Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12070_Dissertação_Fernanda Mariano Garcia.pdf: 3239009 bytes, checksum: d9dfe15fc9ef8127dc0144cec5fa3160 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 / O Zika virus (ZIKV) é um arbovírus do gênero Flavivirus pertencente à família Flaviviridae. Duas principais linhagens são reconhecidas, Asiática e Africana, sendo a linhagem Asiática encontrada no Brasil. Os sintomas da infecção de ZIKV geralmente são brandos, mas existem relatos de casos de óbitos e manifestações neurológicas. Variações genéticas virais estão relacionadas com as diferenças nas manifestações clínicas da doença, portanto pesquisas sobre o genoma, filogenia e distribuição geográfica do vírus podem esclarecer como essas variações afetam a manifestação clínica do ZIKV, além de servir para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos. Apesar da importância, poucos estudos avaliam as variações genéticas virais. Este estudo realizou uma abordagem epidemiológica e filogenética a nível populacional que analisou a diversidade genética do ZIKV no Espírito Santo (ES), e as relações filogenéticas das cepas de ZIKV identificadas com sequências virais disponíveis no GenBank. Constatou-se que os municípios de Vitória, Cariacica e Cachoeiro de Itapemirim foram os mais afetados, sendo a linhagem Asiática a circulante no ES, assim como no restante do país. Foram encontradas 4 variações em 2 genes estudados, no gene E A1023G e C1050T e no gene NS5 C1891T e T1945C. As variações A1023T e C1891T foram descritas pela primeira vez em linhagens Asiáticas neste trabalho, e as variações C1050T e T1945C foram descritas anteriormente em linhagem Asiática apenas uma vez em uma sequência do Rio de Janeiro e três sequências na China, respectivamente. Por fim, apesar das variações genéticas encontradas nas sequências do ES não estarem associadas à mudança de aminoácidos, não se pode descartar que outras mudanças, seja em ligações entre enzimas e o RNA, seja na estrutura das proteínas finais, podem ser causadas por essas variações. Os resultados apresentados podem ser úteis a futuros trabalhos permitindo uma expansão da base de dados apresentando uma visão mais clara da epidemiologia do ZIKV, o que poderá ajudar a determinar a origem geográfica de um novo surto e, além disso, monitorar a eficácia das medidas de controle.

Zika vírus (ZIKV) é um arbovírus que ganhou grande relevância nos últimos anos. Zika vírus (ZIKV) é um arbovírus que ganhou grande relevância nos últimos anos. Zika Vírus (ZIKV) é um arbovírus que ganhou grande relevância nos últimos anos. Embora sua infecção geralmente induza sintomas leves, em alguns casos, a está associada à microcefalia em recém-nascidos e síndrome de Guillain-Barré em adultos. RNAs longos não codificadores (lncRNAs) desempenham um papel fundamental na modulação do sistema imunológico, mas pouco se sabe sobre sua função na infecção aguda por ZIKV. Portanto, o objetivo deste projeto foi estudar o transcritoma de macacos Rhesus durante a infecção e como os lncRNAs podem alterar a resposta em diferentes mamíferos infectados por ZIKV. Foram infectados quatro macacos Rhesus com a cepa HS-2015-BA-01 e o sangue foi coletado antes e depois de 1, 3, 5, 7, 10 e 14 dias de infecção. Em seguida, foi realizado o RNA-seq com amostras de sangue total para avaliar as alterações transcricionais durante a infecção. Nossas análises revelaram uma regulação da resposta imune, incluindo a identificação de lncRNAs que foram induzidos na infecção por ZIKV. Identificamos cerca de 9,210 lncRNAs, dos quais 3,246 ainda não foram anotados na base de dados ENSEMBL e 140 deles foram diferencialmente expressos em alguma comparação. Alguns genes associados à resposta imune, como STAT1, JAK1 e IFNGR2, parecem ser regulados negativamente. Análises de módulos de co-expressão e de redes revelaram as possíveis vias e genes afetados por alguns lncRNAs identificados. Os lncRNAs PROAP1, 2 e 3, ainda não depositados em bancos públicos, foram altamente correlacionados com BCL2, CYBA e MYCT1, que podem potencialmente regular a resposta pró-apoptótica. Além disso, outros conjuntos de dados (camundongos, neonatos e cultura celular) foram utilizados para avaliar a importância e a interferência dos lncRNAs na infecção. Com este estudo, encontramos lncRNAs previamente não descritos no genoma de M. mulatta, alguns dos quais estão correlacionados com genes importantes. Comparando todos os resultados, percebemos que alguns lncRNAs podem desempenhar papéis semelhantes, ainda que em diferentes animais. No geral, nossos resultados sugerem que a infecção por ZIKV modifica a expressão de genes codificadores e lncRNAs, quanto à mecanismos apoptóticos de resposta contra o vírus. / Zika Virus (ZIKV) is an arbovirus that has gained high relevance in recent years. Although ZIKV infection generally induces mild symptoms, in some cases, the infection is associated to microcephaly in newborns and Guillain-Barré syndrome in adults. Long non-coding RNAs (lncRNAs) play a key role in modulating the immune system but nothing is known about their function in acute ZIKV infection. Therefore, the aim of this project was to study the transcriptome of infected Rhesus monkeys throughout the infection and how lncRNAs can alter the response in different mammals infected by ZIKV. We had infected four Rhesus monkeys with HS-2015-BA-01 strain and collected their blood before and after 1, 3, 5, 7, 10 and 14 days of infection. We then performed RNA-seq with whole blood samples to assess the transcriptional changes during infection. Our systems biology analyses revealed a regulation of immune response during the infection including the identification of many lncRNAs that were induced upon ZIKV infection. We identified around 9.210 lncRNAs, 3.246 of which werent annotated on the ENSEMBL database, and 140 of which were differentially expressed in some comparison. Some genes associated with immune response such as STAT1, JAK1 and IFNGR2, appear to be negatively regulated. Co-expression modules and network analyses have revealed the putative pathways and genes affected by these lncRNAs. Such as PROAP1, 2 and 3, not yet deposited in public banks, were highly correlated with BCL2, CYBA and MYCT1, that can potentially regulate pro-apoptotic response. In addition, other datasets (mice, neonates an cell culture) were used to further assess the importance and interference of lncRNAs in the infection. With this study we found many previously undescribed lncRNAs in the M. mulatta genome, some of which are correlated with important genes. Comparing all these results we found that some lncRNAs may play similar roles although in different animals. Overall, our results suggest that ZIKV infection modifies the expression of coding genes and lncRNAs that lead to apoptotic mechanisms against the virus.

