Human activities have being responsible for the global environmental changes, resulting in an increase number of incident of vector- and rodent-borne diseases worldwide. Rodents and arthropods-borne viruses are important globally emerging and re-emerging viruses and most of them are RNA viruses. Efficient and early diagnosis of these infections are very important to prevent their spread, to improve clinical management of the patients, as wells to protect livestock and domestic animals. Currently, available diagnostic methods such as immunoassays, polymerase chain reaction and virus isolation can detect only one or few viruses in a single assay. The DNA microarray platform has emerged as diagnostic tool suitable for high throughput screening of pathogenic agents. The aim of this study was to develop a DNA microarray platform (RoboArboVirusChip) for detecting rodent- and arthropod-borne viruses, which belong to seven families: Bunyaviridae (genera Orthobunyavirus, Nairovirus and Phlebovirus), Flaviviridae (genus Flavivirus), Togaviridae (genus Alphavirus), Reoviridae (genera Orbivirus, Seadornavirus and Coltvivirus), Rhabdoviridae (genera Vesiculovirus and Ephemerovirus), and Asfarviridae (genus Asfarvirus). Specific oligonucleotide probes of 60-mer (n=4209) targeting 412 virus species and generic probes of 25-35-mer (n=87) targeting viruses at the genus level were designed. A total of 17 reference viruses belonging to the Bunyaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae and Togaviridae families were used to standardize RoboArboVirusChip. All reference viruses were specifically detected without any cross hybridization; however, the generic probes were not able to identify the viruses at the genus level. The RoboArboVirusChip was able to specifically identify four viruses contained in three different mixtures: i) virus of different families, ii) virus of the Flavivirus genus, and iii) the Dengue virus (DENV) serotypes. The four DENV serotypes were use to evaluate the sensitivity of the RoboArboVirusChip, which was able to detect a minimum of 25 RNA copies/mL of the viruses, confirming its high sensitivity. The applicability of the RoboArboVirusChip to detect viruses in clinical samples was tested with serum samples obtained from dengue suspected cases (four positive cases and 40 negative cases). DENV was detected in the four positive serum samples, while in the 40 negative serum samples, it was not detected any virus. The results obtained in this study suggest that the RoboArboVirusChip platform could be a useful tool for early diagnosis of robovirus and arbovirus infections during epidemic outbreaks, helping in the rapid implementation of disease containment strategies / As atividades humanas têm sido responsável por mudanças ambientais globais, resultando num aumento do número de casos de doenças transmitidas por vetores e roedores em todo o mundo. Os vírus transmitidos por roedores e artrópodes são vírus emergentes e re-emergentes de importância global, sendo que a maioria deles são vírus de RNA. O diagnóstico eficiente e precoce dessas infecções são muito importantes para evitar a sua propagação, para melhorar o manejo clínico dos pacientes e também, para proteger o gado e os animais domésticos. Atualmente, os métodos de diagnóstico disponíveis, tais como os imunoensaios, a reação em cadeia da polimerase e o isolamento viral podem detectar apenas um ou poucos vírus em um único ensaio. A plataforma de microarranjo de DNA tem surgido como uma ferramenta de diagnóstico apropriada para o monitoramento em larga escala de agentes patogênicos. O objetivo deste estudo foi desenvolver uma plataforma de microarranjo de DNA (RoboArboVirusChip) para a detecção de vírus transmitidos por roedores e artrópodes, os quais pertencem a sete famílias: Bunyaviridae (gêneros Orthobunyavirus, Nairovirus e Phlebovírus), Flaviviridae (gênero Flavivirus), Togaviridae (gênero Alphavirus), Reoviridae (gênero Orbivirus, Seadornavirus e Coltvivirus), Rhabdoviridae (géneros Vesiculovirus e Ephemerovirus), e Asfarviridae (gênero Asfarvirus). Sondas oligonucleotídicas de 60-mer (n=4209) específicas contra 412 espécies virais, e sondas genéricas de 25-35-mer (n=87) para detecção de vírus a nível do gênero foram desenhados. Um total de 17 vírus de referência, pertencentes às famílias Bunyaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae foram utilizados para padronizar o RoboArboVirusChip. Todos os vírus de referência foram detectados especificamente sem apresentação de hibridação cruzada, porem as sondas genéricas não foram capazes de detectar os vírus a nível do gênero. O RoboArboVirusChip foi capaz de identificar especificamente quatro vírus contidos em diferentes misturas: i) vírus de diferentes famílias, ii) vírus pertencentes ao gênero a Flavivirus, e iii) os sorotipos do vírus da dengue (DENV). Os quatro sorotipos do DENV foram utilizados para determinar a sensibilidade do RoboArboVirusChip, o qual foi capaz de detectar um mínimo de 25 copias de RNA/mL. A aplicabilidade do RoboArboVirusChip para detectar vírus em amostras clínicas foi avaliada testando amostras de soro de pacientes com suspeita de dengue (quatro casos positivos e 40 casos negativos). Os resultados obtidos neste estudo sugerem que o RoboArboVirusChip poderá ser uma ferramenta útil para o diagnóstico precoce da infecção causada por robovírus e arbovírus, auxiliando na rápida implementação de estratégias de contenção das doenças causadas por esses vírus
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04052017-153411 |
| Date | 01 December 2015 |
| Creators | Khan, Mohd Jaseem |
| Contributors | Quintana, Victor Hugo Aquino |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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