs extracelulars (ECL) del MC4R sobre el MC1R confereix sensibilitat a ACTH al receptor quimèric. Basant-nos en els models estructurals de la interacció de diversos agonistes amb el MC4R els nostres resultats atorguen llum sobre la relació funcional entre la MRPA2a i el MC4R i permiteixen inferir models d’interacció especulatius. Resultats transcriptòmics previs del grup d’investigació havien suggerit la participació del sistema de melanocortines en la regulació del rellotge circadià, per tant, el nostre següent objectiu fou demostrar aquesta interrelació. Per a això utilitzem el paradigma de l’activitat locomotora circadiana habitualment utilitzada per l’estudi dels ritmes circadians. En primer lloc, i per posar a punt el sistema de registre de l’activitat, estudiem les diferències d’activitat locomotora entre grups aïllats de mascles i femelles mostrant que baix aquestes condicions d’aïllament els ritmes d’activitat locomotora són dependents del sexe, a més a més també demostrem que l’administració oral de esteroïdes oposats al sexe fenotípic, és a dir estradiol en mascles i 11-ceto-androstenediona (com a precursor de la 11- cetotestosterona) en femelles, revertia parcialment els efectes del sexe sobre el perfil locomotor. Finalment vam voler estudiar la possible interacció del sistema de melanocortines i la regulació del rellotge circadià demostrant que la sobreexpressió d’antagonistes endògens en models de transgènesis en el peix zebra modifica el patró d’activitat dels animals. Els animals transgènics exhibeixen una major activitat significativa especialment durant el període nocturn. Aquestes dades concorden amb dades publicades anteriorment pel nostre grup d’investigació on es demostra l’absència de diferències significatives en els nivells de melatonina entre el dia i la nit en animals transgènics. / [EN] Melanocortin system is a key hormonal system in the regulation of stress response and the control of energy balance. Peptide agonist, the melaninstimulating hormones (MSHs) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) are encoded in a common precursor named proopiomelancortin (POMC). Their effects are mediated through five receptors that exhibit different expression domains and pharmacological properties. Agonist effects are counterbalanced by the action of endogenous competitive antagonist, agouti-signalling protein (ASIP) and agoutirelated protein (AGRP) that can also work as inverse agonist at constitutive activated receptors. To increase the complexity of the hormonal system, two melanocortin receptor accessory proteins (MRAPs) physically interplay with the melanocortin receptors to allow (MC2R) or modulate (MC1R, MC3R, MC4R, and MC5R) the functional expression of the receptors. MRAP1 is critical for the MC2R traffic to the plasma membrane whereas MRAP2 interacts with the remaining receptors to modulate their activity. Our previous experiments demonstrated that, in the zebrafish, one of the two MRAP2 paralogues (MRAP2a) is able to physically interact with the MC4R, a canonical MSH receptor, to become an ACTH receptor. Experiments in the doctoral thesis demonstrate that this function is conserved and this evolutionary conservation suggests a physiological role for the MC4R-MRAP2 interaction. This role can be related to the information relay from the hypothalamic-pituitaryinterrenal axis, that regulates the stress response, to the central systems that controls energy balance. In addition, we propose that this interaction can be the molecular substrate explaining the ACTH therapy of the infantile spasm syndrome in humans. One second objective was to molecularly characterize the interaction between both proteins (MC4R and MRAP2a) using a receptor quimeras strategy. Previous experiments in our lab demonstrated that the interaction of MRAP2a with MC1R cannot modify the pharmacological profile of the receptor. Therefore, our strategy was to exchange different receptor domains of the MC4R with those homologues in the MC1R looking for a loss of function, i.e. a loss of the MRAP2ainduced ACTH sensitivity. Once characterized the main domains responsible for a loss of function in the MC4R quimeras, we follow the opposite strategy, i.e. exchange the critical domains of MC4R into MC1R waiting for a gain of function in the new MC1R quimeras. Our results demonstrate that integrated substitution of the transmembrane domains (TM) 3, 5, and 7 together with the external loops (ECL) 2 and 3 provides ACTH sensitivity to the new MC1R quimeras. Following several structural models of the interaction between different agonists with the melanocortin receptors, our results provides some light on the functional relationship between MRAP2a and MC4R and allow to infer some interactive and speculative models. Previous transcriptomic results in the research group suggested the involvement of the melanocortin system in the regulation of circadian clock, therefore, our following objective was to demonstrate this interaction. To that, we use the circadian locomotor activity paradigm usually utilized for the study of circadian rhythms. First and with the aim to set up the recording systems we studied the potential differences between the locomotor activity patterns