The theoretical part summarizes information on the isolation and purification of plasmid DNA and nucleic acids as. Plasmid DNA is often used in gene engineering as a vector for the transfer of a particular gene. Its insulation and transportation in sufficient quality is crucial for other processes associated with it. Isolation and survival of pDNA using magnetic carriers of different concentrations of PEG 8000 in combination with 1M NaCl was investigated in experimental parts. Furthermore, the isolation of pDNA using commercial kits was examined.

This diploma thesis deals with the study of possible interactions between hyaluronan (HA) and plasmid DNA (pDNA). Plasmid DNA was isolated from E. coli JM109 (pUC19) and resuspended in TE buffer as well as high molecular weight hyaluronan. Individual samples of pDNA, HA and pDNA-HA were characterized by gel electrophoresis, CD spectroscopy and high resolution ultrasonic spectroscopy. Agarose gel electrophoresis examined the effect of the addition of hyaluronan to plasmid DNA on the migration of samples to the positive electrode. Structural changes in pDNA-HA samples were examined using CD spectroscopy. Individual CD spectra describes the dependence of the difference in absorption coefficients for left-hand and right-handed elliptic polarized light at wavelength. High resolution ultrasonic spectroscopy has been used to study interactions. It is an analytical method based on ultrasonic velocity and attenuation. We classify this technique as a non-destructive method because the passing waves do not affect the structure of the analyzed sample.

Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.

Ces dernières années un nouveau type de décharges hors équilibre thermodynamique, aptes à générer des micro jets de plasma se propageant en atmosphère libre, a suscité beaucoup d’intérêt dans la communauté scientifique. Ces micro jets, produits dans des structures type décharge à barrière diélectrique, ont des propriétés particulièrement intéressantes, tant sur le plan de la physique des plasmas que sur celui des applications, en particulier pour des applications biomédicales ou de traitement de surface.Dans ce travail de thèse il est démontré que ces jets de plasma correspondent à la propagation à grande vitesse d'un front d'ionisation sans déplacement de matière. Une caractérisation des propriétés des jets (vitesse et distance de propagation) a été effectuée en fonction de la tension appliquée, du débit, de la composition du gaz, et de la géométrie de la décharge. La distribution spatio-temporelle des espèces réactives produites par le jet a été mesurée, et en particulier celle de l'état métastable He (2³S) mesuré par absorption laser. Des densités comprises entre 1.10¹² et 5.10¹³ cm-³ ont été obtenues pour l’état He (2³S). Sa distribution est annulaire à la sortie de la structure de la décharge et se referme le long du jet. La densité maximale est obtenue à une distance correspondant à la moitié de la zone où les atomes métastables sont présents, ce qui est en contradiction avec les modèles actuels. De plus, afin de mieux comprendre la physique des jets de plasma, nous avons fait interagir deux jets placés l’un en face de l’autre. L'étude de la contre propagation de deux jets révèle qu’il existe une distance minimale d'approche laissant entre eux une zone exempte de plasma. Après l’extinction des deux plasmas, une seconde décharge s’amorce exactement dans cette zone. Une étude détaillée couplant diagnostics électrique, imagerie ultra-rapide et spectroscopie d'émission nous a permis de montrer que cette décharge secondaire est due à une inversion de polarité conduisant à la création transitoire d'un piège à électrons.Dans le but d'aborder l'étude des applications des jets de plasma au domaine biologique, nous avons également étudié la dégradation de l’ADN plasmidique par un jet de plasma. Nous avons mis en évidence que ce type de plasma induit majoritairement des cassures simples et doubles brins, alors que très peu d’oxydations de base ou de sites abasiques sont observés, ceci même avec l’ajout de quelques pourcents d’oxygène dans le gaz. / Micro plasma jets operating at atmospheric pressure in free atmosphere have recently attracted great attention because of their numerous