No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

We recently developed a novel strategy termed “combi-targeting” that seeks to design “combi-molecules” which are able to not only block EGFR but to also damage DNA. Previous studies that sought to stabilize triazene based combi-molecules were based on masking the 1,2,3-triazene chain with a 2-acetoxymethylene group, leading to the synthesis of RB24 and RB107. The half-lives of these two molecules proved to be only about 5 minutes longer than their parent triazenes. The novel series of molecules presented herein were designed containing hydrolysable groups to modulate the kinetics of their degradation,. These include vinyl, acetoxymethyloxyl, and p-nitrophenol carbamates. Kinetic studies determined that the vinyl carbamate ZRL2 was the most stable of the series. However, its vinyl counterpart ZRL1 designed to be cleaved by a basic neighbouring group was the least stable. The half-lives of all of the other molecules were significantly longer than that of RB107. Specifically, ZRL1 had a half-life approximately 20 min longer and ZRS1, ZRL4, ZRL5 40-55 min longer. The molecules were designed to release a fluorescent aminoquinazoline, FD105, upon degradation. This allowed us to observe its intracellular release by fluorescent microscopy. ZRL1 generated the highest level of fluorescence and its more stable counterpart, ZRL2, produced levels that were barely detectable. Studies directed at determining the dual EGFR-DNA targeting abilities of the molecules showed that: (a) all of the compounds were capable of blocking the EGFR tyrosine kinase activity in an isolated enzyme assay and in MDAMB468 cells, (b) all of the molecules, except for the most stable compound ZRL2, were capable of inducing dose-dependent DNA damage, and (c) induction of DNA damage was associated with cell cycle arrest in G2/M. Using a growth inhibition assay, it was determined that all of the molecules could: (a) block the growth of MDAMB468 cells and (b) preferentially inhibit the EGFR transfe / Nous avons récemment mis au point une nouvelle stratégie dénommée “combi-ciblage” : cette stratégie est basée sur des agents appelés “combi-molécules”, capables non seulement de bloquer l’EGFR, mais aussi d’induire des lésions de l’ADN. Des études antérieures réalisées au laboratoire et ayant pour but de masquer la chaîne 1,2,3-triazène de certaines combi-molécules par un groupement 2-acétoxyméthylène afin de les stabiliser ont conduit à l’obtention des composés RB24 et RB107. Ces travaux n’ont toutefois pas permis d’augmenter de manière significative les temps de demi-vie de ces deux molécules, puisqu’ils n’étaient supérieurs que d'environ 5 minutes aux temps de demi-vie des molécules triazéniques initiales. Les nouvelles séries de molécules présentées dans cette thèse contiennent un groupement carbamate hydrolysable permettant d’optimiser leur cinétique de dégradation. D’autres modifications ont été également appliquées, notamment l'ajout de différents groupements tels que des vinyl, acétoxyméthyloxyl, et p-nitrophénol carbamates. Ainsi, les études cinétiques ont montré que le vinyl carbamate ZRL2 est le plus stable de ces séries. En revanche, son homologue vinylique ZRL1, conçu pour être clivé par un groupement basique voisin, s’est avéré être le moins stable avec un temps de demi-vie toutefois supérieur d’environ 20 minutes à celui du RB107. Les temps de demi-vie des autres composés se sont significativement allongés, notamment pour ZRS1, ZRL4, et ZRL5, dont les temps de demi-vie dépassent de 40 à 55 minutes celui du RB107. De plus, ces molécules ont été conçues pour libérer un groupement fluorescent de type aminoquinazoline (FD105) au cours de leur dégradation. Par conséquent, nous pouvons observer leur localisation intracellulaire, de même que leur abondance, par microscopie à fluorescence. Ainsi, ZRL1 génère la plus grande quantité de fluorescence, tandis$

