This thesis reports on our initial work constructing a human lung query atlas which provides clinically relevant population statistics for normal and abnormal individuals. The atlas incorporates front-end interfaces with back-end database. The interfaces were developed using Microsoft Access 2007 and the database was implemented using MySQL. ODBC was used to import database into Access and provide connection for database and interfaces. VBA is used to write SQL queries and realized the interaction with interfaces. SQL queries is written to extract the data which researchers may interest in. The atlas provides measurements of the human airway tree and lung volumes from a population of individuals and also provides a population statistics based on age, race, ethnicity, gender and other information. It also provides functionality for comparing airway measurements between populations, individuals to a population, and individuals to individuals. Statistical significance, such as p-value, is provided to analyze two individuals or populations.

Image registration is a useful technique to measure the change between two or more images. Lung CT image registration is widely used an non-invasive method to measure the lung function changes. Non-invasive lung function measurement accuracy highly depends on lung CT image registration accuracy. Improving the registration accuracy is an important issue. In this thesis, we propose incorporating information of the anatomical structure of the lung (fissures) as an additional cost function of the lung CT image registration. The intensity-based similarity measurement method (sum of the squared tissue volume differences) is also used to complement lung tissue information matching. However, since fissures are hard to segment, a sheet-likeness filter is applied to detect fissure-like structures. Sheet-likeness is used as an additional cost function of the intensity-based registration. The registration accuracy is verified by the visual assessment and landmark error measurement. The landmark error measurement can show an improvement of the proposed algorithm.

In this thesis the effect of mechanical stimuli on A549 lung cancer cells is studied. Modifications of polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces are employed to alter the mechanical stimuli applied to the cells. Flat substrates are first studied and then micropillared substrates are designed, fabricated, and tested as a method to alter the mechanical properties of the PDMS surfaces. Molds with micro-pillars are designed then fabricated from silicon using deep reactive ion etching. From these molds, a negative then a positive replicate is made using PDMS. The pillared PDMS substrates are fabricated in 10 geometries and used for experiments. A549 cells are cultured on these surfaces then analyzed using fluorescence microscopy and atomic force microscopy (AFM). Fluorescence microscopy images processed by ImageJ software measure the cell spreading area (m2) while AFM quantifies the cell stiffness (kPa). For flat substrates, the cell stiffness and spreading area increase with increasing substrate stiffness. Further, results on pillared substrates show a similar trend based on pillar geometry changes. For pillared substrates, the A549 cell stiffness and spreading area increase as the height decreases, yet there is decreased cell stiffness and spreading area as the diameter and spacing decreases. The experiments show that changes in surface properties and only mechanical stimuli alter cellular morphology and biomechanics

An animal model of respiratory infection was used to determine the effect of various factors, thought to influence the ability of the host to clear bacteria, on the host?s innate response to an NTHi lung infection. Mucosal immunisation with NTHi has previously been shown to enhance the clearance of NTHi from the lung in an animal model of infection through the increased recruitment of phagocytes. Comparisons of cytokine and chemokine kinetic profiles were made in order to determine differences between innate and acquired immune response and the way in which mucosal immunisation controls the innate immune response to NTHi. Increased production of proinflammatory cytokines and chemokines in the early stages of NTHi lung infection enhanced the ability to clear bacteria from the rat lung in the immune animals through the increased recruitment of phagocytes to the site. Mucosal immunisation was found to alter the cytokine and chemokine mRNA profiles of CD4+ and CD8+ cells, with increased levels of MCP-1 protein being detected in both types of immune cells. An antecedent viral infection has been shown to increase the chance of developing a respiratory bacterial infection. The NTHi model of respiratory infection was used to characterise the effect that a viral infection had on the host response to the host?s innate response to a bacterial infection and the ability to clear the bacteria. The host?s ability to clear NTHi from the rat lung was enhanced by an antecedent viral infection through alterations to the innate immune response and the cytokine and chemokine kinetic profiles. The use of a mutant strain of NTHi deficient in a component of Lipooligosaccharide (LOS), Phosphorylcholine (ChoP), was utilised as a tool to characterise the innate immune response to LOS. Animals challenged with the LOS mutant strain had a reduced inflammatory response to NTHi through the decreased production of pro-inflammatory cytokines and chemokines and the reduced recruitment of phagocytes to the site of infection. This thesis has contributed valuable information to enable a better understanding of the host?s innate immune response to respiratory infection. This study has identified the role of cytokines and chemokines in the innate response to a respiratory bacterial infection and the enhanced ability of the host to clear NTHi from the lung.

