Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortinas es un sistema hormonal, autocrino, paracrino y endocrino compuesto por agonistas (hormonas), receptores y paradójicamente, por antagonistas del mismo sistema. A estos componentes del sistema se le ha adicionado recientemente sus proteínas accesorias, las cuales conforman un nuevo punto de regulación conocido. La actividad de este sistema hormonal está relacionada con diversas funciones fisiológicas que incluyen principalmente: el control de la pigmentación, la regulación del balance energético y la regulación de la respuesta al estrés. Los experimentos realizados en el laboratorio donde he desarrollado mi tesis doctoral, fueron pioneros en la descripción de las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) en peces. Durante la experimentación se demostró la existencia de dos proteínas accesorias en el genoma del pez cebra (MRAP1 y MRAP2), la segunda de las cuales está duplicada en esta especie (MRAP2a y MRAP2b), modelo que ha sido utilizado en la experimentación presentada. La MRAP1 interacciona con el receptor 2 de melanocortinas (MC2R) para permitir su expresión funcional, pero la función de las MRAP2s era desconocida y acotar su función ha sido el principal objetivo de la tesis doctoral. Los resultados presentados demuestran que el MC2R de la lubina también requiere de la interacción con MRAP1 para poder responder a la hormona adrenocorticotropa (ACTH), adquiriendo así su expresión funcional. Además, demostramos que los glucocorticoides son capaces de inhibir la expresión del MC2R en las glándulas interrenales, lo que supone un mecanismo de retroalimentación con posible relevancia en la adaptación al estrés. Por su parte las MRAP2 no tienen efectos sobre la actividad del MC2R, pero como demostramos en la tesis doctoral, la MRAP2a, pero no la MRPA2b, es capaz de convertir al MC4R, un receptor canónico de la hormona estimuladora de los melanocitos (MSH) expresado en el cerebro, en un receptor de ACTH. La ACTH se libera desde la hipófisis en respuesta a estímulos hipotalámicos que integran información relativa a condiciones estresantes. Mientras que el MC4R está fundamentalmente implicado en el control central de la regulación de la ingesta. Por tanto, la modificación del perfil farmacológico del MC4R tras interacción con MRAP2a otorga un mecanismo molecular para la integración de la información del estrés sobre los circuitos centrales que controlan la ingesta. Es decir, otorga una base molecular directa para las relaciones estrés-ingesta. Este cambio del perfil farmacológico no se observa tras la interacción con el MC1R ni con el MC5R, si bien la interacción MC1R-MRAP2a provoca una disminución de la sensibilidad del receptor a la MSH. Finalmente, hemos caracterizado la respuesta central y periférica del pez cebra al estrés agudo evaluando los niveles de expresión de diversos componentes del sistema de melanocortinas y demostrando la sensibilidad de este sistema a los elementos estresantes. / [EN] The melanocortin system is an endocrine, paracrine and autocrine hormonal system composed by agonist (hormones), receptors, and atypically endogenous antagonists. Recently, the so-called melanocortin receptor-accessory proteins (MRAPs) have been integrated as a part of the system. These proteins conform a new regulatory point of the system. The activity of the hormonal system is related to several physiological functions including control of pigment patters as well as the regulation of energy balance and the stress response. Experiments done in the lab in which I have run my PhD studies were pioneer in the description of fish MRAPs. It was demonstrated that the genome of zebrafish includes two accessory proteins (MRAP1 and MRAP2) and the second one is duplicated into MRAP2a and MRAP2b forms. MRAP1 interacts with the melanocortin 2 receptor (MC2R) allowing its functional expression but the function of MRAP2 was unknown and delimiting its function has been the main objective of this doctoral thesis. Results demonstrated that sea bass MC2R also requires the interaction with MRAP1 in order to be activated by the adrenocorticotropic hormone (ACTH), reaching therefore its functional expression. We also demonstrated that glucocorticoids are able to inhibit MC2R expression in the interrenal tissue suggesting the existence of a negative feedback with potential relevance in the stress adaptation. The MPRA2 has no effects on MC2R activity, but as we demonstrate, the MRAP2a, but not MRAP2b, in able to transform the MC4R, a canonical melanocyte- stimulating hormone (MSH) receptor expressed in the brain, into an ACTH receptor. ACTH is released form the pituitary in response to stressful stimuli integrated in the hypothalamus. On the other hand, MC4R