between isolated groups of males and females showing that under these conditions of grouped-sex isolation the locomotor activity is sex-dependent, moreover we also demonstrate that the oral administration of opposed sex steroids to the phenotypic sex, i.e. 17-estradiol to males and 11-ketoandrostenedione (as 11-keto-testosterone precursor) to females was able to revert the sex effects on locomotor pattern. Finally, we wanted to study the potential interaction of the melanocortin system and the regulation of circadian clock using the previous setup thus demonstrating that the overexpression of ASIP in transgenic models modifies the locomotor activity. The transgenic animals exhibit higher global activity specially during the nocturnal period. These data are in well-agreement with those previously reported by our research group showing the absence of significant differences between brain melatonin levels during the light and dark period of the photoperiod in transgenic animals. / La presente Tesis Doctoral llevada a cabo en el Departamento de Fisiología de peces y biotecnología del Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC); se realizó con la ayuda del apoyo económico del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. Lucía Soletto Esteban ha sido beneficiaria de un contrato de Formación de Personal Investigador (FPI) ( BES-2014-070372) para la realización del proyecto “Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad” (AGL2013-46448-C3-3-R). Parte de la financiación ha sido obtenida de proyectos de investigación entre los cuales destaca: “Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los mecanismos temporales y conductuales de peces” (MELANOCONDUCT) (AGL2016-74857-C3-3-R) Proyectos I+D+I, RETOS. Parte del trabajo experimental fue realizado en colaboración con el Prof. Nicholas S. Foulkes, del Instituto de Toxicología y Genética (ITG) del Instituto Tecnológico de Karlsruhe (KIT) de Alemania. Los fondos económicos para la realización de esta estancia breve de investigación fueron proporcionados por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (EEBB-I-16-11803). / Soletto Esteban, L. (2020). Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/152296 / TESIS

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína CK1 es una familia de proteínas quinasa a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas: CK1α, CK1β, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, CK1δ y CK1ε. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para esto, analizamos los patrones de expresión de estos genes mediante RT-PCR e hibridización in situ. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera similar en cuanto a su temporalidad, ya que ambas se detectan desde la primera hora post fecundación (h.p.f). CK1δ1 presenta un patrón ubicuo hasta las 8 h.p.f y limitándose después al sistema nervioso central. Por su parte, la expresión de CK1δ2 presenta ubicuidad hasta las 24 h.p.f, restringiéndose posteriormente a la zona cefálica y al primordio de las aletas pectorales. Para analizar la función de ambas isoformas se efectuaron estudios de sobre expresión, mediante la inyección en embriones de pez cebra de los mRNAs codificante para CK1δ1 y CK1δ2, y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección en embriones de los mRNA de las formas Dominantes Negativas de cada uno de los genes estudiados. Estos experimentos se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula y posteriormente incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores específicos de desarrollo embrionario, en embriones inyectados con una cantidad conocida de mRNA de CK1δ1 y CK1δ2, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podrían estar involucradas estas isoformas. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que la sobre expresión de ambas isoformas, CK1δ1 y CK1δ2, inducen distintos grados de malformación en cerebro anterior y ojos, siendo el fenotipo principal observado con la inyección de CK1δ1 los embriones sin ojos. El bloqueo de función mediante Dominantes Negativos indujo, en ambas isoformas, embriones dorsalizados y ciclópicos. Se puede concluir, que las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 están participando en la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente cerebro anterior y ojos. / FONDECYT N° 1020753 y por Millenium Nucleus in Developmental Biology

Memoria para optar al título de Bioquímica / Las asimetrías cerebrales en el eje izquierda-derecha de vertebrados poseen componentes altamente conservados y son un punto importante de estudio para la biología del desarrollo. Entre estas asimetrías, las más estudiadas se encuentran en el epitálamo, una región ubicada en el diencéfalo dorsal de vertebrados cuyas conspicuas asimetrías poseen un importante factor hereditario y de lateralidad. En esta región, se encuentra la presencia de un par de núcleos habenulares (Hb, órgano par), además se encuentra el complejo pineal formado por el órgano pineal (órgano impar) en la línea media y por el órgano parapineal (Opp) que se encuentra a la izquierda y proyecta axones eferentes hacia la habénula ipsilateral. En este trabajo se realizó un estudio comparado entre dos especies de teleósteos, pez