The convective-diffusive transport of sub-micron aerosols in an oscillatory laminar flow within a 2-D single bifurcation is studied, using order-of-magnitude analysis and numerical simulation using a commercial software (FEMLAB®). Based on the similarity between momentum and mass transfer equations, various transient mass transport regimes are classified and scaled according to Strouhal and beta numbers. Results show that the mass transfer rate is highest at the carinal ridge and there is a phase-shift in diffusive transport time if the beta number is greater than one. It is also shown that diffusive mass transfer becomes independent of the oscillating outer flow if the Strouhal number is greater than one. / Singapore-MIT Alliance (SMA)

Le cancer du poumon est un problème majeur de santé publique et dont le coût humain et social est sans cesse en augmentation au cours des dernières années. Parmi les nombreux médiateurs susceptibles de jouer un rôle dans la croissance tumorale, nous avons étudié en détails le système des ADAM et ADAMTS protéases. Les ADAMs sont des enzymes aux fonctionnalités multiples qui interviennent dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Parmi ces différents processus, certains concernent des modulations de la structure ou de létat de la matrice extracellulaire et dautres des boucles dinteractions entre différents types cellulaires reliés par des médiateurs protéiques. Les modulations apportées à ce système par les ADAM protéases résident donc dans lactivation ou linhibition de certains processus biologiques par clivage de molécules ou activation des récepteurs. Au cours de la première partie de notre travail, nous avons étudié lexpression de différentes ADAM(TS) protéases sélectionnées sur base de la littérature comme potentiellement impliquées dans la régulation de la croissance tumorale. L'analyse d'échantillons de cancers pulmonaires humains a été réalisée en collaboration avec le Professeur P BIREMBAUT (Unité INSERM U 514, Reims). Nous avons mis en évidence que lADAM-12 (forme complète membranaire) est surexprimée et que lADAMTS-1 est moins exprimée dans les tissus tumoraux pulmonaires obtenus par résection chirurgicale par rapport à des échantillons correspondants prélevés en zone saine. Ces variations ont été vérifiées par Real-Time PCR et par western blots. Les niveaux dexpression de lADAM-12 sont corrélés à lexpression des mRNAs codant pour les isoformes 121 et 165 (qui sont pro-angiogènes) du VEGF-A. Une immunohistochimie marquant l'ADAM-12 a montré une expression de cette protéase principalement dans les cellules tumorales ; l'ADAMTS-1 par contre, est surtout exprimée dans le tissu bronchique sain. Les lignées de cellules pulmonaires issues de cellules épithéliales bronchiques et alvéolaires ont été caractérisées pour leur expression en ADAM-12 et ADAMTS-1. LADAM-12 et lADAMTS-1 sont surexprimées par les cellules de type BZR et BZR T33 qui forment des tumeurs chez les souris et qui ont un caractère agressif. Au cours de ces travaux, nous avons donc clairement pu identifier deux protéases dont l'expression est modulée dans nos échantillons de tissu pulmonaire sain ou tumoral. L'ADAM-12, surexprimée dans les tumeurs, serait un modulateur "positif" de la progression tumorale et l'ADAMTS-1, dont lexpression est moindre dans les tumeurs semble être un modulateur négatif du développement tumoral (Rocks et al, Br J Cancer, 2006). Nous avons focalisé la suite de nos travaux sur létude des effets de lADAM-12 et de lADAMTS-1 sur différents phénomènes biologiques impliqués dans la progression tumorale. Sur base de l'analyse des échantillons de cancers pulmonaires, l'ADAM-12 est donc apparue comme un candidat potentiel impliqué dans la progression tumorale. Nous avons ainsi généré des clones surexprimant lADAM-12 à partir de cellules épithéliales bronchiques immortalisées (BEAS-2B). Ces clones ont été caractérisés et leur production dADAM-12 a été démontrée par RT-PCR et cytométrie de flux. Le comportement des cellules surexprimant lADAM-12 a ainsi pu être comparé à celui des cellules parentales transfectées avec le vecteur vide (contenant uniquement le gène de la résistance à la néomycine). Différentes expériences in vitro ont été réalisées sur ces cellules. Il ressort de lensemble de cette caractérisation que les cellules surexprimant lADAM-12 présentent une prolifération et une capacité à former des colonies en agar mou accrues par