No description available.

Chan, King Lun Michel. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 111-121). / Abstracts in English and Chinese. / THESIS ASSESSMENT COMMITTEE --- p.i / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.ii / 摘要 --- p.iv / ABSTRACT --- p.v / LIST OF ABBREVIATIONS --- p.xi / Chapter CHAPTER 1 --- INTRODUCTION / Chapter 1.1 --- Aldehyde Dehydrogenase Superfamily / Chapter 1.1.1 --- Classification and Substrate Specificities of Aldehyde Dehydrogenases --- p.1 / Chapter 1.1.2 --- Multiple Functions of Aldehyde Dehydrogenases and their Roles in Metabolism --- p.4 / Chapter 1.1.3 --- Structural Organization of Aldehyde Dehydrogenases in view of their Catalytic Mechanism --- p.7 / Chapter 1.2 --- Antiquitin / Chapter 1.2.1 --- Discovery and Plant Antiquitins --- p.15 / Chapter 1.2.2 --- Animal Antiquitins --- p.17 / Chapter 1.2.3 --- Human Antiquitin Gene Mutations and Pyridoxine-dependent Seizures --- p.19 / Chapter 1.2.4 --- Previous Findings on Seabream Antiquitin --- p.20 / Chapter 1.3 --- Aims of Study --- p.22 / Chapter CHAPTER 2 --- MATERIALS AND METHODS / Chapter 2.1 --- Materials / Chapter 2.1.1 --- "Subcloning, Expression and Purification of Human Antiquitin" --- p.24 / Chapter 2.1.2 --- Characterization of Human Antiquitin --- p.25 / Chapter 2.1.3 --- "Crystallization of Human Antiquitin, Diffraction Data Collection and Structure Determination" --- p.26 / Chapter 2.1.4 --- Mutational Studies of Human Antiquitin --- p.26 / Chapter 2.2 --- Methods / Chapter 2.2.1 --- "Subcloning, Expression and Purification of Human Antiquitin" / Chapter 2.2.1.1 --- Subcloning of the Full-length Human Antiquitin cDNA --- p.27 / Chapter 2.2.1.2 --- Bacterial Expression of Recombinant Human Antiquitin --- p.29 / Chapter 2.2.1.3 --- Purification of Human Antiquitin --- p.30 / Chapter 2.2.2 --- Characterization of Human Antiquitin / Chapter 2.2.2.1 --- Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis --- p.31 / Chapter 2.2.2.2 --- Size-exclusion Chromatography - Multi-angle Light Scattering --- p.32 / Chapter 2.2.2.3 --- Isoelectric Focusing --- p.33 / Chapter 2.2.2.4 --- pH-rate Profile --- p.33 / Chapter 2.2.2.5 --- Stability Studies --- p.34 / Chapter 2.2.2.6 --- Substrate Specificity Study --- p.35 / Chapter 2.2.3 --- "Crystallization of Human Antiquitin, Diffraction Data Collection and Structure Determination" / Chapter 2.2.3.1 --- Crystallization of Human Antiquitin --- p.36 / Chapter 2.2.3.2 --- Diffraction Data Collection and Model Building --- p.37 / Chapter 2.2.4 --- Mutational Studies of Human Antiquitin / Chapter 2.2.4.1 --- Preparation of Mutant Plasmids --- p.39 / Chapter 2.2.4.2 --- "Expression, Purification and Kinetics Studies of Mutants" --- p.39 / Chapter CHAPTER 3 --- RESULTS / Chapter 3.1 --- "Subcloning, Expression and Purification of Human Antiquitin" --- p.43 / Chapter 3.2 --- Characterization of Human Antiquitin --- p.49 / Chapter 3.3 --- "Crystallization of Human Antiquitin, Diffraction Data Collection and Structure Determination" / Chapter 3.3.1 --- "Crystallization, Data Collection and Refinement" --- p.59 / Chapter 3.3.2 --- Human Antiquitin Structure --- p.63 / Chapter 3.4 --- Mutational Studies of Human Antiquitin --- p.75 / Chapter CHAPTER 4 --- DISCUSSION / Chapter 4.1 --- Characterization and Substrate Specificity of Recombinant Human Antiquitin --- p.83 / Chapter 4.2 --- Crystallization and Crystal Structure of Human Antiquitin / Chapter 4.2.1 --- Crystallization --- p.86 / Chapter 4.2.2 --- Overall structure --- p.86 / Chapter 4.2.3 --- Cofactor binding --- p.88 / Chapter 4.2.4 --- Substrate Binding and Catalysis --- p.91 / Chapter 4.3 --- Mutations in Human Antiquitin Gene and their Relationship with Pyridoxine-dependent Seizures --- p.95 / Chapter 4.4 --- Comparison of Antiquitin Gene and Other Aldehyde Dehydrogenases --- p.104 / Chapter CHAPTER 5 --- FUTURE PROSPECTS --- p.106 / LIST OF REFERENCES --- p.111 / APPENDIX --- p.122