O vírus da Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, do gênero Flavivirus transmitido por mosquitos Aedes. Apesar da sua importância emergente na saúde pública, ainda pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares envolvidos no ciclo replicativo do ZIKV em célula humanas. Assim, o objetivo geral deste estudo foi caracterizar a distribuição subcelular do ZIKV na célula hospedeira e elucidar fatores celulares que regulam o tráfego intracelular de proteínas envolvidos nesses processos. Mais especificamente, determinar os compartimentos celulares que servem de plataforma de montagem para o ZIKV. Além disso, também verificar se o funcionamento da maquinaria Endosomal Sorting Complexes Required for Transport (ESCRT) é requerido no ciclo replicativo de ZIKV. Para identificar a localização subcelular do ZIKV, foram utilizados diferentes marcadores celulares, e, de acordo com os resultados, foi demonstrado que com 3 horas pós infecção (h. p. i.) ocorre colocalização de proteínas do ZIKV com um marcador de endossomo primário, enquanto que com 15h p.i. já é possível detectar proteínas virais no Retículo Endoplasmático (RE). Subsequentemente, com 27h p.i. o ZIKV direciona-se para o complexo de Golgi. Juntos, esses resultados indicam o direcionamento do ZIKV através da via secretória ao longo do tempo. Além disso, foi testado o envolvimento da maquinaria dos ESCRTs por meio do silenciamento da expressão da proteína TSG101 de ESCRT-I em células infectadas com ZIKV. Os resultados obtidos, sugerem que ESCRT-I tem participação importante na replicação do ZIKV, ocorrendo a diminuição dos títulos virais quando TSG101 é depletada da célula. Em conjunto, os resultados permitem concluir que ao longo da infecção o ZIKV encontrase associado aos compartimentos da via secretória inicial (RE e complexo de Golgi), e que a proteína TSG101 de ESCRT-I exerce papel importante na replicação viral. Sendo assim, esse estudo possibilitou um melhor entendimento sobre a dinâmica de replicação do ZIKV em células humanas. / Zika virus (ZIKV) is an arbovirus of the Flaviviridae family, of the genus Flavivirus that is transmitted by Aedes mosquitoes. Despite its emerging importance in public health, little is known about the molecular mechanisms involved in the replicative cycle of ZIKV in human cells. Thus, the general objective of this study was to characterize the subcellular distribution of the ZIKV in the host cell and to elucidate cellular factors that regulate the intracellular trafficking of proteins involved in these processes. More specifically, to determine the cellular compartments that serve as assembly platforms for the ZIKV. In addition, the study aimed to verify if the functioning of the Endosomal Sorting Complexes Required for Transport (ESCRT) machinery is required in the replicative cycle of ZIKV. In order to identify the subcellular localization of ZIKV, different intracellular markers were used, and, according to the results, it was demonstrated that at 3 hours post infection (h. p. i.) ZIKV proteins colocalize with an early endosome marker, whereas within 15h p.i. it is already possible to detect newlysynthesized viral proteins in the endoplasmic reticulum (ER). Subsequently, within 27h p.i., the ZIKV is directed to the Golgi complex. Together, these results delineate the targeting of ZIKV proteins through the secretory pathway over time. In addition, the involvement of the ESCRT machinery was tested by knocking down the expression of ESCRT-I protein TSG101 in ZIKV-infected cells. The results obtained suggest that ESCRT-I plays an important role in ZIKV replication, with viral titers decreasing when TSG101 levels are depleted in the cell. Together, the results allow us to conclude that ZIKV is associated with the initial secretory pathways (RE and Golgi complex) throughout the infection, and that the ESCRT-I TSG101 protein plays an important role in viral replication. Thus, this study contributes to a better understanding of the dynamics of ZIKV replication in human cells.