is mainly involved in the central control of food intake and energy balance. Therefore, the MC4R pharmacological profile after interaction with MRAP2a provides a molecular mechanism for the integration of stress information into the central circuits controlling energy balance. That means, molecular basis for the stress-food intake interaction. This pharmacological modification seems to be specific for MC4R since the interaction of MRAP2a with MC5R or MC1R does not provide ACTH sensitivity to the receptor. However, MC1R-MRAP2a interaction induces a decrease in the sensibility of the receptor to MSH. Finally, we have characterized the central and peripheral response of zebrafish to acute stress by evaluating the expression levels of several components of the melanocortin system thus demonstrating the sensibility of this system to stressful agents. / [CA] El sistema de melanocortines és un sistema hormonal, autocrí, paracrí i endocrí compost per agonistes (hormones), receptors i paradóxicament, per antagonistes del mateix sistema. A aquests components del sistema se'ls ha addicionat recentement les seues proteïnes accesòries, les quals conformen un noa punt de regulació conegut. L'activitat d'aquest sistema hormonal està relacionada amb diverses funcions fisiològiques que inclouen principalment: el control de la pigmentació, la regulació del balanç energètic i la regulació de la resposta a l'estrès. Els experiments realitzats al laboratori on he desenvolupat la meua tesi doctoral, van ser pioners en la descripció de les proteïnes accesòries dels receptors de melanocortines (MRAPs) en peixos. Durant l'experimentació se va demostrar l'existència de dues proteïnes accesòries en el genoma del peix zebra (MRAP1 y MRAP2), la segona de les quals està duplicada en aquesta espècie (MRAP2a y MRAP2b), model que ha sigut utilitzat en l'experimentació presentada. La MRAP1 interacciona amb el receptor 2 de melanocortines (MC2R) per a permetre la seua expressió funcional, però la funció de les MRAP2s era desconeguda i acotar la seua funció ha sigut el principal objectiu de la tesi doctoral. Els resultats presentats demostren que el MC2R del llobarro també requeireix de la interacció amb MRAP1 per a poder respondre a la hormona adrenocorticotropa (ACTH), adquirint així la seua expressió funcional. A més a més, demostrem que els glucocorticoides son capaços d'inhibir l'expressió del MC2R a les glàndules interrenals, la qual cosa suposa un mecanisme de retroalimentació amb possible relevància en l'adaptació a l'estrès. Per la seua part les MRAP2 no tenen efectes sobre l'activitat del MC2R, però com demostrem a la tesi doctoral, la MRAP2a, però no la MRPA2b, és capaç de convertir al MC4R, un receptor canònic de la hormona estimuladora dels melanocitos (MSH) expressat en el cervell, en un receptor de ACTH. La ACTH es allibera des de la hipòfisi com a resposta a estímuls hipotalàmics que integren informació relativa a condicions estressants. Mentres que el MC4R està fonamentalment implicat en el control central de la regulació de la ingesta. Per tant, la modificació del perfil farmacològic del MC4R tras interacció amb MRAP2a atorga un mecanisme molecular per la integració de la informació de l'estrès sobre els circuits centrals que controlen la ingesta. És a dir, atorga una base molecular directa per a les relacions estrès-ingesta. Aquest canvi del perfil farmacològic no s'observa tras la interacció amb el MC1R ni amb el MC5R, encara que la interacció MC1R-MRAP2a provoca una disminució de la sensibilitat del receptor a la MSH. Finalment, hem caracteritzat la resposta central i perifèrica del peix zebra a l'estrès agut avaluant els nivels d'expressió de diversos components del sistema de melanocortines i demostrant la sensibilitat d'aquest sistema als elements estressants. / La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a la obtención de una beca predoctoral FPI (BES-2011-048425) y gracias a la financiación obtenida del proyecto “Participación de las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPS) en la regulación de la respuesta al estrés en peces (AGL2010-22247-C03-01)” del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Así como otros proyectos de investigación obtenidos por mi director de tesis doctoral entre los cuales destacan: Mejora de la producción en acuicultura mediante herramientas de biotecnología” (Aquagenomics) (CSD2007-00002) e “Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación del crecimiento de peces: estudio de las interacciones estrés-ingesta (MELANOGROWTH) AGL2013-46448-C3-3-R, Proyectos I+D+I, RETOS. / Cortés Barrera, RA. (2020). Implicación de la MRAP2s en el sistema de melanocortinas de peces usando como modelos a la lubina europea y el pez cebra [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/147861 / TESIS / Compendio

Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortinas es un complejo sistema hormonal implicado en la regulación de diversas funciones fisiológicas. Todas las melanocortinas derivan de un mismo precursor peptídico denominado proopiomelanocortina (POMC), en el que están integradas las diferentes hormonas estimuladoras de los melanocitos (MSHs), la hormona adrenocorticotropa (ACTH), y el péptido opioide ¿-endorfina. Las melanocortinas señalizan a través de 5 receptores (MC1R-MC5R), con diferentes grados de especificidad hormona-receptor, lo que supone un buen ejemplo de su coevolución. El sistema de melanocortinas es el único sistema hormonal que presenta antagonistas endógenos: la proteína de señalización agouti (ASIP) y la proteína relacionada con agouti (AGRP). En mamíferos, ASIP actúa como un antagonista de MC1R. La modificación de la señalización del MC1R desequilibra la síntesis de pigmentos en el folículo piloso, potenciando la síntesis de feomelanina (pigmento amarillo-naranja) en lugar de eumelanina (pigmento negro-marrón). La expresión tegumentaria de ASIP es responsable del patrón de pigmentación dorso-ventral polarizado que tienen muchas especies de mamíferos. Esta polaridad puede observarse incluso cuando la especie presenta patrones más complejos. AGRP actúa como antagonista de MC4R, uno de los receptores de sistema nervioso central implicados en el control del metabolismo energético; a través de la regulación de la saciedad. Se ha demostrado que ASIP es capaz de antagonizar la actividad del MC4R, lo que no ocurre en condiciones normales, ya que ASIP sólo se expresa de forma local en el tegumento, y nunca alcanza el MC4R cerebral. En la cepa de ratones mutantes yellow [A(vy)/a], la expresión de ASIP queda bajo el control de un promotor de expresión ubicua que permite su síntesis en todos los tejidos incluyendo el cerebro, accediendo al MC4R central. El bloqueo/disminución de la actividad constitutiva del MC4R en esta cepa de ratones, disminuye la sensación de saciedad, aumentando los niveles de ingesta que conllevan una tasa de crecimiento, mayor pero también el desarrollo de obesidad. En los peces teleósteos los antagonistas endógenos del sistema de melanocortinas están duplicados debido a una tercera duplicación genómica (R3) específica de su rama evolutiva. Los cuatro péptidos antagonistas se identificaron inicialmente como ASIP1, ASIP2, AGRP1, y AGRP2. El principio de parsimonia asocia la expresión polarizada de ASIP1 en el tegumento de estos peces con el desarrollo del patrón de pigmentación dorsoventral que se puede observar en muchas especies y la expresión hipotalámica de AGRP1 con el control de la ingesta. El objetivo de esta tesis doctoral es demostrar la implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de la pigmentación y el balance energético de peces mediante relaciones causas-efecto de sus antagonistas endógenos. Para alcanzar este objetivo, en primer lugar, caractericé los genes ASIP1 en dos especies de peces planos: el rodaballo (Scophthalmus maximus) y el lenguado senegalés (Solea senegalensis). La elección de este grupo de teleósteos se debe a la extrema polaridad pigmentaria dorsoventral que presentan los peces planos, las numerosas malformaciones pigmentarias que aparecen en cultivo, y a la carencia de secuencias génicas caracterizadas de ASIP1 de pleuronectiformes. Los experimentos demostraron que ASIP1 se expresa masivamente en la región ventral y apenas es detectable en la región dorsal. Además, los resultados sugieren que la expresión ectópica de ASIP1 podría ser la responsable del pseudoalbinismo observado en los peces planos de cultivo. En segundo lugar, desarrollamos una nueva línea transgénica de peces cebra (Danio rerio) (tgASIP1) que expresa el gen ASIP1 de pez dorado (Carassius auratus) de forma constitutiva. Esta expresión ubicua rompía la polaridad de la expresión de ASIP1 en el tegumento y, permitía que este antagonista / [CA] El sistema de melanocortines és un complex sistema hormonal implicat en la regulació de diverses funcions fisiològiques. Totes les hormones melanocortines deriven d'un mateix pèptid precursor denominat propiomelanocortina (POMC), al qual estan integrades les diferents hormones estimuladores dels melanocits (MSHs), la hormona adrenocorticotropa (ACTH), i el pèptid opioide ß-endorfina. Les melanocortines senyalitzen a través de 5 receptors (MC1R-MC5R), amb diferents graus d'especificitat hormona-receptor, la qual cosa suposa un bon exemple de coevolució. El sistema de melanocortines és l'únic sistema hormonal que presenta antagonistes endògens: la proteïna de senyalització agouti (ASIP) i la proteïna relacionada con agouti (AGRP). En