cebra (D. rerio) y pez medaka (O. latipes), para intentar dilucidar como se generan las características conservadas y especie-específicas durante la ontogenia del epitálamo. Estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron que estos teleósteos poseen variaciones morfotopológicas especie-específicas en la región del epitálamo (heterotopías) y, luego de normalizar los tiempos de desarrollo en ambas especies, se comprobó que también existen variaciones en la temporalidad del desarrollo (heterocronías). La heterocronía más significativa es que las proyecciones Opp de pez medaka se desarrollan antes que en pez cebra. Debido a lo anterior, se puede hipotetizar que las diferencias topológicas observadas entre ambas especies podrían tener relación con la temporalidad de desarrollo de los componentes que forman el circuito Opp-Hb. En este contexto, el momento en que ocurre la interacción entre el Opp y la Hb podría ser un factor importante para definir la citoarquitectura final del circuito. Lo anterior se respalda en el hecho de que en pez cebra las células habenulares tienen distinta temporalidad de proliferación en cada núcleo, lo que genera subnúcleos habenulares lateral y medial, de distintos tamaños. Este rasgo asimétrico sería dependiente de la presencia del órgano parapineal, ya que a cada subnúcleo se han asociado marcadores moleculares cuya expresión suele ser asimétrica, pero ésta se pierde cuando el Opp es ablacionado. Por otra parte, la neurogénesis habenular, posee asimetría izquierda en su inicio, la cual se conserva incluso luego de ablacionar el Opp, lo que la define como un rasgo asimétrico independiente de la presencia del Opp. Luego, si suponemos que estas interacciones son conservadas también en el modelo de pez medaka, las eventuales variaciones heterocrónicas pueden estudiarse para comprender como podrían generarse las diferencias topológicas entre ambos teleósteos. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue dilucidar si estas características se encuentran conservadas y observar de qué manera podría influir el adelantamiento de las proyecciones del Opp. Se esperaba que la neurogénesis habenular de pez medaka inicie de manera asimétrica en el mismo momento de desarrollo que pez cebra. Por otro lado, se esperaba que la proliferación celular, al ser un evento dependiente del Opp, se inicie antes debido al adelantamiento de la ontogenia del Opp. Para estudiar lo anterior se utilizó el marcador pan neuronal HuC, para identificar neuronas diferenciadas y se usaron marcadores moleculares que en pez cebra se asocian al dominio de los subnúcleos habenulares. Los resultados de nuestro estudio demostraron nueva evidencia de heterotopía y heterocronía entre pez cebra y medaka, se descartó la hipótesis planteada, pues la neurogénesis habenular en pez medaka está adelantada pero continúa siendo asimétrica en su inicio, lo que podría indicar que en esta especie sí existe una relación entre el Opp y la neurogénesis habenular. Por otro lado, con el gen nptx2a, ortólogo de narp de pez cebra, se encontró un arreglo topológico diferente a la asimetría izquierda esperada con narp, pues el marcador de pez medaka es más simétrico y se limita a una región más pequeña en ambas habénulas, asemejándose más a una topología propia a la descrita en la habénula derecha de pez cebra. Nuestros estudios respaldan la idea de que las interacciones entre el Opp y la HbI parecen ser más complejas de lo que los estudios en pez cebra revelan. Nuestros resultados sugieren interacciones más tempranas y probablemente bidireccional entre la habénula izquierda y el órgano parapineal / Brain asymmetries along the left-right axis show highly conserved components across vertebrates. Among these asymmetries the most studied is found in the epithalamus, a region located in the dorsal diencephalon. Epithalamic asymmetries are conspicuous and genetically controlled, and are characterised by the presence of left-right differences in morphology and gene expression of the bilaterally paired habenular nuclei and by the left-sided asymmetric position and connectivity to the left habenula (Hb) of the unpaired parapineal organ (PpO), an accesory component of the pineal complex. In this work we performed a comparative study between two species of teleosts, zebrafish (D. rerio) and medaka (O. latipes), to elucidate how the conserved and species-specific features of epithalamic asymmetries are generated during the ontogeny of the epithalamus. Previous studies of our laboratory showed that these teleosts show both topological and temporal variations in the development of epithalamic asymmetries, known as heterotopies and heterochronies, respectively. Among the latter, the most significant difference is observed in the timing of connectivity of the parapineal organ to the left Hb, which in medaka fish begins earlier than in zebrafish. Due to the above, we hypothesised that the topological differences observed between both species could be related to the temporality of development of the components that make up the parapineal-habenula circuit. In this context, the time in which the interaction between the parapineal organ and the habenula occurs could be an important