No Brasil a confirmação do primeiro caso de febre zika, resultante da infecção pelo vírus zika (ZIKV), foi no primeiro semestre de 2015, na região nordeste. Os achados característicos eram de uma doença que apresentava sintomas semelhantes aos sintomas causados pelo vírus dengue (DENV), porém mais amenos, sendo inicialmente denominada de \"Síndrome Dengue-Like\". Além desta semelhança no quadro clínico, ZIKV e os DENV são arboviroses endêmicas no Brasil e pertencem à mesma família viral, sendo muito próximos filogeneticamente, resultando em uma forte reação cruzada entre os anticorpos induzidos por estas infecções. O diagnóstico específico para o ZIKV requer cuidados uma vez que o DENV circula há muito mais tempo no Brasil e muitas pessoas já são imunes para, no mínimo, um sorotipo da doença. Desta forma, anticorpos contra os DENV nos testes sorológicos podem reagir inespecificamente contra o ZIKV, originando um resultado falso-positivo. As maneiras para diferenciar as duas doenças são o isolamento e a detecção do RNA viral durante a fase aguda da doença e dos anticorpos neutralizantes durante a fase de convalescença. Atualmente com a escassez de testes registrados pela ANVISA e a dificuldade em diferenciar as duas viroses usando testes sorológicos, amostras bem caracterizadas e confirmadas quanto à infecção pelo ZIKV foram utilizadas para o teste de comparação com vários kits comerciais aprovados ou não pela ANVISA, para detecção de anticorpos. Estas amostras também foram testadas por um ensaio soro-molecular padronizado e desenvolvido no Laboratório de Virologia Molecular. / In Brazil, the first case of zika fever, resulting from zika virus (ZIKV) infection, was confirmed in the first half of 2015, in the northeast region. The characteristic findings were of a disease that presented symptoms similar to the symptoms caused by dengue viruses (DENV), but milder, being initially called \"Dengue-Like Syndrome\". Although this similarity in the clinical presentation, ZIKV and (DENV) are arboviruses endemic in Brazil and belonging to the same viral family, being very close phylogenetically, and resulting in a strong cross-reaction between the antibodies induced by these infections. The specific diagnosis for ZIKV requires careful evaluation since DENV has been circulating much longer in Brazil and many people are already immune to at least one serotype of the disease. Thus, the antibodies against DENV may react non-specifically against ZIKV in serological tests, resulting in a false-positive result. The ways to differentiate the two diseases are the isolation and detection of viral RNA during the acute phase of the disease and the neutralizing antibodies during the convalescent phase. Actually, with the scarcity of tests registered by ANVISA and the difficulty in differentiating the two viruses using serological tests, well-characterized and confirmed samples for ZIKV infection were used for the comparison of several commercial kits for detection of antibodies approved or not by ANVISA. These samples were tested by a standardized serummolecular assay developed at the Molecular Virology Laboratory.

O vírus ZIKA pertence ao gênero Flavivírus e diversos trabalhos têm demonstrado que a infecção por esse vírus está associada com o desenvolvimento de anomalias congênitas fetais e doenças neurológicas como casos de microcefalia e de síndrome de Guillan-Barré. Com intuito de entender os mecanismos imunológicos de controle da replicação viral e na patogênese da doença, o objetivo do trabalho foi estabelecer um modelo experimental de infecção por vírus ZIKV em animais imunocompetentes e investigar a migração de leucócitos para o sistema nervoso central durante a infecção por esse vírus. Os animais C57BL/6 infectados por ZIKV apresentaram um aumento da carga viral no sistema nervoso central (SNC) após 24 horas de infecção e uma redução significativa após 48 e 72 horas de infecção. No entanto, os animais deficientes do receptor de IFN tipo I (IFNAR-/-) apresentaram uma alta carga viral após 48 e 72 horas de infecção. Nossos dados mostram que os animais IFNAR-/- são altamente suscetíveis a infecção com 100% de mortalidade na fase aguda da doença, enquanto os animais C57BL/6 são resistentes a infecção com 100% sobrevida por mais de 30 dias de infecção. A infecção com ZIKA induziu o recrutamento de duas subpopulações de monócitos CD11b+Ly6Chi e CD11b+Ly6Clo para o SNC de maneira dependente da sinalização de IFN tipo I. Uma vez que, os animais C57BL/6 apresentaram um aumento de monócitos no SNC após 48 horas de infecção, enquanto que os animais IFNAR-/- apresentaram o recrutamento dessas células somente após 72 horas de infecção. De maneira interessante, o recrutamento dos monócitos culminou com um aumento da expressão das citocinas IL-6 e IL-18 no SNC de animais C57BL/6, enquanto que a expressão dessas citocinas não foi encontrada no SNC de animais IFNAR-/-, sugerindo a importância da via de sinalização de IFN tipo I para a produção dessas citocinas. E por fim, demostramos que a migração dos monócitos para SNC de animais infectados com vírus ZIKA é dependente da produção de CCL2 produzida no cérebro de animais infectados e da expressão dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Uma vez que, animais deficientes para CCR2 (CCR2-/-) e CCR5 (CCR5-/-) apresentaram uma redução da frequência dos monócitos CD11b+Ly6Chi para o SNC em comparação aos animais C57BL/6 após a infecção. De maneira geral, nossos dados mostram que os animais C57BL/6 são resistentes à infecção por ZIKV, uma vez que a via de sinalização de IFN do tipo I está envolvida no recrutamento de monócitos inflamatórios para SNC e consequente controle da replicação viral. O desenvolvimento de um modelo experimental de infecção por vírus ZIKV abre perspectivas para o entendimento dos mecanismos de controle da replicação viral e sobre a patogênese da doença. / The ZIKA virus belongs