mamífers, ASIP actua com antagonista de MC1R: La modificasió de la senyalització de MC1R desequilibra la síntesi de pigments en el fol·licle pilós potenciant la síntesi de feomelanina (pigment groc-taronja) en lloc de eumelanina (pigment negre-marró). L'expressió tegumentària de ASIP és la responsable del patró de pigmentació dors-ventral polaritzat que tenen moltes espècies de mamífers. Aquesta polaritat és observable fins i tot quan l'espècia presenta patrons més complexos. AGRP actua com antagonista de MC4R, un dels receptors del sistema nerviós central implicats en el control del metabolisme energètic; en concret a través de la regularització de la sacietat. S'ha demostrat que ASIP és capaç d'antagonitzar l'activitat del MC4R, la qual cosa no succeeixen condicions normals a causa de que ASIP sols s'expressa en el tegument, i mai arriba al MC4R cerebral. En la soca de ratolins mutants yellow A(yy)/a a l'expressió d'ASIP resta baix el control d'un promotor d'expressió ubiqua que permet la síntesi en tots els teixits incloent el cervell, accedint MC4R central. El bloqueig/disminució de l'activitat constitutiva del MC4R en aquesta soca de ratolins, disminueix la sensació de sacietat, augmentant els nivells d'ingesta, produint un major taxa de creixement, però també obesitat. Als peixos teleostis els antagonistes endògens del sistema de melacortines estan duplicats a causa d'una tercera duplicació genòmica (R 3) específica de la seua branca evolutiva. Els quatre pèptids antagonistes en els teleostis foren identificats inicialment com a ASIP1, ASIP2, AGRP1 y AGRP2. El principi de parsimònia associa l'expressió polaritzada de ASIP1 en el tegument d'aquests peixos amb el desenvolupament del patró de pigmentació dors-ventral que es pot observar en moltes espècies; i l'expressió d'AGRP1 al hipotàlem amb el control de la ingesta. L'objectiu d'aquesta tesis doctoral és demostrar l'implicació del sistema de melanocortines en la regulació de la pigmentació i el balanç energètic de peixos mitjançant relacions causa-efecte dels seus antagonistes endògens. Per assolir aquest objectiu, en primer lloc, caracteritzaré ASIP1 en dues espècies de peixos plans: rèmol (Scophthalmus maximus) i el llenguado (Solea senegalensis). L'elecció d'aquest grup de teleostis es deu a l'extrema polaritat de pigmentació dors-ventral presenten els peixos plans, les nombroses malformacions pigmentàries que apareixen en en cultiu, i a la manca de seqüències gèniques caracteritzades d'ASIP1 de Pleuronectiforme. Els experiments demostraren que ASIP1 s'expressa massivament en la regió ventral i a penes és detectable en la regió dorsal. A més a més, els resultats demostren que l'expressió ectòpica d'ASIP1 podria ser la responsable del pseudealbinisme observat en els peixos en cultiu. En segon lloc, vaig desenvolupar una nova línia estratègica de peixos zebra (Danio rerio) (tgASIP1) que expressa el gen ASIP1 de carpa daurada (Carassius auratus) de forma constitutiva. Aquesta expressió ubícua trencava la polaritat de l'expressió d'ASIP1 en el tegument i, permetia que aquest antagonista accedira al MC4R cerebral. L'antagonisme competitiu d'ASIP sobre MC1R i M / [EN] Melanocortin system is a complex hormonal system involved in the regulation of several physiological functions. All melanocortin peptides are encoded by the same precursor called proopiomelanocortin (POMC) that integrates the different melanocyte-stimulating hormones (MSHs), the adrenocorticotropic hormones (ACTH) and the opioid peptide b-endorphin. Melanocortin signals through five different receptors (MC1R-MC5R) with different specificity showing a good example of co-evolutiorary processes. The melanocortin system is unique because the presence of endogenous antagonist the so-called: agouti-signalling protein (ASIP) and agouti-related protein(AGRP). In mammal species, ASIP works as an antagonist of MC1R thus unbalancing the pigment synthesis in the hair follicle from eumelanin (brown-black pigment) to pheomelanin (a yellow-red pigment). ASIP is responsible of the polarized dorsoventral pigment pattern present in most mammalian species. This polarity can be observed even when some other colour patterns are present. On the other hand, AGRP works as an antagonist of MC4R, a central receptor involved in the regulation of energy balance, throughout the regulation of satiety ASIP1 is also able to antagonize MC4R. This interaction does not occurs in the regular situation since ASIP is exclusively expressed in the tegument as a local protein and never reach the central MC4R. In the yellow mutant mouse strain [A(vy)/a], ASIP expression remains under the control of the Rely promotor that allow ubicuosly ASIP expression, including the brain, thus acting on MC4R. Disruption of MC4R signalling