The proliferation dynamics in vitro of the obligate intracellular protozoan parasite Leishmania donovani was studied for 14 days in resting monolayers of peritoneal macrophages of C57BL/6 $(Lsh sp{ rm s})$ mice inoculated with 5, 50, or 500 promastigotes/cell. Irrespective of the inoculum, only 50 to 65% of the cells became infected initially; only 3 to 6 amastigotes were present in each macrophage initially, suggesting a limited number of parasite ligands on the host cell. The amastigotes did not divide in the first 3 or 4 days after infection and then they actively proliferated from day 5 to day 8; the number of parasites was then reduced. Infection with L. donovani down-regulates immunity and parasite clearance by macrophages, but IL-2-stimulated splenocytes activate leishmanicidal action in vitro in infected peritoneal macrophages and in vivo in C57BL/6 (Lsh$ sp{ rm s})$ mice. IL-2-stimulated splenocytes were most effective when used in the non-proliferating phase of the infection, whereas the anti-leishmanial drug Pentostam was most effective when used during the proliferative phase. Immunochemotherapy was more effective than either treatment alone. Infection with L. donovani abolishes the ability of macrophages to produce the superoxide and INO microbicidal responses; curative treatment with IL-2-stimulated splenocytes restores the ability of infected macrophages to secrete inorganic nitrogen oxides, but not to produce a superoxide response. Pentostam had no effect to stimulate either microbicidal mechanism in infected cells; the drug is, therefore, probably directly toxic to the parasite. These studies have indicated, among other things, that IL-2-stimulated splenocytes rescue infected cells and infected animal from the immunological deficit which L. donovani induces, allowing the re-establishment of those mechanisms that make the macrophage an essential component of the host's protective immune system.

Arsenic trioxide (ATO) is a successful treatment option for Acute Promyelocytic Leukemia (APL), but other cancers remain mildly sensitive to ATO at clinically achievable doses. Moreover, APL cells can develop resistance to ATO. It has been shown that resistance to ATO and/or moderate sensitivity correlates with either modulation of arsenic transport or increased expression of cytoprotective enzymes. Darinaparsin (S-dimethylarsino-GSH; Dar) is a significantly more potent apoptosis-inducing arsenical than ATO in various malignant cell lines and in APL patient blasts. It also has a maximum tolerated dose that is 35-fold higher than ATO. Interestingly, ATO-resistant APL cells are sensitive to Dar. Dar accumulates in the cell to a greater extent that ATO, which led us to the hypothesis that Dar import might also contribute to its enhanced efficacy. We show that both ATO and Dar induce the expression of the cystine importer xCT. We found that extracellular thiols inhibit Dar intracellular accumulation, as well as apoptosis. Thus, we hypothesized that thiols can prevent Dar import. GSH itself is not imported in the cell, so we thought it unlikely that Dar would enter the cell without being somehow modified. Structural analysis of Dar reveals putative break-down products: dimethylarsino-cysteine (DMAC), dimethylarsenic III (DMA III) and dimethylarsenic V (DMA V). We show that treatment with DMA III and DMA V does not lead to intracellular accumulation of arsenic, and correlates with their inability to induce cell death. However, DMAC is very similar to Dar in terms of intracellular accumulation of arsenic, G2/M arrest and cell death. As with Dar, thiols can inhibit DMAC effects. Therefore, we hypothesize that Dar gets transformed extracellularly into DMAC, which is imported via xCT or another cystine/cysteine importing system. We validated this hypothesis by shRNA knock-down of xCT. We also hypothesized that the increased cytotoxicity of Dar may be due to a decreased cytoprotective response, and therefore studied the expression of stress response enzymes after ATO and Dar treatment. We observed a lack of expression of one of the nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 phase-II (NRF2)-dependant detoxifying enzymes, heme-oxygenase 1 (HO-1), after Dar treatment, compared to ATO. We found that Dar does not recruit NRF2 to the HO-1 promoter's antioxidant response elements (AREs). We also found that Dar treatment did not recruit Brahma-related gene 1 (BRG1) coactivator to HO-1 AREs. BRG1 localization has been linked to cell cycle and we found that ATO induces a G1 arrest while Dar induces a G2/M arrest. Importantly, we found the Dar induced G2/M arrest to correlate with hyper-phosphorylated BRG1 causing it to be excluded from the chromatin, preventing HO-1 induction. In order to elucidate the cytoprotective effect of HO-1, we examined the cytotoxicity of ATO and Dar following pharmacological or genetic inhibition HO-1. We showed that inhibition of HO-1 