to the genus Flavivirus, several studies have demonstrated that the infection by this virus is associated with the development of fetal congenital anomalies and neurological diseases, such as microcephaly and Guillan-Barré syndrome. In order to elucidate the immunological mechanisms of the viral replication control and the disease pathogenesis, the study aim was to establish an experimental model of ZIKV infection in immunocompetent animals and investigate the leukocytes migration to the central nervous system during this virus infection. ZIKV infected C57BL/6 animals demonstrated an increased viral load in the central nervous system (CNS) after 24 hours of infection and a significant reduction after 48 and 72 hours of infection. However, type I INF receptor deficient mice (IFNAR-/-) had a high viral load after 48 and 72 hours of infection. Our data demonstrated that IFNAR-/- animals are highly susceptible to infection with 100% mortality during the acute phase of the disease, while C57BL/6 mice are resistant with 100% survival for more than 30 days of infection. ZIKA infection induced the recruitment of two monocytes subpopulation CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6Clo to the CNS in a dependent manner of type I INF signaling. C57BL/6 mice showed an increase of monocytes in the CNS after 48 hours of infection, whereas IFNAR-/- mice recruited these cells only after 72 hours of infection. Interestingly, the monocytes recruitment culminated in an increased expression of IL-6 and IL-18 in C57BL/6 mice CNS, while these cytokines expression was not observed in the CNS of IFNAR-/- animals, thus suggesting the importance of type I INF signaling pathway for these cytokines production. Finally, we have demonstrated that the monocytes migration to the CNS from animals infected with ZIKA virus is dependent of CCL2 production in the brain of infected animals, as well as the expression of the chemokine receptors CCR2 and CCR5. Given that CCR2 (CCR2-/-) and CCR5 (CCR5-/-) deficient animals demonstrated a frequency reduction of CD11b+Ly6Chi monocytes to the CNS compared to C57BL/6 mice after infection. Overall, our data demonstrate that C57BL/6 animals are resistant to ZIKV infection, since the type I INF signaling pathway is involved in the inflammatory monocytes recruitment to the CNS and subsequent viral replication control. The development of an experimental model of ZIKV infection open perspectives for the understanding of viral replication control mechanisms and disease pathogenesis.

O vírus ZIKA pertence ao gênero Flavivírus e diversos trabalhos têm demonstrado que a infecção por esse vírus está associada com o desenvolvimento de anomalias congênitas fetais e doenças neurológicas como casos de microcefalia e de síndrome de Guillan-Barré. Com intuito de entender os mecanismos imunológicos de controle da replicação viral e na patogênese da doença, o objetivo do trabalho foi estabelecer um modelo experimental de infecção por vírus ZIKV em animais imunocompetentes e investigar a migração de leucócitos para o sistema nervoso central durante a infecção por esse vírus. Os animais C57BL/6 infectados por ZIKV apresentaram um aumento da carga viral no sistema nervoso central (SNC) após 24 horas de infecção e uma redução significativa após 48 e 72 horas de infecção. No entanto, os animais deficientes do receptor de IFN tipo I (IFNAR-/-) apresentaram uma alta carga viral após 48 e 72 horas de infecção. Nossos dados mostram que os animais IFNAR-/- são altamente suscetíveis a infecção com 100% de mortalidade na fase aguda da doença, enquanto os animais C57BL/6 são resistentes a infecção com 100% sobrevida por mais de 30 dias de infecção. A infecção com ZIKA induziu o recrutamento de duas subpopulações de monócitos CD11b+Ly6Chi e CD11b+Ly6Clo para o SNC de maneira dependente da sinalização de IFN tipo I. Uma vez que, os animais C57BL/6 apresentaram um aumento de monócitos no SNC após 48 horas de infecção, enquanto que os animais IFNAR-/- apresentaram o recrutamento dessas células somente após 72 horas de infecção. De maneira interessante, o recrutamento dos monócitos culminou com um aumento da expressão das citocinas IL-6 e IL-18 no SNC de animais C57BL/6, enquanto que a expressão dessas citocinas não foi encontrada no SNC de animais IFNAR-/-, sugerindo a importância da via de sinalização de IFN tipo I para a produção dessas citocinas. E por fim, demostramos que a migração dos monócitos para SNC de animais infectados com vírus ZIKA é dependente da produção de CCL2 produzida no cérebro de animais infectados e da expressão dos receptores de quimiocinas CCR2 e CCR5. Uma vez que, animais deficientes para CCR2 (CCR2-/-) e CCR5 (CCR5-/-) apresentaram uma redução da frequência dos monócitos CD11b+Ly6Chi para o SNC em comparação aos animais C57BL/6 após a infecção. De maneira geral, nossos dados mostram que os animais C57BL/6 são resistentes à infecção por ZIKV, uma vez que a via de sinalização de IFN do tipo I está envolvida no recrutamento de monócitos inflamatórios para SNC e consequente controle da replicação viral. O desenvolvimento de um modelo experimental de infecção por vírus ZIKV abre perspectivas para o entendimento dos mecanismos de controle da replicação viral e sobre a patogênese da doença. / The ZIKA virus belongs to the genus Flavivirus, several studies have demonstrated that the infection by this virus is associated with the development of fetal congenital anomalies and neurological diseases, such as microcephaly and Guillan-Barré syndrome. In order to elucidate the immunological mechanisms of the viral replication control and the disease pathogenesis, the study aim was to establish an experimental model of ZIKV infection in immunocompetent animals and investigate the leukocytes migration to the central nervous system during this virus infection. ZIKV infected C57BL/6 animals demonstrated an increased viral load in the