decrease satiety sensing thus promoting food intake, obesity and increased linear growth. In teleost fish endogenous antagonist are duplicated thanks to a specific extra genome duplication (R3). The four antagonist are initially identified as AGRP1, AGRP2, ASIP1 and ASIP2. Parsimony principle associated the skin expression of ASIP1 with the ventral pigmentary polarity of many species and the hypothalamic expression of AGRP with the control of food intake. The main goal of this doctoral thesis in to demonstrate the involvement of the melanocortin system in the regulation of pigment patterns and energy balance in fish by means of cause-effect relationships of this endogenous antagonist. To reach this objective, firstly I characterized ASIP1 in two different flatfish species, i.e. turbot (Scophthalmus maximus) and sole (Solea senegalensis). The selection of this teleost group is due to the extreme pigment dorsoventral polarity, the numerous pigment malformations in culture and the absence of characterized ASIP sequences in pleuronectiforms. The experiments demonstrate that ASIP1 is massively expressed in the ventral region and basically undetectable in the dorsal skin. Results also suggest that ectopic ASIP1 expression could be responsible of the flatfish pseudoalbinism. Subsequently, we developed a new transgenic zebrafish (Danio rerio) strain constitutively and ubicuosly overexpressing goldfish (Carassius auratus) ASIP1. The ubicuosly expression would break the dorsoventral polarity of ASIP expression in the tegumentum but also would allow reaching central MC4R. It would me allow to study at the same time the competitive antagonism on MC1R and MC4R and by extension the involvement of the melanocortin system in the regulation of pigmentation and energy balance. The experiments revealed that ASIP1 overexpression induces a ventralization of the dorsal skin by inhibiting the melanophore differentiation thus showing the existence of two differnnt pigment patterns. An ancestral dorsoventral pigment pattern on that the new stripped pattern is overimposed. Both pigment patterns are regulated in a different way since we can modify the dorsoventral pigment pattern without affecting the stripped pattern. In addition, the ubicuosly ASIP expression demonstrate the involvement of melanocortin system in the regulation of food intake and growth in fish. Food intake / La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en su mayor parte con los datos obtenidos gracias a la actividad desarrollada durante el contrato, como titulado medio de actividades técnicas y profesiones en el Instituto de Acuicultura de Torre de la Sal (IATS-CSIC), asociado al proyecto “Mejora de la producción en acuicultura mediante herramientas de biotecnología” (Aquagenomics) (CSD2007-00002), dentro del convenio CONSOLIDER 2010, financiado por el Ministerio de ciencia e Innovación y coordinado por el Dr. Antonio Figueras. Además, también se han utilizado recursos y resultados de los proyectos “Activación del sistema central de melanocortinas en la lubina (Dicentrarchus labrax): implicación en los efectos del estrés sobre la ingesta” (AGL2007- 65744-C03-02) financiado por el del Ministerio de Ciencia e Innovacion dentro de las ayudas del Ministerio a proyectos I+D y coordinado por el Dr. Jesús Miguez; y “Bases moleculares de la malformaciones pigmentarias en peces: Implicación en el cultivo de peces planos” (Incite09 402 193 PR) financiado por la Xunta de Galicia dentro del marco de ayudas a la Investigación Básica de la Xunta Gallega y dirigido por el Dr. Josep Rotllant. / Guillot Miralles, RV. (2019). IMPLICACIÓN DEL SISTEMA DE MELANOCORTINAS EN LA REGULACIÓN DE LA PIGMENTACIÓN Y EL CRECIMIENTO DE LOS PECES: PAPEL DE LOS ANTAGONISTAS ENDÓGENOS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/134059 / TESIS / Compendio

Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortina es una estructura clave en la regulación de una amplia gama de funciones fisiológicas que incluyen la melanogénesis, la respuesta al estrés y el equilibrio energético, mediante la unión a una familia de receptores acoplados a la proteína G específicos (MC1R-MC5R). La sobreexpresión de agonistas inversos, la proteína de señalización agutí (Asip) y la proteína relacionada con agutí (Agrp) da como resultado un aumento de la ingesta de alimentos, de crecimiento lineal y de peso corporal. Asip regula la polaridad de pigmentación dorsoventral a través del MC1R, y la sobreexpresión induce obesidad en ratones al unirse al Mc4r central. La sobreexpresión de asip1 en el pez cebra transgénico (asip1-Tg) mejora el crecimiento, sin afectar la acumulación lipídica (obesidad), incluso cuando se alimentan bajo regímenes inductores severos. Los peces asip1-Tg no necesitan