increased the toxicity of ATO, but had no effect on Dar-induced apoptosis. We also showed that BRG1 silenced NB4 cells exhibit reduced HO-1 expression in response to ATO, and are more sensitive to ATO-induced apoptosis. We conclude that the lack of HO-1 activation is partially responsible for Dar's enhanced anti-tumor properties. Cells respond to arsenicals by increasing cystine uptake and HO-1 expression, which leads to protection against ATO but hypersensitivity to Dar. / Le trioxyde d'arsenic (ATO) est un traitement efficace contre la leucémie promyelocytaire aigue (APL), mais les autres types de cancers y sont peu sensibles à des doses utilisables en clinique. De plus, les cellules APL peuvent développer une résistance contre ATO. La résistance contre ATO et/ou une sensibilité modérée est associée à la modulation du transport de l'arsenic ou à une augmentation de l'expression d'enzymes cytoprotectrices. Darinaparsin (S-dimethylarsino-GSH; Dar) est un dérivé d'arsenic, inducteur d'apoptose, plus puissant qu'ATO dans plusieurs lignées cellulaire malignes et dans des blasts de patient APL. La dose maximum tolérée pour Dar est 35 fois plus élevée par rapport à ATO. Les cellules APL résistantes à ATO sont sensibles à Dar. Dar s'accumule plus dans la cellule qu'ATO, ce qui nous a menés vers l'hypothèse selon laquelle l'import de Dar contribue à son efficacité élevée. Nous montrons qu'ATO et Dar induisent l'expression de l'importateur de cystine xCT. Nous avons trouvé que des thiols extracellulaires inhibent l'accumulation intracellulaire de Dar, ainsi que l'apoptose. Ainsi, nous avons formulé l'hypothèse selon laquelle les thiols peuvent empêcher l'import de Dar. GSH en tant que telle n'est pas importée dans la cellule, nous avons donc pensé qu'il serait improbable que Dar entre dans la cellule sans être modifié. L'analyse structurelle de Dar révèle des produits potentiels de dégradation : dimethylarsino-cysteine (DMAC), dimethylarsenic III (DMA III) et dimethylarsenic V (DMA V). Nous montrons que DMA III et DMA V ne conduisent pas à l'accumulation intracellulaire d'arsenic, ce qui correspond à leur inaptitude à induire la mort cellulaire. Cependant, DMAC est très similaire en terme d'accumulation intracellulaire d'arsenic, arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M et mort cellulaire. Tout comme avec Dar, les thiols peuvent inhiber les effets de DMAC. Ainsi, nous formulons l'hypothèse selon laquelle Dar est transformé à l'extérieur de la cellule en DMAC, qui est importé via xCT ou d'autres systèmes d'import de la cysteine/cystine. Nous avons validé cette hypothèse grâce à une atténuation de l'expression de xCT par shRNA. Nous avons également formulé l'hypothèse selon laquelle la cytotoxicité accrue de Dar pourrait être due à une réponse cytoprotectrice décrue, et avons donc étudié l'expression des enzymes de réponse au stress. Nous avons observé un manque d'expression d'une des enzymes de détoxification dépendantes du facteur nucléaire erythroid-derived 2-like 2 phase-II (NRF2), heme-oxygenase 1 (HO-1), après le traitement avec Dar, en comparaison avec ATO. Nous montrons que Dar ne recrute pas NRF2 à l'élément de réponse antioxydante (ARE) du promoteur de HO-1. Nous montrons aussi que le traitement avec Dar ne recrute pas le co-activateur Brahma-related gene 1 (BRG1) au ARE de HO-1. La localisation de BRG1 a été reliée au cycle cellulaire et nous avons montré que ATO induit un arrêt en phase G1 tandis que Dar induit un arrêt en phase G2/M. Nous avons montré qu'il y a une corrélation entre l'arrêt en phase G2/M induit par Dar et une hyper-phosphorylation de BRG1 induisant son exclusion de la chromatine, empêchant ainsi l'induction de HO-1. De façon à élucider l'effet cytoprotectif de HO-1, nous avons examiné la cytotoxicité de ATO et Dar après une inhibition pharmacologique ou génétique de HO-1. Nous avons montré que l'inhibition de HO-1 augmente la toxicité d'ATO mais pas celle de Dar. Nous avons également montré que des cellules NB4 n'exprimant plus BRG1 ont une expression réduite d'HO-1 en réponse à ATO, et sont plus sensibles à l'apoptose induite par ATO. Nous concluons que le manque d'activation de HO-1 est partiellement responsable de l'efficacité anti-tumorale accrue de Dar. Les cellules répondent à l'arsenic en augmentant l'import de la cystine et l'expression d'HO-1, ce qui conduit à une protection face à ATO mais à une hypersensibilité à Dar.