central nervous system (CNS) after 24 hours of infection and a significant reduction after 48 and 72 hours of infection. However, type I INF receptor deficient mice (IFNAR-/-) had a high viral load after 48 and 72 hours of infection. Our data demonstrated that IFNAR-/- animals are highly susceptible to infection with 100% mortality during the acute phase of the disease, while C57BL/6 mice are resistant with 100% survival for more than 30 days of infection. ZIKA infection induced the recruitment of two monocytes subpopulation CD11b+Ly6Chi and CD11b+Ly6Clo to the CNS in a dependent manner of type I INF signaling. C57BL/6 mice showed an increase of monocytes in the CNS after 48 hours of infection, whereas IFNAR-/- mice recruited these cells only after 72 hours of infection. Interestingly, the monocytes recruitment culminated in an increased expression of IL-6 and IL-18 in C57BL/6 mice CNS, while these cytokines expression was not observed in the CNS of IFNAR-/- animals, thus suggesting the importance of type I INF signaling pathway for these cytokines production. Finally, we have demonstrated that the monocytes migration to the CNS from animals infected with ZIKA virus is dependent of CCL2 production in the brain of infected animals, as well as the expression of the chemokine receptors CCR2 and CCR5. Given that CCR2 (CCR2-/-) and CCR5 (CCR5-/-) deficient animals demonstrated a frequency reduction of CD11b+Ly6Chi monocytes to the CNS compared to C57BL/6 mice after infection. Overall, our data demonstrate that C57BL/6 animals are resistant to ZIKV infection, since the type I INF signaling pathway is involved in the inflammatory monocytes recruitment to the CNS and subsequent viral replication control. The development of an experimental model of ZIKV infection open perspectives for the understanding of viral replication control mechanisms and disease pathogenesis.

O vírus da Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, do gênero Flavivirus transmitido por mosquitos Aedes. Apesar da sua importância emergente na saúde pública, ainda pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares envolvidos no ciclo replicativo do ZIKV em célula humanas. Assim, o objetivo geral deste estudo foi caracterizar a distribuição subcelular do ZIKV na célula hospedeira e elucidar fatores celulares que regulam o tráfego intracelular de proteínas envolvidos nesses processos. Mais especificamente, determinar os compartimentos celulares que servem de plataforma de montagem para o ZIKV. Além disso, também verificar se o funcionamento da maquinaria Endosomal Sorting Complexes Required for Transport (ESCRT) é requerido no ciclo replicativo de ZIKV. Para identificar a localização subcelular do ZIKV, foram utilizados diferentes marcadores celulares, e, de acordo com os resultados, foi demonstrado que com 3 horas pós infecção (h. p. i.) ocorre colocalização de proteínas do ZIKV com um marcador de endossomo primário, enquanto que com 15h p.i. já é possível detectar proteínas virais no Retículo Endoplasmático (RE). Subsequentemente, com 27h p.i. o ZIKV direciona-se para o complexo de Golgi. Juntos, esses resultados indicam o direcionamento do ZIKV através da via secretória ao longo do tempo. Além disso, foi testado o envolvimento da maquinaria dos ESCRTs por meio do silenciamento da expressão da proteína TSG101 de ESCRT-I em células infectadas com ZIKV. Os resultados obtidos, sugerem que ESCRT-I tem participação importante na replicação do ZIKV, ocorrendo a diminuição dos títulos virais quando TSG101 é depletada da célula. Em conjunto, os resultados permitem concluir que ao longo da infecção o ZIKV encontrase associado aos compartimentos da via secretória inicial (RE e complexo de Golgi), e que a proteína TSG101 de ESCRT-I exerce papel importante na replicação viral. Sendo assim, esse estudo possibilitou um melhor entendimento sobre a dinâmica de replicação do ZIKV em células humanas. / Zika virus (ZIKV) is an arbovirus of the Flaviviridae family, of the genus Flavivirus that is transmitted by Aedes mosquitoes. Despite its emerging importance in public health, little is known about the molecular mechanisms involved in the replicative cycle of ZIKV in human cells. Thus, the general objective of this study was to characterize the subcellular distribution of the ZIKV in the host cell and to elucidate cellular factors that regulate the intracellular trafficking of proteins involved in these processes. More specifically, to determine the cellular compartments that serve as assembly platforms for the ZIKV. In addition, the study aimed to verify if the functioning of the Endosomal Sorting Complexes Required for Transport (ESCRT) machinery is required in the replicative cycle of ZIKV. In order to identify the subcellular localization of ZIKV, different intracellular markers were used, and, according to the results, it was demonstrated that at 3 hours post infection (h. p. i.) ZIKV proteins colocalize with an early endosome marker, whereas within 15h p.i. it is already possible to detect newlysynthesized viral proteins in the endoplasmic reticulum (ER). Subsequently, within 27h p.i., the ZIKV is directed to the Golgi complex. Together, these results delineate the targeting of ZIKV proteins through the secretory pathway over time. In addition, the involvement of the ESCRT machinery was tested by knocking down the expression of ESCRT-I protein TSG101 in ZIKV-infected cells. The results obtained suggest that ESCRT-I plays an important role in ZIKV replication, with viral titers decreasing when TSG101 levels are depleted in the cell. Together, the results allow us to conclude that ZIKV is associated with the initial secretory pathways (RE and Golgi complex) throughout the infection, and that the ESCRT-I TSG101 protein plays an important role in viral replication. Thus, this study contributes to a better understanding of the dynamics of ZIKV replication in human cells.