comer más para crecer más y más rápido, lo que sugiere una mayor eficiencia alimentaria. Además, los peces asip1-Tg criados en alta densidad son capaces de crecer mucho más que los peces de tipo salvaje (WT) criados en baja densidad, aunque los peces asip1-Tg parecen ser más sensibles al estrés por hacinamiento que los peces WT. El análisis transcriptómico comparativo del intestino de asip1-Tg refleja una expresión diferencial de transportadores aminoácidicos, monocarboxilatos, transportadores iónicos y de vitaminas. La sobreexpresión reduce la integridad del epitelio intestinal aumentando su permeabilidad paracelular y potencia el transporte electrogénico de aminoácidos. Así, los peces transgénicos poseen mayor capacidad para la absorción de nutrientes y, por extensión una mejora en la eficiencia alimenticia que podría explicar, en parte, ese crecimiento diferencial bajo tasas de ingesta similares. Esta tesis tuvo también como objetivo investigar si los asip1-Tg mantienen un fenotipo dominante asociado con una mayor tasa de alimentación. Los resultados muestran, por el contrario, un carácter reactivo/subordinado en los asip1-Tg que aboga por una participación del sistema de melanocortinas en la regulación del comportamiento de peces. El perfil subordinado de los animales asip1-Tg, junto con una activación del eje del estrés, sugiere que estos animales pueden mostrar un comportamiento de ansiedad. Los resultados indicaron que los peces asip1-Tg muestran un comportamiento de ansiedad que además relacionado con una severa disminución de los niveles centrales de serotonina (5HT) y dopamina y elevación de su recaptación neuronal y degradación. La administración de un inhibidor de la recaptación de 5HT, recupera el fenotipo comportamental salvaje, mitigando el comportamiento de ansiedad en los peces transgénicos y rescatando los niveles de 5HT. Esta ansiedad podría repercutir en una alteración del comportamiento locomotor de los animales, por ello estudiamos los ritmos circadianos de actividad locomotora. Los resultados muestran que los animales asip1-Tg exhiben una disrupción completa del ritmo de actividad, con una actividad muy elevada, especialmente durante la noche. Esta disrupción es concomitante con una desaparición del ritmo diario de serotonina y melatonina. Además, los resultados muestran una pérdida de ritmos de expresión de genes reloj (per1a y clock1a). La incubación, in vitro, de glándulas pineales con Asip1 produjo una inhibición de la secreción de melatonina replicando los resultados obtenidos in vivo y demostrando un efecto directo de Asip1, sobre la fisiología de la pineal. En esta tesis, se utilizó el pez cebra como modelo para investigar los efectos de la obesidad sobre la ansiedad y la memoria. La obesidad no tuvo ningún efecto sobre la ansiedad, pero produjo una disminución de la memoria a corto plazo, estudiada mediante test de condicionamiento aversivo. Este estudio proporciona, un protocolo fiable para evaluar el efecto de las enfermedades metabólica en la función cognitiva y conductual. / [CA] El sistema de melanocortina és una estructura clau en la regulació d'una ampla gamma de funcions fisiològiques que inclouen la melanogènesi, la resposta a l'estrès i l'equilibri energètic, mitjançant la unió a una família de receptors acoblats a la proteïna G específics (MC1R-MC5R). La sobreexpressió d'agonistes inversos, la proteïna de senyalització agutí (Asip) y la proteïna relacionada con agutí (Agrp) dona com a resultat un augment de la ingesta d'aliments, de creixement lineal i de pes corporal. Asip regula la polaritat de pigmentació dors-ventral a través del MC1R, y la sobreexpressió indueix obesitat en ratolins en unir-se al MC4R central. La sobreexpressió de asip1 en el peix zebra transgènic (asip1-Tg) millora el creixement, sense afectar l'acumulació lipídica (obesitat), inclús quan s'alimenten sota règims inductors severs. Los peces asip1-Tg no necessiten menjar més per a créixer més i més ràpid, lo qual suggereix una major eficiència alimentària. A més a més, els peixos asip1-Tg criats en alta densitat són capaces de créixer molt més que els peixos de tipus salvatge (WT) criats en baixa densitat, malgrat que els peixos asip1-Tg semblen ser més sensibles a l'estrès per amuntegament que els peixos WT. L'anàlisi transcriptòmic comparatiu de l'intestí de asip1-Tg reflecteix una expressió diferencial de transportadors aminoacídics, monocarboxilats, transportadors iònics i de vitamines. La sobreexpressió redueix la integritat de l'epiteli intestinal augmentant la seua permeabilitat paracel·lular i potencia el transport electrogènic d'aminoàcids. Per tant, els peixos transgènics posseeixen major capacitat per l'absorció de nutrients i, per extensió una millora en la eficiència