factor in defining the final cytoarchitecture of the circuit. This idea is supported by the fact that in zebrafish the habenular cells have different temporality of proliferation in the left and right nuclei, which generates size differences in the lateral and medial habenular subnuclei on both sides. This asymmetric trait appears to depend on the presence of the parapineal organ, since the asymmetric expression of the molecular markers that have been associated to each habenular sub-nuclei is lost when the parapineal organ is physically removed during development. In contrast, the onset of habenular neurogenesis is asymmetric even after ablating the PpO, which defines a type of asymmetry that is independent of the parapineal organ. Based on the above and if we assume that these types of asymmetries are also conserved in medaka, the heterochronic variations can be studied as a possible factor that explains how the topological differences of epithalamic asymmetry between both teleosts are generated. Therefore, the aim of this work was to have a first mechanistic approach to this question and investigate the timing and organisation of habenular neurogenesis in medaka and relate this to the pattern observed in zebrafish and the advancement of parapineal projections in both species. Habenular neurogenesis of medaka was expected to start asymmetrically at the same time as in zebrafish while cell proliferation, being an event dependent of the parapineal organ, it was expected to start earlier due to overtaking of parapineal projections in this species. The pan-neuronal marker HuC was used to identify differentiated neurons and molecular subnuclei. The results of this study provided new evidence of heterotopic and heterochronic shifts between zebrafish and medaka that appear to rule out our hypothesis. The onset of habenular neurogenesis in medaka was asymmetric as in zebrafish but appeared at an earlier stage. This observation suggest that in contrast to zebrafish, the onset of asymmetric habenular neurogenesis in medaka has some type of dependency on the parapineal organ. This possibility can be assesed in the future by performing parapineal ablation in medaka. On the other hand, using the medaka nptx2a gene, an ortholog of zebrafish narp, we observed a different topological arrangement with a more restricted and fairly symmetric habenular expression, in contrast to the broad and pronounced left-sided asymmetric expression observed in zebrafish. This expression pattern resembles the topology described in the right habenula of zebrafish. In summary, our studies support the idea that interactions between the parapineal organ and the left Hb are more complex than the studies of zebrafish suggest. These interactions appear to have an earlier onset and show a bi-directional nature / FONDECYT; CONICYT; FONDAP; Iniciativa Científica Milenio, ICM P-09-015-F

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas (α, β, δ, ε, γ-1, γ-2 y γ-3). En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1α y CK1ε en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridización in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1α se detecta desde la primera hora post fertilización y presenta un patrón de expresión ubicuo en los primeros estadíos para luego restringirse a la región cefálica y a las aletas pectorales, mientras que CK1ε no presenta un componente materno y el mRNA cigótico es detectado después de las 12 horas post fertilización con un patrón de expresión restringido exclusivamente al cerebro. Para analizar la función de ambas isoformas se realizaron estudios de sobrexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1α y CK1ε y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección de las dominantes negativas de cada isoforma. Para CK1α también se utilizó la inyección del morfolino oligo antientido que silencia específicamente la actividad de éste gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores en embriones inyectados con el Morfolino Anti CK1α, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podría estar involucrada esta ultima isoforma. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1α, a diferencia de CK1ε, está involucrada en los procesos que regulan la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente en las que se encuentran ubicadas en el límite entre cerebro medio y posterior (cerebelo y cuarto ventrículo). En cambio, CK1ε solo tendría participación en la formación de estructuras cerebrales sin afectar la formación de los ejes en el embrión en desarrollo / La realización de esta tesis fue financiada en parte por el proyecto FONDECYT N° 1020753