Arsenic trioxide (ATO) is an effective treatment for acute promyelocytic leukemia (APL). While it is undergoing clinical trials for numerous malignancies including multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, lymphoma and solid tumors, it has demonstrated only limited efficacy as a single agent. However, it may hold promise as part of a combination therapy. Thus investigation to elucidate the mechanisms of action underlying these clinical responses may lead to generation of rational combination therapies to increase its therapeutic spectrum. Previous work has described a pathway required for ATO-induced apoptosis in APL cells involving the generation of reactive oxygen species (ROS), and the subsequent induction of a specific mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade that includes both stress-activated protein kinase (SAPK)/ERK kinase 1 (SEK1) and c-Jun N-terminal kinases (JNK) activation. However, the link between ROS production and activation of SEK1 remains to be elucidated. Apoptosis signaling kinase 1 (ASK1) is a MAP3K upstream of SEK1 that has been implicated in the induction of stress-induced signaling.Using murine embryonic fibroblasts (MEFs) derived from ASK1-/- mice; we provide evidence that ASK1 is a strong mediator for ATO-induced apoptosis and JNK activation. In an APL cell line, we show that ATO activates ASK1 in a dose- and time-dependent manner. However, knockdown of ASK1 in APL cells enhanced susceptibility to ATO, undergoing apoptosis and growth inhibition more than their wild type counterparts. The same impact was observed in the knockdown of SEK1, a direct downstream MAP2K of ASK1, and the knockdown of ASK1 in MCF-7 cells, a human breast cancer cell line. This led us to postulate that ASK1 had a pro-apoptotic function in non-transformed fibroblasts, but was pro-survival in malignant cells. Indeed, transformation of ASK1-/- MEFs restored their sensitivity to ATO-induced apoptosis and growth inhibition. Taken together, these results suggest that ASK1 can have both pro-apoptotic and anti-apoptotic roles depending on the transformation state of the cells.One model of ASK1 regulation suggests that ASK1 is kept in an inactive form by reduced thioredoxin-1 (Trx1). During oxidative stress, Trx1 is oxidized and releases ASK1 for activation. Immunoprecipitation of ASK1 followed by immuoblotting for Trx1 in APL cells shows a strong basal association that is lost with ATO treatment. Furthermore, the activity of thioredoxin reductase 1 (TrxR1), an enzyme that converts oxidized Trx1 into reduced Trx1, is significantly decreased following ATO treatment. This suggests that ATO activates ASK1 signaling by ROS-mediated oxidation of Trx1 and by maintaining Trx1 in its oxidized state by decreasing TrxR1 activity. In addition, we show that inhibition of TrxR1 with the TrxR1 inhibitor Auranofin sensitizes APL cells to ATO-induced apoptosis. Overall, our results suggest that targeting Trx1 may enhance ATO-induced apoptosis in a novel combination therapy. / L'arsenic trioxyde (ATO) est un traitement efficace contre la leucémie promyélocitaire aïgue (APL). Alors qu'il est testé dans le cadre de plusieurs essais cliniques sur différents cancers comme le myélome multiple, le syndrome myélodysplasique, le lymphome et les tumeurs solides, il ne montre qu'une efficacité limitée en tant qu'agent unique. Quoiqu'il