A necessidade de dispositivos analíticos para detecção precoce de câncer tem motivado pesquisas em nanomateriais de baixo custo, com busca de sinergia para obter alta sensibilidade e seletividade em biossensores. Neste trabalho, o ácido 11-mercaptoundecanóico, o polímero natural quitosana e a proteína concanavalina A (Con A) foram usados como plataforma para imobilizar anticorpos anti-CA 19-9 e construir biossensores para detecção de câncer de pâncreas. Esses biossensores foram produzidos com uma matriz de filmes automontados por adsorção química (self-assembled monolayers, SAM) e por adsorção física (layer-by-layer, LbL). A caracterização com técnicas espectroscópicas e gravimétricas permitiu selecionar as arquiteturas com quitosana/ Con A 2:1 (sensor A), quitosana/ Con A 1:1 (sensor B) e 11-MUA (sensor E), como sendo mais favoráveis à imobilização do anticorpo anti-CA 19-9. Usando os biossensores com espectroscopia de impedância foi possível detectar baixas concentrações do biomarcador CA 19-9, com limites de detecção entre 0,17-0,69 U/mL, 0,31-0,91 U/mL e 0,56-0,91 U/mL para os sensores A, B e E, respectivamente. Esses limites são suficientes para detectar câncer de pâncreas nos estágios iniciais. A seletividade dos dispositivos foi inferida em uma série de experimentos de controle com amostras de células SW 620 e HT-29, ácido úrico, ácido ascórbico, glicose, manose, sérum e antígeno p24, indicando ausência de interferência não específica ao biomarcador. O uso de técnicas de visualização de informação permitiu facilmente distinguir essas amostras, classificando-as de acordo com a concentração do biomarcador em um mapa. Permitiu também quantificar a seletividade dos biossensores através do coeficiente de silhueta, com valores 0,853, 0,861 e 0,897 para os sensores A, B e E, respectivamente. Essa especificidade dos biossensores foi confirmada por medidas de PM-IRRAS, através das bandas de amida I e II em 1566 cm-1 e 1650 cm-1, indicando a interação específica entre anticorpo e antígeno, que pode ser modelada com uma isoterma de Langmuir-Freundlich. Quando a matriz de quitosana/ Con A foi substituída por um filme monocamada ou quando se empregou um biomarcador de maior peso molecular, a adsorção do biomarcador foi explicada por uma combinação de dois processos de Langmuir-Freundlich. Conclui-se que os biossensores de baixo custo podem ser eficientes para diagnóstico e prognóstico, e serem implementados na rede nacional de saúde com disseminação da tecnologia. / The need of analytical devices to detect cancer at early stages has motivated research into nanomaterials where synergy is sought to achieve high sensitivity and selectivity in biosensors. In this work, 11-mercaptoundecanoic acid, the polymer chitosan and the protein concanavalin A (Con A) were used as a platform to immobilize the anti-CA 19-9 antibody using the self-assembled monolayer (SAM) and the layer-by-layer (LbL) techniques. The characterization with spectroscopic and gravimetric techniques allowed us to select the architectures with chitosan/Con A 2:1 (Sensor A), chitosan/Con A 1:1 (Sensor B) and 11 MUA (Sensor E) as optimized for immobilization of anti-CA 19-9 antibodies. Using impedance spectroscopy, the biosensors were capable of detecting low concentrations of CA 19-9 biomarker, with limit of detection in the range 0.17-0.69 U/mL, 0.31-0.91 U/mL and 0.56-0.91 U/mL for sensors A, B and E, respectively. These limits are sufficient to detect pancreatic cancer at early stages. The selectivity of the biosensors was inferred in a series of control experiments with cell samples SW-620 and HT-29, uric acid, ascorbic acid, glucose, mannose, serum and p24 antigen, indicating the absence of non-specific interference. With information visualization techniques, these samples could be easily distinguished in a visual map, and be classified according to their content of CA 19-9. Furthermore, the selectivity could be quantified through the silhouette coefficient, with values 0.853, 0.861 and 0.897 for sensors A, B and E, respectively. This biosensor specificity was confirmed with PM-IRRAS measurements by monitoring the amide I and II bands at 1566 cm-1 and 1650 cm-1. The specific interaction between antibody and antigen was modeled with a Langmuir-Freundlich isotherm. When the chitosan/Con A matrix was replaced by a SAM monolayer or if a larger biomarker was employed, adsorption was explained by a combination of two Langmuir-Freundlich processes. In conclusion, low cost biosensors may be effective for diagnostics and prognostics, and may be further implemented in the Brazilian national health system with technology transfer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30032017-080111 |
| Date | 16 February 2017 |
| Creators | Soares, Andrey Coatrini |
| Contributors | Oliveira Junior, Osvaldo Novais de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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