Memoria para optar al título Profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Producción Animal / No disponible a texto completo / El pez cebra (Danio rerio) es uno de los vertebrados más utilizados como organismo modelo en biología molecular y del desarrollo, fisiología y toxicología. Recientemente se ha propuesto como organismo modelo en estudios de nutrición y crecimiento donde los resultados podrían aplicarse a peces de importancia acuícola. Un requisito indispensable para utilizar el pez cebra como modelo en acuicultura es generar un gran número de peces adultos, sin embargo, no se han establecido los protocolos adecuados para la crianza larval lo que dificulta la tarea de generar abundante población adulta. La sobrevivencia de las larvas depende tanto de la alimentación como de las condiciones fisicoquímicas del medio donde se encuentran, sin embargo, la mayoría de estos parámetros sólo están relativamente establecidos para el mantenimiento de peces adultos. Por ejemplo, el nivel de oxígeno disuelto en el agua en la etapa larval no ha sido descrito. El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones óptimas de crianza larval del pez cebra desde los 8 a los 28 días post fertilización (dpf), una vez que ocurre la transición de larva a juvenil, y conocer el crecimiento de las larvas hasta los 98 dpf, previo a la madurez sexual. Se evaluó la sobrevivencia de las larvas sometidas a condición de nula aireación y aireación constante en 24 familias de peces durante los primeros 28 dpf. Se comparó la tasa de crecimiento de los peces sometidos a aireación constante desde los 28 dpf hasta los 98 dpf, alimentados con dos dietas experimentales que difieren en el origen de la proteína (animal v/s vegetal). Adicionalmente se obtuvieron curvas de crecimiento de los peces, alimentados con la dieta experimental a base de proteína animal y alimento comercial. Los resultados indican que la mayor mortalidad de las larvas se registra en peces sometidos a condición de nula aireación con un 52,81% de mortalidad versus un 4,95% en aquella población sometida a aireación constante. En ambos ensayos la mayor mortalidad se registra entre los 12 y 14 dpf, adicionalmente en el tratamiento sin aireación se observó un aumento de la mortalidad entre los 22 y 25 dpf, probablemente debido a las condiciones de hipoxia del medio. Por otra parte, las poblaciones alimentadas con dieta que difiere en el origen de la proteína presentaron significativamente mayores valores en peso y longitud en los peces alimentados con proteína de origen animal versus los alimentados con proteína de origen vegetal (181,964 ± 62,952 mg y 15,963 ±1,862 mm versus 135,204 ± 55,701 mg y 14,227 ± 2,340 mm respectivamente). Al comparar las curvas de crecimiento de los peces alimentados con dieta en base a proteína animal y dieta comercial se observa en ambos casos su modelación se ajustó al crecimiento potencial de la forma , siendo aquella población alimentada con dieta comercial la que presenta los mayores incrementos en peso y longitud (P > 0,05). / The zebrafish (Danio rerio) is one of the most common vertebrates as a model organism in molecular and developmental biology, physiology and toxicology. Recently it has been proposed as a model organism in studies of nutrition and growth. However, have not been established protocols for larval rearing which makes it difficult to generate large numbers of adult fish, a prerequisite for using zebrafish as a model for aquaculture. Recently it has been proposed as a model organism in studies of nutrition and growth where the results could be applied to important fish in aquaculture. A prerequisite for using zebrafish as a model for aquaculture is to generate a large numbers of adult fish, however, have not established appropriate protocols for larval rearing which makes the task of generating plenty of adults. The survival of the larvae depends on both the supply and physicochemical conditions of the environment where they are, however, most of these parameters are relatively established only for the maintenance of adult fish. For example, the level of dissolved oxygen in the water in the larval stage has not been described. The aim of this study was to determine the optimal conditions for rearing larval zebrafish from 8 to 28 days post fertilization (dpf), once the transition occurs from larva to juvenile, and know the growth of the larvae until 98 dpf, prior to sexual maturity. We evaluated the survival of larvae exposed to a condition of no aeration and constant aeration in 24 families of fish during the first 28 dpf. We compared the growth rate of fish under constant aeration from 28 dpf to 98 dpf, fed with two experimental diets differing in protein source (animal v/s plant). Additionally, growth curves were obtained for fish fed with experimental diet based on animal protein and commercial food. The results indicate that increased mortality of fish larvae register under no aeration condition with a mortality 52.81% versus 4.95% in that population under constant aeration. In both trials, the highest mortality was recorded between 12 and 14 dpf, in addition to the treatment without aeration showed an increase in mortality between 22 and 25 dpf, probably due to environmental hypoxic conditions. Moreover, the populations fed diets differing in protein source had significantly higher values in weight and length in those fish fed with animal protein versus those fed plant protein (181.964 ± 62.952 mg and 15.963 ±1.862 mm versus 135.204 ± 55.701 mg versus 14.227 ± 2.340 mm). By comparing the growth curves for fish fed diet based on animal protein and commercial diet were fitted to potential model ( for growth, where that population fed commercial diet that showed greatest increases in weight and length (P > 0.05).