advantages. In fact, micro plasma jets can be operated stably at atmospheric pressure and propagated over some centimeters in a free atmosphere. Moreover, these jets are non-thermal plasmas and create numerous reactive species. These properties allow to use this kind of plasma in many applications, such as surface treatment, decontamination, and plasma medicine.In this work it is shown that these micro plasma jets correspond to the fast propagation of an ionization front with no displacement of matter. A characterization of the plasma proprieties (e.g. distance and velocity of propagation) has been done as a function of the applied voltage, gas flow, gas composition and discharge geometry. The spatiotemporal distribution of the reactive species created by the plasma has been measured, with a special focus on the helium metastable atoms which have been measured by absorption laser spectroscopy. The helium metastable atom densities obtained are in the range of 1.10¹² to 5.10¹³ cm-³. Thanks to a very good spatiotemporal resolution, we have done a time-resolved full cartography of the plasma. This allowed us to show that the helium metastable atom distribution is annular near the nozzle and becomes circular as the plasma propagates. The maximum helium metastable atoms density has been measured at about half of the distance where the helium metastable atoms are present. This observation is in contradiction with results reported by numerical models. To gain further insight into the physical processes of the plasma, we have placed two micro plasma jets face to face. This study showed that both plasmas interact in such a way that they never come into contact, letting a space free of plasma between them. Moreover, we revealed that after the extinction of the plasmas, a second discharge is ignited in the previously free space. Fast imaging, spectroscopy diagnostics and electrical measurements showed that this second discharge is due to a polarity reversal, which creates an electron trap. Aiming the study of the application of micro plasma jets in the plasma medicine field, we have studied the degradation of plasmid DNA by our plasma jet. We observed that the plasma treatment leads mostly to single and double strands breaks, and to very little base oxidation and abasite site, even when oxygen is added into the gas mixture.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GiuseppeAP.pdf: 289778 bytes, checksum: 0019c3f931b948d4ac6b9aa32d20ec37 (MD5) Previous issue date: 2007-08-16 / &#65279;The use of radionuclides has contributed for advances in Health Sciences, to research or to the diagnosis and/or treatment of diseases. These advances have been possible with the utilization of radiopharmaceuticals labeled with technetium-99m (99mTc). Stannous chloride (SnCl2) has the main reducing agent utilized to obtain radiopharmaceuticals labeled with technetium-99m. It has been reported that several natural or synthetic drugs are capable to alter the labeling of blood constituents with 99mTc, as well as the red blood cells morphology. The aim of this study was to evaluate possible alterations of Chrysobalanus icaco extract on the labeling of blood constituents with 99mTc, on the morphology of RBC of blood of Wistar rats, on the breakage of plasmid DNA and on the effects of stannous chloride on plasmid DNA. The results showed significant (P<0.05) alteration of the labeling of blood constituents with 99mTc, as well as, modification of the morphology and morphometry (perimeter/area ratio) of the RBC in presence of the extract. These data suggest that this abajeru extract could alter the labeling of blood constituents with 99mTc by its chelating/antioxidant action and/or effects on membrane structures. Moreover C. icaco extract altered the electrophoretic profile and decreased significantly (p<0.05) the effect of SnCl2 on plasmid DNA. The results obtained in this work could indicate a dose-dependent protective action against the SnCl2 and a genotoxic effect of C. icaco extract on plasmid DNA / &#65279;O uso de radionucl?deos tem contribu?do para avan?os relevantes em Ci?ncias da Sa?de, seja para pesquisa ou seja para o diagn?stico e/ou tratamento de doen?as. Muitos desses avan?os t?m sido poss?veis com a utiliza??o de radiof?rmacos