No Brasil a confirmação do primeiro caso de febre zika, resultante da infecção pelo vírus zika (ZIKV), foi no primeiro semestre de 2015, na região nordeste. Os achados característicos eram de uma doença que apresentava sintomas semelhantes aos sintomas causados pelo vírus dengue (DENV), porém mais amenos, sendo inicialmente denominada de \"Síndrome Dengue-Like\". Além desta semelhança no quadro clínico, ZIKV e os DENV são arboviroses endêmicas no Brasil e pertencem à mesma família viral, sendo muito próximos filogeneticamente, resultando em uma forte reação cruzada entre os anticorpos induzidos por estas infecções. O diagnóstico específico para o ZIKV requer cuidados uma vez que o DENV circula há muito mais tempo no Brasil e muitas pessoas já são imunes para, no mínimo, um sorotipo da doença. Desta forma, anticorpos contra os DENV nos testes sorológicos podem reagir inespecificamente contra o ZIKV, originando um resultado falso-positivo. As maneiras para diferenciar as duas doenças são o isolamento e a detecção do RNA viral durante a fase aguda da doença e dos anticorpos neutralizantes durante a fase de convalescença. Atualmente com a escassez de testes registrados pela ANVISA e a dificuldade em diferenciar as duas viroses usando testes sorológicos, amostras bem caracterizadas e confirmadas quanto à infecção pelo ZIKV foram utilizadas para o teste de comparação com vários kits comerciais aprovados ou não pela ANVISA, para detecção de anticorpos. Estas amostras também foram testadas por um ensaio soro-molecular padronizado e desenvolvido no Laboratório de Virologia Molecular. / In Brazil, the first case of zika fever, resulting from zika virus (ZIKV) infection, was confirmed in the first half of 2015, in the northeast region. The characteristic findings were of a disease that presented symptoms similar to the symptoms caused by dengue viruses (DENV), but milder, being initially called \"Dengue-Like Syndrome\". Although this similarity in the clinical presentation, ZIKV and (DENV) are arboviruses endemic in Brazil and belonging to the same viral family, being very close phylogenetically, and resulting in a strong cross-reaction between the antibodies induced by these infections. The specific diagnosis for ZIKV requires careful evaluation since DENV has been circulating much longer in Brazil and many people are already immune to at least one serotype of the disease. Thus, the antibodies against DENV may react non-specifically against ZIKV in serological tests, resulting in a false-positive result. The ways to differentiate the two diseases are the isolation and detection of viral RNA during the acute phase of the disease and the neutralizing antibodies during the convalescent phase. Actually, with the scarcity of tests registered by ANVISA and the difficulty in differentiating the two viruses using serological tests, well-characterized and confirmed samples for ZIKV infection were used for the comparison of several commercial kits for detection of antibodies approved or not by ANVISA. These samples were tested by a standardized serummolecular assay developed at the Molecular Virology Laboratory.