Memoria para optar al Título Profesional de: Ingeniero Agrónomo / El pez cebra (Danio rerio) es un organismo modelo ampliamente utilizado en estudios genéticos debido a características únicas como su pequeño tamaño, corto tiempo generacional y transparencia de embriones entre otras, todas ellas facilitan los estudios realizados en esta especie y cuyos resultados pueden ser extrapolados a la gran mayoría de los vertebrados. Se ha logrado modificar genéticamente para utilizarlo en diversas áreas, desde biomedicina al monitoreo medioambiental y también como peces ornamentales. Estudios citogenéticos en esta especie existen pocos, mientras que en peces cebra transgénicos no existen. Bajo esta directriz se desarrolló esta investigación, donde se compara el cariotipo de dos cepas silvestres “wild type” obtenidas en laboratorios de las Facultades de Ciencias Agronómicas y de Ciencias de la Universidad de Chile y una línea ornamental transgénica comercial para definir si existen diferencias a nivel cariotípico entre ellas. Para esto se obtuvieron placas metafásicas mediante el método de goteo de suspensión celular de riñón, las cuales se sometieron a análisis cariotípico con tinción con Giemsa y tinción con ioduro de propidio para la obtención del bandeo C fluorescente. Se midió cada cromosoma del cariotipo y se calculó su índice centromérico para finalmente poder confeccionar el idiograma. Todas las cepas analizadas, incluyendo la línea ornamental transgénica presentaron un número cromosómico modal de 2n = 50, todos de morfología submetacéntrica. En general, el bandeo C reveló presencia de heterocromatina constitutiva principalmente en la zona pericentromérica de los cromosomas, se detectaron brazos cromosómicos bandeados completamente y algunas bandas a nivel telomérico. Bajo este análisis, la cepa silvestre de Agronomía presentó algunas diferencias con respecto a la cepa silvestre de Ciencias. Las placas metafásicas revelaron una variabilidad muy marcada en el número y morfología de los cromosomas de los peces transgénicos. Los resultados de esta memoria son un aporte al conocimiento de las cepas de pez cebra mantenidas en cautiverio y abren una ventana para el desarrollo de nuevos estudios en pez cebra transgénicos. / The zebrafish (Danio rerio) is a model organism, widely used in genetic studies due to unique features such as their small size, short generation time and transparency of embryos, among others, all of them provide great advantages to work with this fish, and results of research performed on this species can be extrapolated to the majority of vertebrates. Zebrafish has been genetically modified to be used in diverse areas, such as biomedicine, monitoring environmental and also as ornamental fish. Few cytogenetic studies have been developed on this species, while in transgenic zebrafish there is not cytogenetic research yet. Under this guideline is performed this research, which compare the karyotype of two strains of wild type obtained from laboratories of hatcheries of Agronomy Sciences and Sciences Faculties of University of Chile, and a commercial transgenic ornamental line to define if there are karyotypic differences between them. To do this, metaphases plates were obtained from cells from kidney, which were subjected to karyotypic analysis with staining with Giemsa and staining with propidium iodine to obtain the fluorescent C-banding. Each chromosome karyotype was measured and calculated centromeric index, to be able to finally make the idiogram. All analyzed strains, including the ornamental transgenic line, had the same chromosomal modal numbers 2n = 50, all of them with submetacentric morphology. In general, the C-banding revealed presence of constitutive heterochromatin, mainly in the pericentromeric areas of chromosomes. After this analysis, the wild type strain from Agronomy Faculty presented differences with respect to the wild type of Science Faculty. Metaphases revealed a marked variability in the chromosomes number and morphology of transgenic fish. The results of this report are a contribution to the knowledge of the strains of zebrafish in captivity and open a window for the development of new transgenic zebrafish studies.