Genetic algorithms are an evolutionary technique that use crossover and mutation operators to solve optimization problems using a survival of the fittest idea. They have been used successfully in a variety of different problems, including the traveling salesman problem. In the traveling salesman problem we wish to find a tour of all nodes in a weighted graph so that the total weight is minimized. The traveling salesman problem is NP-hard but has many real world applications so a good solution would be useful. Many different crossover and mutation operators have been devised for the traveling salesman problem and each give different results. We compare these results and find that operators that use heuristic information or a matrix representation of the graph give the best results.

Viruses that infect thermophilic Archaea are unique in both their structure and genetic makeup. The lemon-shaped fuselloviruses - which infect members of the order Sulfolobales, growing optimally at 80º C and pH 3 - are some of the most ubiquitous and best studied viruses of the thermoacidophilic Archaea. They provide a malleable and useful genetic tool for probing into the functions of their host, as well as the host responses to infection. Nonetheless, much about these viruses remains to be learned to further understand their morphological, genetic, and life cycle characteristics. In order to investigate these aspects of these Fuselloviridae, as well as their evolution, this work reports the isolation and characterization of a novel fusellovirus, Sulfolobus Spindle-shaped virus 10 (formerly SSV-L1). Genetic and genomic analyses highlight significant homology with both SSV8 and SSV9, as well as conservation of promoter elements within the Fuselloviridae. SSV10 encodes five ORFs with no homology within or outside of the Fuselloviridae, as well as a putatively functional Cas4-like ORF which may play a role in anti-CRISPR host evasion. Moreover, we demonstrate the ability of SSV10 to withstand mutation in a fashion consistent with mutagenesis in SSV1. Lastly, analysis of predicted protein structures from SSV10 provide new insights into virus-host interactions. These analyses help to expand our understanding of the viral life cycle while contextualizing the mutagenesis data presented in the following chapters.

Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii gehört zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine (Typ1-Rhodopsine). ChR2 besteht aus einem extrazellulär gelegenen N-Terminus, 7 Transmembranhelices und einem zytosolisch gelegenen C-Terminus. Der lichtreaktive Bestandteil (Chromophor) all-trans-Retinal ist via Schiff´ Base kovalent an ein Lysinrest der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei Applikation von Blaulicht isomerisiert all-trans- zu 13-cis-Retinal, was in einer Konformationsänderung und dem Öffnen des Kanals resultiert. Abhängig vom elektrochemischen Gradienten können ein- und zweiwertige Kationen in die Zelle ein- oder aus der Zelle herausströmen. Eine retinalabhängige Stabilität konnte bereits für Bakteriorhodopsin (BR) bestätigt werden (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), bezüglich ChR2 waren bisher nur wenige Daten verfügbar (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Die heterologe Expression von wildtypischem und modifiziertem ChR2 in Oozyten von X. laevis erlaubte einen detaillierteren Einblick in die retinalabhängige Stabilität und pH-abhängige Dunkelleitfähigkeit von Guanidinium. Wildtypisches Chop2 zeigte bei Zugabe von Retinal zum Inkubationsmedium, direkt nach RNA-Injektion, Stromamplituden im µA-Bereich und deutliche Fluoreszenzintensitäten. Ausschließlich endogen vorhandenes Retinal hatte verminderten Fluoreszenzen und Stromamplituden zur Folge, was auf ein geringes Vorhandensein von Chop2-Proteinen in der Plasmamembran hindeutete. Da die Inkubation über Nacht in retinalsupplementierter Lösung nur eine minimale Erhöhung des resultierenden Stromes erbrachte, deuten die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stark auf eine verminderte Stabilität des Proteins bei fehlender Bindung des Kofaktors Retinal. Das Einfügen einer aromatischen Aminosäure (Y/F/W) an Position 159 führte zu einer, von der Retinalsupplementation unabhängigen, in beiden Ansätzen gleichwertigen Expressionsstärke. Diese äusserte sich in äquivalenten Fluoreszenzintensitäten. Die erhaltenen Stromamplituden wiesen eine starke Differenz auf: ohne Zugabe zusätzlichen Chromophors lag die Stromstärke bei nur wenigen Nanoampere, die bei Inkubation in einer retinalhaltigen Lösung über Nacht auf das Niveau von retinalsupplementierten Oozyten anstieg. Des Weiteren konnte die Zunahme der Stromamplitude innerhalb von 15 Minuten beobachtet werden, wenn die vermessenen Oozyten mit einer retinalhaltigen Lösung perfundiert wurden. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse auf eine Stabilisierung des aromatisch substituierten Proteins hin. Bei der von Berndt et al. (2011) beschriebenen Mutante T159C konnten diese Eigenschaften nicht nachgewiesen werden. Die Modifikation der Retinalbindestelle (K257) in Verbindung mit einer aromatischen Substitution an Position 159 resultierte in deutlichen Fluoreszenzintensitäten, unabhängig von der Retinalverfügbarkeit bei, in beiden Fällen, fehlenden lichtaktivierten Strömen. Diese und die gleichwertigen Bandenstärken des Proteinimmunoblots von aromatisch substituierten ChR2-Varianten unterstützen die Hypothese der retinalunabhängigen Stabilität zusätzlich. Die Ergebnisse legen, im Falle von Chop2-WT, eine Degradation des Apoproteins nahe. Bei Einfügen einer aromatischen AS an Position 159 ist das Apoprotein davor geschützt (siehe Abb. 75). Infolge der strukturellen Similarität, dem Vorhandensein delokalisierter π-Elektronen und der räumlichen Größe der aromatischen AS ist eine strukturelle Veränderung des Apoproteins denkbar, die eine Degradation aufgrund von nunmehr unzugänglichen Ubiquitinierungsstellen verhindert. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass sich bei fehlender Bindung des Kofaktors Wassermoleküle in der Nähe der Bindetasche befinden, welche von umliegenden Aminosäuren (u.a. T159, D156) unter großem Energieaufwand koordiniert werden und die strukturelle Integrität bis hin zur Degradation beeinträchtigen können. Dies könnte durch eine Erhöhung der Hydrophobizität bei Einfügen einer aromatischen Aminosäure verhindert werden. Bei Substitutionen durch eine aromatische AS (Y/W/F) an Position 159 zeigte sich ein weiteres, bisher nicht beschriebenes, Charakteristikum. Bei Perfusion der Oozyten mit einer guanidiniumhaltigen Lösung, konnten in Abhängigkeit des pH-Wertes ohne die Applikation von Licht Stöme im µA Bereich aufgezeichnet werden. Die Größe der Stromamplitude korreliert hierbei mit dem Anstieg des pH-Wertes und der Konzentration an Guanidiniumionen der perfundierten Lösung und kann durch das Hinzufügen von 1mM Lanthan reversibel geblockt werden. Des Weiteren konnten die vorgenommenen Messungen die Ergebnisse der retinalabhängigen Degradation verifizieren, da der Einstrom von Gua+ sowohl bei retinalsupplementierter Inkubation, als auch bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal zu beobachten war. Des Weiteren zeigte auch die Doppelmutante T159Y/K257R trotz ihres Unvermögens Retinal zu binden, die beschriebenen lichtunabhängigen Ströme. Die Ergebnisse bei Substitution durch Phenylalanin (F) stellen eine Abweichung des Musters dar. Bei Inkubation von T159F-injizierten Zellen bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal konnte eine stark erhöhte Guanidiniumleitfähigkeit festgestellt werden, diese kam jedoch bei retinalsupplementierter Inkubation nicht zum Tragen. Dies könnte ein Hinweis auf eine sterische Hinderung durch das gebundene Chromophor sein, die bei den Substitutionen durch Tyrosin und Tryptophan, möglicherweise durch unterschiedliche chemische Eigenschaften der AS, nicht auftreten. Die hervorgerufene pH-Abhängigkeit kann in zwei möglichen Ursachen begründet liegen: • Vorhandensein einer (de)protonierbaren Gruppe wie Histidin, Arginin oder Lysin, die als pH-Sensor dienen könnte • Deprotonierung der Schiff´ Base durch Guandininium Das Vorhandensein eines pH-Sensors konnte durch die vorgenommenen Modifikationen von H114, R115, R120 und H249 nicht bestätigt werden. Bei Substitution von K257 (in Verbindung mit T159Y) zu Arginin (R) konnte weiterhin ein pH-abhängiger Gua+-Dunkelstrom festgestellt werden. Die Modifikation zu Alanin (A) oder Glutamin (Q) hingegen resultierte im Ausbleiben der Ströme. Der Austausch einer basischen zu einer neutralen Gruppe ohne protonierbaren Rest deutet auf die Beteiligung der Schiff´ Base bzw. der Aminosäure an Position 257 am Mechanismus der Dunkelleitfähigkeit hin. / Channelrhodopsin 2 (ChR2) from the eyespot of C. rheinhardtii belongs to the group of microbial-type rhodopsins (Type1-rhodopsins). It consists of an extracellular N-terminus, seven transmembranehelices and a cytosolic C-terminus. The light-reactive element (Chromophor) all-trans-retinal is covalently bound to a lysine of the seventh transmembrane helix via Schiff´ Base. The isomerisation from all-trans- to 13-cis-Retinal after illumination leads to a conformational change within the protein, resulting in the opening of the channel and thereby in an in- or efflux of mono- and divalent cations, depending on the electrochemical gradient. For bacteriorhodopsin (BR) a retinal dependent stability could be confirmed (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), concerning ChR2 only limited data is available (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Heterologous expression of wildtype (WT) and mutant ChR2 in the oocytes of X. laevis revealed a more detailed insight into retinal dependent stability and pH-dependent conductance of guanidinium without the application of light. ...