Submitted by Rosina Valeria Lanzellotti Mattiussi Teixeira (rosina.teixeira@unisantos.br) on 2018-09-03T19:28:21Z No. of bitstreams: 1 Simone da Silva Cordeiro Davi.pdf: 573881 bytes, checksum: cc2dbc54a06141aa2dc5ba8dffd57d3b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-03T19:28:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simone da Silva Cordeiro Davi.pdf: 573881 bytes, checksum: cc2dbc54a06141aa2dc5ba8dffd57d3b (MD5) Previous issue date: 2018-08-14 / Introdução: O surto da infecção pelo Zika Vírus e os nascimentos de crianças com a Síndrome Congênita do ZIKV com associação a microcefalia desencadeou uma série de desafios a serem enfrentados pelos serviços de saúde e famílias. No contexto familiar, as mudanças decorridas desde a chegada de uma criança que necessita de cuidados especiais às percepções e significados construídos acerca da Síndrome e sua repercussão nas práticas de cuidado com a criança ainda são desconhecidos. Objetivo: Analisar o significado e repercussões da Síndrome Congênita ZIKV sobre as práticas de cuidado em saúde para mães de crianças acometidas pela Síndrome no contexto da epidemia do ZIKV no sertão da Paraíba. Método: Trata-se de uma pesquisa qualitativa, em que foram entrevistadas, no período outubro de 2017 a fevereiro de 2018, 8 mães de crianças com o diagnóstico de Síndrome Congênita do ZIKV com associação a microcefalia confirmados no contexto da epidemia ZIKV e que possuem diagnóstico confirmado. Para a delimitação do número de participantes, utilizou-se como critério a saturação dos dados. Utilizou-se como coleta dos dados a entrevista semiestruturada, sendo feitas análises por meio da Análise de Conteúdo sistematizada por Bardin, em que foram identificadas três categorias referentes a relação da mãe com o diagnóstico, com o tratamento e consigo mesma. Resultados: Os diagnósticos de Síndrome Congênita do ZIKV das crianças desta pesquisa aconteceram tanto no período gestacional quanto após os nascimentos das crianças, gerando nas mães sentimentos de angústia e receio, e em algumas mães a rejeição à criança, desenvolvendo sentimento de insegurança e medo por não saberem exatamente do que se tratava e as repercussões em suas vidas e na vida do bebê. Os significados maternos acerca do diagnóstico de microcefalia refletiram na dedicação de suas vidas para as crianças, pois as mães, na maioria das vezes, abandonaram suas vidas profissionais e sociais em função de seus filhos, apresentando baixa autoestima. Quanto aos cuidados recebidos pela criança nos serviços de atenção à saúde, as mães apresentam percepções sobre a falta de preparação dos profissionais sobre a Síndrome, a longa distância que percorrem para as crianças terem acesso ao tratamento, além da percepção de diferenciação nos atendimentos realizados pelos profissionais de saúde. Considerações Finais: As mães que participaram da pesquisa apresentaram uma elevada sobrecarga acerca dos cuidados com a criança, além de um nível econômico extremamente baixo, interferindo na qualidade dos cuidados prestados à criança e a falta de rede de cuidado público em saúde e suporte psicossocial destinado às mães para o enfrentamento das adversidades que a síndrome propõe. / Introduction: The outbreak of Zika Virus infection and the births of children with ZIKV Congenital Syndrome associated with microcephaly have unleashed a number of challenges to be faced by health services and families. In the family context, the changes that have occurred since the arrival of a child in need of special care, the perceptions and meanings built on the Syndrome and its repercussion on the practices of child care are still unknown. Objective: To analyze the significance and repercussions of the ZIKV Congenital Syndrome on health care practices for mothers of children affected by Syndrome in the context of the ZIKV epidemic in the interior of the state of Paraíba. Method: This is a qualitative study, in the period October 2017 to February 2018, eight mothers of children diagnosed with ZIKV congenital syndrome with an association with microcephaly confirmed in the context of the ZIKV epidemic were interviewed. diagnosis confirmed. For the delimitation of the number of participants, the saturation of the data was used as criterion. The semi-structured interview was used as data collection, in which they were analyzed through the systematization of the Bardin Content Analysis, in which three categories were identified regarding the relation of the mother to the diagnosis, to the treatment and to herself. Results: The diagnosis of congenital ZIKV syndrome occurred both during the gestational period and after the birth of the child, generating in the mothers feelings of anguish and fear, and in some mothers rejection to the child, developing feelings of insecurity and fear for not knowing exactly the and the repercussions on their lives and the life of the baby. The maternal meanings about the diagnosis of microcephaly reflected in the dedication of their lives to the children, in which mothers, most of the time, abandoned their professional and social lives according to their children, presenting low self-esteem. As for the care received by the child in the health care services, the mothers present perceptions about the lack of preparation of the professionals about the Syndrome, the long distance that they cover for the children to have access to the treatment, besides the perception of differentiation in the consultations performed by the Health professionals. Final Considerations: Mothers who participated in the research presented a high overload on child care, as well as an extremely low economic level, interfering with the quality of care provided to children and the lack of a network of public health care and psychosocial support intended mothers to face the adversities that the syndrome proposes.