rapport aux cellules parentales. De plus, les cellules surexprimant lADAM-12 ont une sensibilité vis-à-vis de lapoptose diminuée par rapport aux clones contrôles. Ces processus sont dépendants dune augmentation de la production dHB-EGF mature par les clones surexprimant lADAM-12. Les clones surexprimant lADAM-12 ainsi que les clones contrôle ont été implantés au sein du tissu pulmonaire de souris et injectés dans le tissu sous-cutané. Il ressort de ces expériences que les cellules de type BEAS-2B transfectées ou non par lADAM-12 sont peu tumorigènes qu'elles soient implantées dans un site orthotopique (intra-pulmonaire) ou hétérotopique (sous-cutané) dans les souris SCID. En dépit du fait que l'ADAM-12 stimule la prolifération cellulaire et protège les cellules de lapoptose in vitro, sa surexpression nest pas suffisante en soi pour développer un phénotype tumorigène in vivo (Rocks et al, Cell Prolif, in press). Dans la troisième partie de notre travail, nous avons généré à partir de la lignée dérivée de cellules épithéliales bronchiques tumorales BZR des clones transfectés de façon stable qui surexpriment lADAMTS-1 humaine complète. Ceci est confirmé par la présence de bandes de 87 kDa en Western Blot, représentant la forme complète et active de cette protéase. In vitro, nous navons pas pu mettre en évidence de différence de prolifération, de migration, dinvasion et dapoptose entre les différents clones étudiés. Nous avons ensuite procédé à limplantation au niveau sous cutané dans des souris immunodéficientes de populations cellulaires transfectées de façon stable avec le gène de lADAMTS-1. Nous avons ainsi évalué si la surexpression de cette protéase modifiait le comportement de ces cellules en termes de prolifération in vivo. Les tumeurs formées à partir de cellules transfectées avec la forme complète de lADAMTS-1 présentent une taille plus importante que les tumeurs formées à partir de cellules BZR contrôle. Un immunomarquage pour le Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) a révélé des scores de prolifération cellulaire plus élevé dans les tumeurs dérivées de populations cellulaires surexprimant lADAMTS-1. De plus, lanalyse histochimique des tumeurs a montré, dans les tumeurs surexprimant lADAMTS-1, la présence de structures stromales composées de fibronectine (WB), collagène (marquées positivement par coloration au safran, WB) et de myofibroblastes (positifs pour lα-actine des muscles lisses). Afin détudier le potentiel chimiotactique de lADAMTS-1 sur les fibroblastes, nous avons utilisé le modèle des chambres de Boyden. Les chambres du dessous ont été remplies avec des milieux conditionnés dérivés de populations de cellules transfectées ou non avec la forme complète de lADAMTS-1. Les milieux conditionnés de cellules surexprimant lADAMTS-1 ont des capacités dattraction plus importantes sur les fibroblastes que les milieux conditionnés dérivés de cellules contrôles. Cependant, lajout dADAMTS-1 recombinante au milieu conditionné par des cellules contrôles nest pas suffisant pour augmenter la migration des fibroblastes. Nous avons donc mesuré lexpression de facteurs potentiellement impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire et dans la migration de fibroblastes. Les tumeurs surexprimant lADAMTS-1 ont des taux plus élevés de MMP-13, TGF-β1 et dIL-1β. De plus, un anticorps bloquant les effets du TGF-β1 et/ou de lIL-1β diminue la migration des fibroblastes en chambre de Boyden. En résumé, nous montrons par ce travail, que les cellules BZR transfectées au moyen de la forme complète de lADAMTS-1, forment des tumeurs plus larges, infiltrées par des myofibroblastes, suggérant que les interactions tumeur-stroma influencent la prolifération de cellules tumorales En conclusion, nos travaux ont identifié que lexpression de lADAM-12 et lADAMTS-1 est modulée dans des tumeurs bronchiques humaines. LADAM-12 joue un rôle dans la prolifération cellulaire en activant le clivage de facteurs de croissance membranaires qui sont des ligands de lEGFR. Le rôle de lADAMTS-1 apparaît comme beaucoup plus complexe et nos travaux montrent que lADAMTS-1 peut influencer la croissance tumorale in vivo en modulant la composition cellulaire et matricielle du stroma. Collectivement, ces travaux confirment le rôle clé joué par les protéases de la famille des ADAMs et ADAMTS dans le développement du cancer et identifient ces enzymes comme des cibles thérapeutiques potentielles.