alimentària que podria explicar, en part, eixe creixement diferencial sota taxes d'ingesta similars. Aquesta tesi tingué també com a objectiu investigar si els asip1-Tg mantenien un fenotip dominant associat amb una major taxa d'alimentació. Els resultats mostren, pel contrari, un caràcter reactiu/subordinat en los asip1-Tg que advoca per una participació del sistema de melanocortines en la regulació del comportament de peixos. El perfil subordinat dels animals asip1-Tg, junt amb una activació de l'eix de l'estrès, suggereix que aquests animals poden mostrar un comportament d'ansietat. Els resultats indicaren que els peixos asip1-Tg mostren un comportament d'ansietat relacionat amb una severa disminució dels nivells centrals de serotonina (5HT) i dopamina i elevació de la seua recaptació neuronal i degradació. L'administració de un inhibidor de la recaptació de 5HT recupera el fenotip comportamental salvatge, mitigant el comportament d'ansietat en els peixos transgènics i rescatant els nivells centrals de 5HT. Esta ansietat podria repercutir en una alteració del comportament locomotor dels animals, per la qual cosa vam estudiar els ritmes circadians d'activitat locomotora. Els resultats mostren que els animals asip1-Tg exhibeixen una disrupció completa del ritme d'activitat, amb una activitat molt elevada durant tot el cicle diari, especialment durant la nit. Esta disrupció es concomitant amb una desaparició del ritme diari de serotonina i melatonina. A més a més, els resultats mostren una pèrdua de ritmes de expressió de gens rellotge (per1a y clock1a). La incubació, in vitro, de glàndules pineals con Asip1 va produir una inhibició de la secreció de melatonina replicant els resultats obtinguts in vivo y demostrant un efecte directe de Asip1 sobre la fisiologia de la pineal. En esta tesi, se va utilitzar el peix zebra com a model per investigar els efectes de la obesitat sobre la ansietat i la memoria. L'obesitat no va tindre cap efecte sobre l'ansietat, però va produir una disminució de la memòria a curt termini, estudiada mitjançant tests de condicionament aversiu. Aquest estudi proporciona, un protocol fiable per a avaluar l'efecte de les malalties metabòliques en la funció cognitiva i conductual. / [EN] The melanocortin system plays a key role in the regulation of a wide range of physiological functions including melanogenesis, stress response and energy balance, through binding to a family of specific G protein-coupled receptors (MC1R-MC5R). Overexpression of inverse agonists, agouti-signalling protein (Asip) and agouti-related protein (Agrp) results in increased food intake, linear growth and body weight. Asip regulates dorso-ventral pigmentation polarity through MC1R, and over-expression induces obesity in mice by binding to the central MC4R. Overexpression of asip1 in transgenic zebrafish (asip1-Tg) enhances growth, without affecting lipid accumulation (obesity), even when fed under severe inducing regimens. The asip1-Tg fish do not need to eat more to grow bigger and faster, suggesting increased feed efficiency. In addition, asip1-Tg fish reared at high density are able to grow much larger than wild-type (WT) fish reared at low density, although asip1-Tg fish appear to be more sensitive to overcrowding stress than WT fish. Comparative transcriptomic analysis of asip1-Tg gut reflects differential expression of amino acid, monocarboxylate, ionic and vitamin transporters. Overexpression reduces the integrity of the intestinal epithelium by increasing its paracellular permeability and enhances electrogenic amino acid transport. Thus, transgenic fish possess a greater capacity for nutrient absorption and, by extension, an improvement in feed efficiency that could explain, in part, this differential growth under similar intake rates. This thesis also aimed to investigate whether asip1-Tg maintain a dominant phenotype associated with a higher feeding rate. Experimental results show, on the contrary, a reactive/subordinate character in asip1-Tg which argues for an involvement of the melanocortin system in the regulation of fish behaviour. Improving feeding motivation without promoting aggression in fish, thus avoiding the threat to native populations in case of an escape, makes the inhibition of the melanocortin system, through the overexpression of asip1, a feasible target for the development of genetically modified lines. The subordinate profile of the asip1-Tg animals, together with an activation of the stress axis, suggests that these animals may exhibit anxiety-like behaviour. The results indicated that asip1-Tg fish show a behaviour similar to our concept of anxiety related to a severe decrease in central serotonin (5HT) and dopamine levels as well as the elevation of their neuronal