[pt] O petróleo é uma mistura complexa de diversos compostos, sendo os hidrocarbonetos seus principais constituintes, chegando a atingir 98% da composição total. Entre os hidrocarbonetos, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) destacam-se por serem, em geral, resistentes à biodegradação e persistentes no ambiente, sendo potencialmente carcinogênicos ao homem e aos organismos. A presença destes compostos nos ecossistemas, de origem natural ou proveniente de fontes antropogênicas, e seus efeitos podem ser monitorados utilizando organismos do próprio ambiente. Nos ecossistemas aquáticos, a determinação de metabólitos de HPA na bílis de peixes que habitam o ambiente pode ser usada como indicadora de exposição ambiental recente. Assim, o desenvolvimento e a validação de métodos usualmente empregados na determinação de metabólitos de HPA em bílis de peixes têm contribuição e aplicação na elaboração de diagnósticos ambientais sobre a contaminação por petróleo e derivados nos sistemas aquáticos. Este trabalho otimizou, validou e comparou dois métodos para a determinação de 1- hidroxipireno em bílis de peixes. Um método usando a cromatografia a liquido de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-F) e o outro usando a espectroscopia de fluorescência convencional. Os métodos foram validados com base nos parâmetros linearidade, sensibilidade, limite de detecção, limite de quantificação, repetitividade, reprodutibilidade e incluindo os cálculos das incertezas associadas. Nos dois casos, as fontes de contribuição mais significativas para a incerteza dos métodos foram as soluções-padrão. A incerteza padrão combinada associada ao método utilizando a cromatografia a líquido foi menor que a associada ao método utilizando fluorescência molecular. Entretanto, o método em fluorescência, apesar de ser semi-quantitativo e de apresentar incerteza maior, tem tempo de análise e custos de operação e manutenção menores, sendo indicado para análises preliminares. / [en] Petroleum is a complex mixture of several compounds. Among its principal components there are hydrocarbons which account to up to 98% of the total composition. Among the hydrocarbons, there are polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), which are more resistant to biodegradation, quite persistent in the environment and potentially carcinogenic to humans and marine organisms. The presence of these compounds on ecosystems, from natural origin or from anthropogenic sources, and their efluorescênciaects, can be monitored using living organisms of the environment. In aquatic ecosystems, the determination of PAH metabolites, in fish bile from the environment can be used as an indicator of recent environmental exposure. Thus, the development and validation of methods usually employed in the determination of PAH metabolites in the bile of fish have assistance in the preparation and implementation of diagnoses on the environmental contamination by petroleum and derivatives in aquatic systems. In this work two methods for the determination of 1- hydroxypyrene in fish bile were improved, validated and compared. A method using the high liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-F) and the other using fixed fluorescence spectroscopy. The methods were validated based on parameters linearity, sensitivity, limit of detection, limit of quantification, repeatability, reproducibility. In addition, calculations of the uncertainties associated to the 1-hydroxypyrene measurement were made. In both cases, the sources of most significant contribution to the methods uncertainty were the standard solutions. The combined standard uncertainty associated with the method using the liquid chromatography was lower than that associated with the method using molecular fluorescence. The fluorimetric method can be used as a semi-quantitative tool and presented greater uncertainty. However, this method has lower analysis time and costs of operation and maintenance, being quite suitable for preliminary analysis.