Au travers d’études cliniques et biologiques, de méta-analyses et de revues systématiques de la littérature, nous avons étudié les CBNPC de stade III sur le plan thérapeutique et cherché des facteurs pronostiques pour la survie dans le but d’améliorer la classification internationale et, à terme, de permettre une meilleure prise en charge des patients inclus dans ce groupe hétérogène de tumeurs. Dans le cadre d’essais randomisés, nous avons montré qu’un abord multimodal et multidisciplinaire permettait d’améliorer le pronostic des patients atteints d’un CBNPC de stade III. Le traitement des tumeurs non résécables implique une combinaison de chimiothérapie et de radiothérapie, dont l’administration concomitante doit être proposée aux patients aptes à la tolérer. La chimiothérapie doit être incluse dans le schéma thérapeutique des tumeurs potentiellement résécables. Elle permet une résection chirurgicale complète chez des patients sélectionnés dont la tumeur était initialement non résécable. Nous avons déterminé que des caractéristiques cliniques (l’indice de performance et l’âge), biologiques (les taux sanguins de polynucléaires neutrophiles, d’hémoglobine et de plaquettes, la bilirubinémie) et propres à la tumeur (l’extension locale [T3-4] et ganglionnaire [N3]) avaient une valeur pronostique indépendante pour la survie. Ceci nous a permis d’aboutir à une proposition de modification de la classification internationale concernant les CBNPC de stade III. Bien que pris individuellement, les facteurs biologiques que nous avons étudiés (p53, EGF-R, TTF-1, Mdm2) n’aient pas de valeur pronostique pour la survie, nous avons montré que la combinaison EGF-R+/TTF1- était un facteur pronostique indépendant en analyse multivariée pour la survie spécifique au cancer bronchique. Nous avons finalement évalué le rôle pronostique de la tomodensitométrie par émission de positrons et de la mesure semi-quantitative de captation du 18F-FDG (SUV) sur la survie des patients atteints de CBNPC et montré qu’un SUV élevé était un facteur de mauvais pronostic pour la survie.

Le travail présenté ici porte sur l’étude de la production et du transport du monoxyde d’azote (NO) dans le poumon humain. Le NO est une molécule dont l’implication dans des processus physiologiques n’a été mis en évidence qu’en 1987. Depuis, il a été démontré que le NO joue de nombreux rôles dans le corps humain. Le NO est un gaz labile (instable) dans les conditions physiologiques, il diffuse très facilement au travers des parois et il a une grande affinité pour l’hémoglobine. La production du NO est liée à 3 isoformes différentes de la protéine appelées synthases du NO ou NO synthases. En 1991, Gustafsson et al. ont découvert du NO endogène (produit par les poumons) dans l’air exhalé chez l’homme et le cochon d’Inde. Depuis près de 15 ans, de plus en plus de groupes de recherche travaillent sur le NO pulmonaire sans s’accorder sur ses rôles exactes. Il est cependant établit que, dans les pathologies comme l’asthme, la production accrue de NO est liée aux processus inflammatoires. Le NO peut être produit par la surface épithéliale (au niveau des conduits pulmonaires) ou alvéolaire, mais les sites exactes de production sont encore débattus. De part l’impossibilité de mesures directes au-delà des premières générations de l’arbre bronchique, les modèles mathématiques sont indispensables pour interpréter les résultats de mesures de concentrations exhalées et étudier la production et le transport du NO dans le poumon. Récemment, un modèle a été proposé par notre groupe, tenant compte de la convection, de la diffusion moléculaire et de la production du NO dans le poumon. Le but de ce travail est d’utiliser et d’adapter ce modèle pour reproduire des résultats expérimentaux soit existants, soit originaux. Dans ce travail, nous montrons que l’augmentation de concentration alvéolaire chez des sujets asthmatiques bien contrôlés est liée à une augmentation de production dans les conduits et non dans les alvéoles. Nous montrons également que, sur base de résultats expérimentaux, la production bronchique dans le poumon des sujets sains doit être très hétérogène pour reproduire des résultats expérimentaux apparemment irréconciliables. Nous montrons enfin que la localisation des conduits pulmonaires subissant une constriction influence la chute de NO exhalé mesurée après cette constriction. Nous avons également participé à 2 expériences liées à la gravité qui constitueront le matériel susceptible de faire évoluer le modèle.