en soit, il pourrait être prometteur au sein d'une thérapie combinée. Ainsi, l'étude des mécanismes d'action responsables des bénéfices cliniques apportés par l'arsenic trioxide pourrait mener à la mise au point de nouvelles thérapies combinées afin d'élargir le spectre thérapeutique d'ATO. Des travaux antérieurs ont décri une voix de signalisation, requise pour l'induction de l'apoptose par l'arsenic dans des cellules d'APL, qui implique la génération d'espèces actives de l'oxygène (ROS), ainsi que l'induction subséquente d'une cascade de protéine kinases mitogène-activées (MAPK) spécifique qui inclut à la fois la protéine kinase stress-activée (SAPK)/ERK kinase 1(SEK1) ainsi que l'activation de la kinase c-jun N-terminal (JNK). Néanmoins, le lien entre la production de ROS et l'activation de SEK1 reste à être élucidé. La kinase de signalisation de l'apoptose (ASK1) est une MAP3K en amont de SEK1 qui a été impliquée dans l'induction de la signalisation induite par le stress. En utilisant des fibroblastes d'embryions de souris (MEFs) dérivées de souris ASK-/-, nous montrons qu'ASK1 est un médiateur fort de l'apoptose et de l'activation de JNK par ATO. Dans une lignée cellulaire APL, nous montrons qu'ATO active ASK1 en fonction du temps et de la dose. Par contre, une sous-régulation d'ASK1 dans des cellules APL augmente la susceptibilité envers ATO, ce qui se traduit par une diminution de la croissance et une augmentation de l'apoptose par rapport aux cellules APL sauvages. Un impact similaire est observé lors d'une sous régulation de SEK1, une MAP2K directement en aval d'ASK1, ainsi que lors d'une sous régulation d'ASK1 dans des cellules MCF-7, des cellules de cancer du sein humain. Cela nous a conduit à postuler qu'ASK1 a une fonction pro-apoptotique dans les fibroblastes non-transformés, mais anti-apoptotique dans des cellules malignes. En effet, la transformation des cellules MEFs ASK-/- a restauré leur sensibilité envers l'arrêt de la croissance et l'apoptose induits par ATO, ce qui souligne les différences entre les cellules normales et les cellules transformées. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent qu'ASK1 a un rôle important dans la sensibilité à l'ATO qui dépend du contexte. Un des schémas de régulation d'ASK1 suggère qu'ASK1 est séquestré sous une forme inactive par la thioredoxine-1 réduite (Trx1). Durant le stress oxydatif, Trx1 est oxydée et libère ASK1 afin qu'il puisse être activé. L'immuno-précipitation d'ASK1 suivie d'un immuno-marquage for Trx1 dans des cellules APL montre une association basale forte qui est perdue lors du traitement avec ATO. De plus, l'activité de la réductase de la thioredoxine (TrxR1), une enzyme qui convertit Trx1 oxydée en Trx1 réduite, est diminuée de façon significative après traitement avec ATO. Cela suggère qu'ATO active la signalisation d'ASK1 en oxydant Trx1, via les ROS, ainsi qu'en inhibant la réduction de Trx1 en diminuant l'activité de TrxR1. De plus, nous montrons que l'inhibiteur de TrxR1, Auranofin, sensibilise les cellules APL à l'apoptose induite par ATO. Cela suggère que la régulation d'ASK1 dépend du statut redox de Trx1. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent que le fait de cibler Trx1 pourrait augmenter la signalisation d'ASK1 et l'apoptose induite par ATO au sein d'une nouvelle thérapie combinée.

No description available.