Este estudo apresenta o desenvolvimento e validação de uma nova abordagem para a avaliação do cálcio intracelular em culturas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-CM - do inglês human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes) que pode ser aplicada para avaliar o efeito de drogas no acoplamento excitação-contração. O método consiste na estimulação elétrica e medição conjunta da fluorescência de forma automatizada e foi viabilizado a partir da inclusão de um sistema de estimulação elétrica em um leitor de ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Um estimulador eletrônico compacto foi projetado para operar junto a um leitor de placas gerando pulsos quadrados monofásicos com duração de 5 ms e campo elétrico de 8 Vcm-1 aplicados por microeletrodos metálicos de platina-irídio em células em cultura. Uma placa de cultura normalmente utilizada em leitor de placas foi modificada para permitir a colocação do estimulador e dos eletrodos. A intensidade de fluorescência do cálcio intracelular foi avaliada utilizando um leitor de ELISA durante a estimulação elétrica em culturas de células marcadas com o indicador de Ca2+ Fluo-4 AM. A estimulação elétrica das células resultou em contrações regulares nas frequências de 0,1 Hz; 0,2 Hz; 0,3 Hz e 0,5 Hz induzidas pelo estimulador. Parâmetros dos transientes de cálcio foram estudados após a exposição de culturas de células ao Verapamil (0,05; 0,5 e 5,0 µM), a amplitude e a inclinação máxima da fase de subida foram progressivamente reduzidas com doses crescentes da droga. Os dados obtidos demonstraram que o método apresentado permite a avaliação automatizada de transientes de cálcio durante a estimulação elétrica de culturas de hiPSC-CM utilizando o sistema de estimulação em um leitor de ELISA. Esses resultados validaram a aplicabilidade do sistema ao estudo das alterações da dinâmica do cálcio intracelular induzidas por drogas em células sob estimulação elétrica. O sistema de avaliação automatizada desenvolvido pode ser ampliado para realizar a triagem de alto rendimento em bibliotecas de compostos que tem como alvo o acoplamento excitação-contração em células cardíacas humanas in vitro. / This study presents the development and validation of a new approach for the evaluation of intracellular calcium in cultures of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM), which can be applied to evaluate the effect of drugs on excitation-contraction coupling. The method consists of electrical stimulation and joint measurement of fluorescence in an automated manner and was made possible by the inclusion of an electrical stimulation system in an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). A compact electronic stimulator was designed to operate inside a plate reader generating monophasic square pulses with duration of 5 ms and electric field of 8 Vcm-1 applied by platinum-iridium metal microelectrodes to cells in culture. A culture plate used in a plate reader was modified to allow placement of the stimulator and electrodes. Fluorescence intensity of intracellular calcium was measured during electrical stimulation of cell cultures loaded with Ca2+ Fluo-4 AM indicator using a plate reader. The electrical stimulation of the cells generated regularly spaced contractions following the pace of the stimulator at the frequencies of 0.1 Hz, 0.2 Hz, 0.3 Hz and 0.5 Hz. Transient profile parameters were studied after treating cell cultures with Verapamil (0.05, 0.5 and 5.0 µM) the amplitude and the maximum slope of rising phase were progressively reduced with increasing verapamil doses. The data obtained demonstrated that the method presented allows the automated evaluation of calcium transients during the electrical stimulation of hiPSC-CM cultures using the stimulation system in an ELISA reader. These results demonstrated the applicability of the system to the study of changes in the intracellular calcium dynamics induced by drugs in electrically stimulated cells. The system developed is amenable to scaling thus allowing high content automated drug library screening for compounds that target the excitationcontraction coupling in human heart cells in vitro.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-27082018-134139 |
| Date | 15 May 2018 |
| Creators | Veronez, Douglas Martins |
| Contributors | Cestari, Idágene Aparecida |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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