Graduation date: 1994

Malgré les avancées considérables de la cancérologie, de nouvelles thérapies sont toujours recherchées étant donné les effets secondaires des traitements actuels. Peu connue, la virothérapie oncolytique consiste à utiliser un virus pour détruire des cellules cancéreuses tout en épargnant les saines. Sur les mutants T1026R1 et TP3R1 du VSV de la famille des vésiculovirus portant un génome à ARN négatif de 11 kb, des efforts sont entrepris afin de prouver qu'ils sont des armes efficaces contre le cancer. Cependant, leur faible pouvoir apoptique ainsi que la persistance démontrée pour T1026R1 dans les cellules H4 les rendent moins attrayants. D'autres mutants du VSV, soit TR5R1 et TP6R1 pourraient également être de bons candidats dans la virothérapie oncolytique. Ils ne persistent pas, ils sont de meilleurs inducteurs d'apoptose et comme les mutants T1026R1 et TP3R1, ils induisent fortement la réponse des interférons. Afin de comprendre les différences quant au phénotype d'infection des mutants TP5R1 et TP6R1, le séquençage du génome entier de la souche sauvage HR ainsi que tous les mutants thermosensibles et thermorésistants a été entrepris. Les mutations responsables de la thermosensibilité vs thermorésistance pourront du même coup être révélées. Les résultats confirment les mutations M51R sur la protéine de la matrice de T1026R1 et de T1026 et V221F-S226R de TP3R1. Les mutants TP5R1 et TP6R1 portent respectivement les mutations E254Q et E254G sur le « PH domain » de leur glycoprotéine. Les mêmes mutations sont retrouvées chez TP5 et TP6 avec en plus la mutation D232G aussi sur le « PH domain ». L'analyse de la structure secondaire montre des changements par rapport au VSV Indiana HR, alors que l'analyse de la structure tridimensionnelle montre que seule la mutation D232G altère la structure. La présence de cette mutation sur les souches thermosensibles T1026, TP5, TP6 et le VSV Indiana San juan ainsi que sa conséquence sur la structure 3D laissent présager qu'elle pourrait être responsable de la thermosensibilité. La cartographie génétique des virus BR, T1026, T1026R1, TP3, TP3R1, TP5, TP5R1, TP6 et TP6R1 permettra d'approfondir la compréhension de leur phénotype d'infection particulier pour éventuellement construire un virus oncolytique recombinant conjuguant les avantages de chacun.

Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 144-157). Also available online.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 179-199.

Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 144-157). Also available in print.