marcados com tecn?cio-99m (99mTc). A marca??o desses radiof?rmacos necessita de um agente redutor e o cloreto estanoso tem sido o mais empregado. Tem sido descrito que diversas drogas naturais ou sint?ticas s?o capazes de interferir na marca??o de constituintes sangu?neos com 99mTc, assim como na morfologia das hem?cias. O objetivo deste estudo foi avaliar poss?veis interfer?ncias de um extrato de Chrysobalanus icaco (C. icaco) na marca??o dos constituintes sangu?neos com 99mTc, na morfologia de hem?cias do sangue de ratos Wistar, na quebra de DNA de plasm?dios e na a??o do cloreto estanoso no DNA plasmidial. Os resultados indicam que o extrato de C. icaco altera a marca??o de constituintes sangu?neos significativamente (p<0,05) com 99mTc, a morfologia e a morfometria (rela??o per?metro/?rea) das hem?cias, talvez por a??o quelante ou antioxidante e/ou por efeitos em estruturas da membrana envolvidas no transporte de ?ons. Al?m disso C. icaco altera o perfil eletrofor?tico e diminui significativamente (p<0.05) os efeitos do cloreto estanoso no DNA plasmidial. Estes ?ltimos resultados sugerem uma a??o protetora dose-dependente contra a a??o do cloreto estanoso e um efeito genot?xico do extrato de C. icaco no DNA plasmidial. O estudo tem car?ter multidisciplinar com a participa??o das seguintes ?reas do conhecimento: Radiobiologia, Bot?nica, Gen?tica, Fitoterapia e Hematologia

Cette thèse vise à étudier les nanoparticules d'or (NPOs) comme radio sensibilisateur et nano catalyseur afin d'améliorer la production d'espèces réactives de l'oxygène (EROS) et à fournir un aperçu de l'effet protecteur potentiel des acides aminés de base contre les effets des rayonnements ionisants afin d'étudier le mécanisme de dommages de l'ADN. En outre, il vise à améliorer notre connaissance des effets directs et indirects sur l'ADN plasmatique qui est une cible importante et sensible lors de l'étude des effets des rayonnements ionisants. Cette étude nécessite à la fois Ia bonne distribution et le contrôle de l'ADN déposé sur graphite HOPG. Nous avons procédé à la préparation de films (couches nanométriques à l’échelle) faite d'un complexe d'ADN avec des amines, ainsi que les acides aminés basiques. Nous avons caractérisé le déposé sec par microscopie a force atomique et par XPS. Nous avons montré que les couches contenant des acides aminés basiques sont très denses et que la protection contre les dommages de l'ADN après re-dissolution dans l'eau est très efficace. Ensuite, nous avons déposé l'ADN plasmatique à sec soul sur des feuilles minces de mylar et d'exposé ces films à un faisceau de protons à différentes énergies, Nous avons montré que, dans le value de pic de Bragg d'énergie a protons énergies inferieure a 500 keV il y a un rendement Cleve de protons a endommagé l'ADN. L'effet indirect a donc été étudié en exposant l'ADN plasmatique en solution aqueuse par rayons X ultra-mous. Nous avons procédé a de telles expériences en utilisant 100 lit de solution d'ADN plasmatique avec et sans différentes concentrations de 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol, (Tris) et l'arginine (Arg) à température ambiante et sous agitation. Une très bonne procédure expérimentale. Nous avons montré que les rendements pour les pauses ADN simples brins ont permis au ratio indirect des effets directs à déterminer à 96% en bon accord avec la valeur de 97% découlant d’une étude basée sur l’irradiation aux rayons gamma de solutions congelées de l’ADN plasmatique. Nous analysons nos résultats et nous suggérons que les produits secondaires de Arginine réagissent avec les radicaux OH pour produire des effets secondaires; notamment en raison du fait que, contrairement au Tris, Arg est capable de liaison à l'ADN à l'extérieur et également à l'intérieur de la double hélice. Nous avons exposé également l'ADN de plasmide en solution aqueuse et complexe aux deux autres acides aminés basiques (lysine et histidine) par rayons X ultra-mous. Nous avons constaté que la présence de ces acides aminés augmente également la détérioration de l'ADN et suggère que les acides aminés sont donc également susceptibles de produire des effets secondaires. Enfin, nous avons étudié Ie rôle de nanoparticules d'or (NPO) dans le renforcement de la sensibilisation de la