O Zika virus (ZIKV) é um flavívirus, tal qual o virus da dengue e, assim como esse, também é transmitido pelos mosquitos do gênero Aedes, especialmente o Aedes aegipty Restrito ao continente africano até 2007, o ZIKV chegou as Américas em 2013, com os primeiros registros brasileiros da infecção datando de 2014 - 2015. Em 2016, a OMS classificou o surto de ZIKV como Emergência de Saúde Mundial. O ZIKV pode acarretar na Sindrome Congênita do ZIka Vírus (SCZ) em bebês que sofreram infecção gestacional. Além da manifestação mais temida e marcante, a microcefalia, e de demais danos neurológicos, a SCZ tem sido principalmente associada com anomalias visuais e oftalmológicas. Entretanto, poucas informações se encontram disponíveis na literatura sobre o impacto da infecção por ZIKV nas funções visuais e desenvolvimento visual em crianças sem microcefalia. Pouco se conhece também do impacto da infecção em diferentes populações brasileiras, de localidades distintas. Dessa forma, o presente trabalho se propôs a preencher essa lacuna, avaliando a acuidade visual (AV) e desenvolvimento da acuidade visual em crianças expostas gestacionalmente ao ZIKV, utilizando-se o Teste dos Cartões de Acuidade de Teller (CAT). As crianças avaliadas vieram de duas populações distintas da região Sudeste do Brasil, a cidade de Jundiaí (SP) e a cidade do Rio de Janeiro (RJ). A Coorte Zika Jundiaí foi composta de 118 crianças divididas entre grupo controle saudável (ZC) com 63 crianças, grupo experimental, dividido em dois subgrupos, baseado em exame de RT- qPCR, sorologia ou avaliação clínica, o subgrupo Exposto (ZE) com 23 crianças, em que apenas as mães tiveram infecção confirmada por ZIKV e o subgrupo Infectado (ZI), com 24 crianças no qual mãe e criança tiveram infecção confirmada. Oito crianças formaram o grupo Controle Postivo (M), com crianças com microcefalia em decorrência de outras causas. A Coorte IFF Fiocruz Rio de Janeiro foi composta de 32 crianças, todas com infecção confirmada pelo ZIKV (ZI), por exame de RT-qPCR, sorologia ou avaliação clínica. Os resultados do presente trabalho mostram que a exposição gestacional ao ZIKV, na ausência de infecção, parece não ter efeito sobre a AV ou seu desenvolvivemento. No entanto, quando ocorre infecção gestacional por ZIKV, pode haver prejuízos à AV mesmo quando a criança não apresenta anomalias neurológicas e/ou oftalmológicas aparentes. Esse trabalho, entretanto, concorda com estudos anteriores que mostram uma maior chance de haver perdas de AV concomitantementes a um comprometimento cognitivo e/ou oftalmologico. As análises do subgrupo ZI de Jundiaí dão suporte a noção de que crianças gestacionalmente infectadas por ZIKV tendem a apresentar um desenvolvimento anormal (mais lento) da AV. Esse achado, se reproduzido, possuí repercussões mais gerais, dado que quaisquer danos à função visual podem indicar deficiências no sistema nervoso central. Assim sendo, tais achados tem importantes repercussões na saúde pública. Além disso, as taxas diferentes de danos à AV, bem como de incidência de microcefalia e comprometimento oftalmológico entre as populações estudadas neste trabalho, apoiam a hipótese da existência de demarcadas diferenças regionais entre as linhagens de ZIKV circulantes no país, assim como de diferenças de suscetibilidade de hospedeiros entre as populações estudadas / The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus, such as the dengue virus, and like the dengue virus is also transmitted by the Aedes osquitoes, especially the Aedes aegipty Restricted to the African Country until 2007, the ZIKV arrived in the Americas in 2013, with the first brazillian cases of the infection dating to 2014 - 2015. In 2016, WHO classified the ZIKV spread as a World Health Emergency. The ZIKV, in gestationally exposed children, can lead to Congenital Zika Syndrome (CZS). Beyond its most marked and feared manifestation, microcephaly, and its other neurological damages, CZS is mostly associated with visual and ophthalmologic anomalies. However, little information is available on the literature about the impact of the ZIKV infection in the visual function and on the visual development in infected children without microcephaly. Little is also known about the impact of the infection in different brazillian populations from distinct areas. With that in mind, the present work intends to fill this gap in literature, evaluating the visual acuity (VA) and visual acuity development in children gestationally exposed to the ZIKV, using the Teller Acuity Cards Test (TAC). The evaluated children were from two different populations of the Southeast region of Brazil, the city of Jundiaí (SP) and the city of Rio de Janeiro (RJ). The Zika Jundiaí Cohort was composed of 118 children divided between the healthy control group (ZC) with 63 children and the experimental group, divided in two subgroups based on RT-qPCR, sorology or clinical evaluation, the Exposed subgroup (ZE) with 23 children, which only the mothers had ZIKV confirmed and the Infected subgroup (ZI), with 24 children, wich both mother and children had ZIKV confirmed infection. Eight children formed the Positive Control Group (M), composed of children with microcephaly due to other causes. The IFF Fiocruz Rio de Janeiro Cohort was composed of 32 children, all with confirmed ZIKV infection (ZI), either by RT-qPCR/sorology exam or by clinical evaluation. The results of the present work show that ZIKV exposition in absence of infection, does not seem to affect VA or its development. However when theres a gestational ZIKV infection, it may lead to VA damages even when the children does not show any apparent neurologic/ophtalmologic anomalies. This work, nonetheless, is in agreement with former studies that show a higher chance of VA losses when the children also have cognitive and/or ophtalmologic deficits. The Jundiaí ZI Subgroup analisies support the notion that ZIKV gestationally infected children tend to have an abnormal (slower) VA development. This finding, if replicated, has more general repercussions given that any visual function damages may indicate central nervous system deficiencies. Thus, these findings have important repercussions in the public health area. Furthermore, the different rates of VA damages as well as the different rates of microcephaly incidencies and ophthalmologic deficits between the populations studied in this work support the hypothesis of marked regional differences between the brazillian ZIKV strains, as well as host suscepitibilitiess differences between the studied populations