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La utilización de animales en investigación ha generado un dilema moral y una preocupación por parte de la sociedad de cómo éstos se ven afectados al ser objeto de estudio y cuáles con las consideraciones éticas que deben recibir, sobre todo en etapas tempranas de desarrollo donde su sensibilidad es aún más discutida. En el presente estudio se analizaron 12 embriones de Mus musculus de 12, 14, 17 y 20 días post coito, y 30 alevines de Danio rerio de 60, 72, 120, 144 y 160 horas post fertilización. Éstos fueron procesados y sometidos a las técnicas histológicas de H&E/azul de Alcián pH 2,5, Cresil Violeta e Impregnación Argéntica de Llombart, para visualizar el desarrollo y cronología de formación de receptores nociceptivos, médula espinal, tálamo y corteza cerebral que son las principales estructuras anatómicas que participan en la percepción del dolor. Se evidenció que a los 17 días post coito el desarrollo nervioso en Mus musculus es lo suficientemente avanzado para percibir estímulos nocivos, mientras que en Danio rerio a las 160 horas post fertilización aún no ha finalizado, concluyendo que al menos hasta esta etapa no se encuentra morfológicamente desarrollado para sentir dolor / Public concern regarding the use of animal models on research has raised a moral dilemma of how they are affected as a subject of study and which ethical considerations must be considered when handling them, especially on early development stages were their sensibility is even more argued. In the present study 12 Mus musculus embryos of 12, 14, 17 and 20 days post coitum and 30 Danio rerio larvae of 60, 72, 120, 144 and 160 hours post fertilization were analyzed. They were processed and dyed with H&E/Alcian blue pH 2,5, Cresyl Violet and Llombart silver impregnation, to visualize the development and chronological formation of the nociceptors, spinal cord, thalamus and cerebral cortex, which are the main anatomical structures that participates in pain perception. It was demonstrated that at the stage of 17 days post coitum in Mus musculus the nervous system is developed enough to perceive noxious stimulus, whereas Danio rerio’s development at 160 hours post fertilization has not concluded, therefore up until this stage they are not morpholocally able to feel pain

Sensory neurons are key mediators of the transduction of external stimuli from the ear to the brain, essential for the sense of balance and hearing. Understanding when, where and how the sensory nervous system is assembled during development can provide insights on deafness and balance disorders. Here, I show in zebrafish that Her9 transcription factor is a key element in the regulation of the otic neurogenesis. Loss of Her9 function leads to the ectopic expression of neurogenic genes neurod and neurod4. Moreover, I show that Her9 acts downstream of Tbx1, and both genes are activated by retinoic acid signaling emanating from the paraxial mesoderm and negatively regulated by Hedgehog signaling. Altogether, the data demonstrates a role of retinoic acid in axial patterning and the establishment of a neurogenic domain through Tbx1 and Her9. At later stages, retinoic acid has an additional role by regulating neuronal differentiation in the statoacoustic ganglion. / Les neurones sensorials de l’oïda interna són mediadores claus en la transducció dels estímuls externs des de l’oïda interna al cervell. Entendre a on, quan i com el sistema nerviós sensorial s’organitza durant el desenvolupament embrionari pot ajudar en l’estudi de les malalties neurosensorials. En el present treball, mostro en peix zebra que el factor de transcripció Her9 és un element clau en el control de la neurogènesi òtica i que Her9 es troba sota el control directe del factor Tbx1. A més, ambdos factors estan regulats de manera positva per la via de senyalització de l’àcid retinoic i negativament per la vía de hedgehog. En resum, la tesis demostra un paper de l’àcid retinoic en la regionalització axial del primordi òtic en l’eix anteroposterior i l’establiment d’un domini neurogènic a través de Tbx1 i Her9. En estadis tardans, l’àcid retinoic regula la diferenciació neuronal en el gangli estato-acústic.