radio de l'ADN. En utilisant de nouveaux protocoles expérimentaux, nous avons fini à interpréter l'interaction du (NPOs) avec ionisation rayonnement dans des solutions aqueuses oxygénées. Pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes de sensibilisation de radio par NPOs, nous avons utilisé une variété de espèces détritivores, spécifiques et réactives d'oxygène et l'ADN plasmatique comme sonde afin de favoriser les voies donnees et de determiner laquelle d'entre elles est la plus efficace dans l'ADN dommageable. Cette étude a démontré pour la première fois que les NPOs contribuent en permanence à l'amélioration de la production de OH en utilisant un stock potentiel maintenu sous la forme d'HO2 • / 02 • - et H202 produits de radiolyse de l'eau primaire. Nous avons montre en effet que H202 peut réagir avec NPOs pour produire • OH radicaux. / This thesis aims at studying the gold nanoparticles (GNPs) as radiosensitizer and nanocatalyst in order to enhance the generation of reactive oxygen species (ROSs) and at providing insight into the potential protective effect of basic amino acids against ionizing radiation effects in order to study the mechanism of DNA damage. Also, it aims at improving our knowledge of direct and indirect effect on plasmid DNA which is an important and sensible target when studying ionizing radiation effects. This study required both the good distribution and control of the DNA deposited on HOPG (Highly Ordered Pyrolytic Graphite). We carried out the preparation of films (nanometer scaled layers) made of complex of DNA with diamines as wel as basic amino acids. We have characterized dry deposited by AFM (Atomic Force Microscopy) and by XPS (X-ray photoelectron spectroscopy). We have shown that the layers containing basic amino acids are very dense and that the protection against DNA damage after re-dissolution in water is very effective. Then, we have deposited dry plasmid DNA alone on thin mylar foils and exposed those films to a proton beam at various energies. We have shown that in the Bragg-peak energy range i.e. at proton energies lower than 500 keV there is a high efficiency of protons to damage DNA. The indirec effect was thus studied by exposing plasmid DNA in aqueous solution by (USX). We carried out such experiments by using 100 pit of plasmid DNA solution with and without different concentrations of 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris) and arginine (Arg) at ambient temperature and under stirring. A very good agreement was found with the rare data dealing with DNA plasmid exposed to Al Ka photons at low temperature (T < 277 K), which therefore validated the experimental procedure. We showed that the yields for DNA single strand breaks determined enabled the ratio of indirect to direct effects to be determined at 96.2%; in good agreement with the value of 97.7% stemming from a study based on y-ray irradiation of frozen solutions of plasmid DNA. We analyze our results and suggest that secondary products of Arginine react with OH radicals to produce side effects; notably due to the fact that contrary to Tris, Arg is capable of binding DNA outside but also inside the double-helix. We exposed also the plasmid DNA in aqueous solution and complexed to the two other basic amino acids (histidine and lysine) by USX. We found that the presence of tilos amino acids also increases DNA damage and suggest that those amino acids are therefore also prone to produce side effects. Lastly, we studied the role of Gold Nano Particles (GNPs) in enhancing DNA radio sensitization. By using new experimental protocols, we achieved to interpret the interaction of GNPs with ionization radiation in oxygenated aqueous solutions. To get better insight into the mechanisms of radiosensitization by GNPs, we used a variety of specific reactive oxygen species scavengers and plasmid DNA as a probe in order to favor given pathways and to determine which of them is the most effective in damaging DNA. This study has demonstrated for the first time that the GNPs contribute permanently to the enhancement of ■OH production by using a potential stock kept under the form of 1102•/02•- and H202 primary water radiolysis products. We showed indeed that H202 ca react with GNPs to produce •0H radicals.