Glu-Leu-Arg (ELR)-CXC chemokine-mediated neutrophil migration and activation plays a key role in many inflammatory diseases. Dysregulated neutrophil activation often leads to inflammatory responses such as acute lung injury (ALI) or acute respiratory distress syndrome (ARDS).<p> Previously, we generated a bovine drug (i.e., bovine CXCL8(3-74)K11R/G31P, bG31P) by mutating the first two amino acids at the beginning of the N-terminus of bovine CXCL8/IL-8 and later substituting Arg for Lys11 and Pro for Gly31. Bovine G31P was shown to be a highly effective ELR-CXC chemokine and neutrophil antagonist in cattle & guinea pigs, but a human equivalent thereof would be of significantly more use in human medicine. Published studies on the structure and function of human CXCL8 suggest that human CXCL8(3-72)K11R/G31P (i.e., hG31P) would not be a particularly effective chemokine antagonist. Thus, development of a humanized form of bG31P became a primary goal. I first examined the effect of wholesale ligation of the carboxy half of hCXCL8 onto the amino half of bG31P and generated a human-bovine chimeric G31P (hbG31P; i.e., bCXCL8(3-44)K11R/G31P-hCXCL8(45-72)). I also made substitutions at each remaining human-discrepant amino acid (i.e., T3K, H13Y, T15K, E35A, and S37T) within the 5 half of the hbG31P cDNA. The results showed that hbG31P and its analogues blocked CXCL8-induced human neutrophil chemotactic responses, reactive oxygen intermediate (ROI) release, and intracellular calcium flux. Humanized bovine G31P was also shown to significantly block pulmonary neutrophilic pathology in a guinea pig model of airway endotoxemia.<p> As bG31P, hbG31P and its further humanized forms showed essentially equivalent ELR-CXC chemokine antagonist activity, Dr. Fang Li, Ms Jennifer Town and I then generated a fully human form of bG31P, hG31P. <i>In vitro</i>, hG31P was shown to effectively inhibit CXCL-1-, -5-, and -8-induced neutrophil chemotactic responses, intracellular Ca2+ flux, and ROI release. Human G31P also desensitized heterologous G protein-coupled receptors (GPCR) including bacterial peptides (e.g., N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine, fMLP), anaphylatoxin (e.g., complement 5a, C5a), lipid mediators (e.g., leukotriene B4, LTB4; platelet-activating factor, PAF) receptors. Moreover, hG31P, in a dose-dependent manner suppressed CXCL1 and CXCL8 expression by LPS-challenged airway epithelial cells and reversed the anti-apoptotic influence of ELR-CXC chemokines on neutrophils. <i>In vivo</i>, hG31P was significantly effective in blocking the pathology associated with airway endotoxemia, aspiration pneumonia, and intestinal ischemia and reperfusion injury, including neutrophil recruitment (70-95% reduction) into, and activation within, the airways or gut, chemokine or cytokine expression, and pulmonary vascular complications. The blockade of neutrophil recruitment by hG31P in aspiration pneumonia animals did not increase airway bacterial growth. The G31P treatment was protective in both mesenteric (i.e., local) and remote organ injury. These findings suggest that hG31P is not only a potent neutrophil antagonist, but an effective blocker of other inflammatory responses. These comprehensive anti-inflammatory effects indicate that hG31P could potentially provide a viable therapeutic approach for inflammatory diseases such as ALI /ARDS.

Radiation therapy for lung cancer and cancers of the upper thorax is limited by side effects to normal tissue of the lung. An understanding of mechanisms leading to radiation induced lung damage is essential to developing protective agents. In this thesis an anti-oxidant and anti-inflammatory agent Genistein was investigated for its potential to affect DNA damage, tissue inflammation, functional deficits and survival. We hypothesized that chronic oxidative stress and the subsequent inflammatory response play a key role in the development of major lung complications, radiation pneumonitis and fibrosis. If side effects of radiation could be reduced, then larger doses could be delivered to the tumor with a better chance of eradicating the disease.