reuptake and degradation. The administration of fluoxetine, a serotonin reuptake inhibitor, recovers the wild-type behavioural phenotype, mitigating anxiety behaviour in transgenic fish and restoring central 5HT levels. This anxiety could have repercussions on the locomotor behaviour of the animals, so we studied circadian rhythms of locomotor activity. The results show that asip1-Tg animals exhibit a complete disruption of the activity rhythm, with very high activity levels throughout the daily cycle, especially during the night. This disruption is concomitant with a disappearance of the daily rhythm of serotonin and melatonin. In addition, the results show a loss of clock gene expression rhythms (per1a and clock1a). Incubation, in vitro, of pineal glands with Asip1 produced an inhibition of melatonin secretion replicating the results obtained in vivo and demonstrating a direct effect of Asip1 on pineal physiology. In this PhD thesis, zebrafish was used as a model to investigate the effects of overfeeding-induced obesity on anxiety-like behaviour and memory. Obesity had no effect on anxiety, but produced a decrease in short-term memory, studied by means of aversive conditioning tests. This study also provides a reliable protocol for assessing the effect of metabolic diseases on cognitive and behavioural function, supporting zebrafish as a model for cognitive and behavioural neuroscience. / Esta tesis ha sido realizada a través del programa de ‘Ayudas para la formación de personal investigador’ (FPI) BES‐2017‐082424 de la Agencia Estatal de Investigación, en Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Grupo de investigación de Control de la Ingesta en Peces dirigido por José Miguel Cerdá Reverter, director de esta tesis. Los trabajos llevados a cabo en esta tesis han sido financiados por Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICIU) a través de los siguientes proyectos: MELANOCONDUCT: Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los mecanismos temporales y conductuales de peces AGL2016-74857-C3-3-R; Cronopeces: Red temática de cronobiología de peces y sus aplicaciones en acuicultura RED2018-102487-T; MacForFish: Nuevos aspectos homeostáticos y comportamentales de la regulación de la ingesta en peces PID2019-103969RB-C33; FISHTASTE: Implicación de los mecanismos sensoriales del gusto en la regulación de la ingesta de peces - Involvement of taste sensing mechanisms in the regulation of feed intake of fish PID2022-136288OB-C33 / Godino Gimeno, A. (2024). Involvement of the Melanocortin System in the Regulation of Circadian and Behavioural Mechanisms in Zebrafish [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203148 / Compendio

Tesis por compendio de publicaciones / La luz y los patrones de alimentación influyeron sobre el comportamiento, fisiología y reloj molecular de dos peces teleósteos. Se clonaron dos criptocromos de lubina (cry1 y cry2), expresándose en todos los tejidos estudiados y mostrando ritmos diarios de expresión en cerebro, hígado y corazón (excepto cry2). La fase (día/noche) de alimentación a demanda en lubina afecta a los patrones diarios de actividad amilasa intestinal y expresión de period1 en tejidos periféricos (i.e. hígado), pero no en cerebro. Durante las inversiones estacionales de alimentación de la lubina, mostraron mayores valores de glucosa sanguínea durante la fase de alimentación, revelando también los mayores valores medios en lubinas nocturnas invierno. El pez cebra utilizó un nuevo comedero a demanda, mostrando independencia de fase entre ritmos circadianos de alimentación (nocturno) y locomoción (diurno), con diferentes periodicidades. Además la actividad y posición del pez cebra resultó espectro-dependiente, provocando mayores efectos las longitudes de onda cortas. / Thesis summary in English Light and feeding patterns influence on the behaviour, physiology and molecular clock of two teleost fish. Two cryptochromes (cry1 and cry2) were cloned, being expressed in all studied tissues and showing daily rhythm of expression in brain, liver and heart (except cry2). The self-seabass feeding phase (day/night) affected on daily patterns of intestinal amylase activity and on the period1 expression in peripheral tissues (i.e. liver), but not in brain. During the seasonal feeding inversions in seabass, the highest blood glucose levels were shown during their feeding phase, revealing also the highest values in nocturnal seabass in winter. Zebrafish used a new self-feeding system, displaying phase-independence between feeding (nocturnal) and locomotor (diurnal) circadian rhythms, with different periodicities. Moreover, the zebrafish activity and vertical position were spectrum-dependent, being the main effects provoked by short-wavelengths.