[pt] O petróleo é uma mistura complexa de diversos compostos, sendo os hidrocarbonetos seus principais constituintes, chegando a atingir 98% da composição total. Entre os hidrocarbonetos, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) destacam-se por serem, em geral, resistentes à biodegradação e persistentes no ambiente, sendo potencialmente carcinogênicos ao homem e aos organismos. A presença destes compostos nos ecossistemas, de origem natural ou proveniente de fontes antropogênicas, e seus efeitos podem ser monitorados utilizando organismos do próprio ambiente. Nos ecossistemas aquáticos, a determinação de metabólitos de HPA na bílis de peixes que habitam o ambiente pode ser usada como indicadora de exposição ambiental recente. Assim, o desenvolvimento e a validação de métodos usualmente empregados na determinação de metabólitos de HPA em bílis de peixes têm contribuição e aplicação na elaboração de diagnósticos ambientais sobre a contaminação por petróleo e derivados nos sistemas aquáticos. Este trabalho otimizou, validou e comparou dois métodos para a determinação de 1- hidroxipireno em bílis de peixes. Um método usando a cromatografia a liquido de alta eficiência com detector de fluorescência (HPLC-F) e o outro usando a espectroscopia de fluorescência convencional. Os métodos foram validados com base nos parâmetros linearidade, sensibilidade, limite de detecção, limite de quantificação, repetitividade, reprodutibilidade e incluindo os cálculos das incertezas associadas. Nos dois casos, as fontes de contribuição mais significativas para a incerteza dos métodos foram as soluções-padrão. A incerteza padrão combinada associada ao método utilizando a cromatografia a líquido foi menor que a associada ao método utilizando fluorescência molecular. Entretanto, o método em fluorescência, apesar de ser semi-quantitativo e de apresentar incerteza maior, tem tempo de análise e custos de operação e manutenção menores, sendo indicado para análises preliminares. / [en] Petroleum is a complex mixture of several compounds. Among its principal components there are hydrocarbons which account to up to 98% of the total composition. Among the hydrocarbons, there are polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), which are more resistant to biodegradation, quite persistent in the environment and potentially carcinogenic to humans and marine organisms. The presence of these compounds on ecosystems, from natural origin or from anthropogenic sources, and their efluorescênciaects, can be monitored using living organisms of the environment. In aquatic ecosystems, the determination of PAH metabolites, in fish bile from the environment can be used as an indicator of recent environmental exposure. Thus, the development and validation of methods usually employed in the determination of PAH metabolites in the bile of fish have assistance in the preparation and implementation of diagnoses on the environmental contamination by petroleum and derivatives in aquatic systems. In this work two methods for the determination of 1- hydroxypyrene in fish bile were improved, validated and compared. A method using the high liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-F) and the other using fixed fluorescence spectroscopy. The methods were validated based on parameters linearity, sensitivity, limit of detection, limit of quantification, repeatability, reproducibility. In addition, calculations of the uncertainties associated to the 1-hydroxypyrene measurement were made. In both cases, the sources of most significant contribution to the methods uncertainty were the standard solutions. The combined standard uncertainty associated with the method using the liquid chromatography was lower than that associated with the method using molecular fluorescence. The fluorimetric method can be used as a semi-quantitative tool and presented greater uncertainty. However, this method has lower analysis time and costs of operation and maintenance, being quite suitable for preliminary analysis.

[pt] Método de identificação e quantificação de peptídeos, através da otimização de estratégias para a marcação de peptídeos com metais e subsequente separação por nano-HPLC-UV, MALDI MS. Primeiramente, peptídeos foram marcados com 3 diferentes metais lantanídeos usando um reagente funcional NHS-DOTA. Os resultados demonstraram que a reação de derivatização usando o reagente quelante DOTA foi eficiente para peptídeos simples e misturas dos mesmos, verificada através do MALDI MS a partir da relação m/z. Em paralelo, análises ambientais foram realizadas pela otimização de um procedimento de extração de metalotioneína em bílis de peixe, uma vez que esta matriz tem sido reportada como um biomarcador ambiental de contaminação por metal. Diferentes procedimentos e agentes de redução foram aplicadas para a extração de metalotioneína em bílis e fígado de peixe (Oreochromis niloticus. Análises espectrofotométricas foram realizadas a fim de quantificar os extratos de MT, e gel SDS-PAGE foi usado para avaliação qualitativa dos diferentes procedimentos usados. Cada procedimento foi avaliado estatisticamente. Metodologia de superfície de resposta foi aplicada para amostras de bílis, a fim de avaliar a resposta desta matriz. Em um contexto ambiental, concentrações de MT biliar foi mais baixa que MT do fígado, no entanto, a primeira mostrou-se mais adequada para um monitoramento ambiental. / [en] This work developed a new method for the identification and quantification of peptides, by optimizing some of the available strategies suitable for labeling peptides with lanthanide metals with subsequent separation by nano-HPLC with UV detection, matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry (MALDI MS). First, peptides were labeled with the three different lanthanide metals using a functional DOTA-based reagent. The results demonstrate that the derivatization reaction using the chelating reagent DOTA-NHS-ester was effective for single peptides and peptide mixtures, verified from the m/z relation obtained by MALDI MS. In parallel, environmental analyses were conducted, by performing the standardization of metalloprotein purification in fish bile, since this matrix has been reported as a biomarker for environmental metal contamination. Different procedures and reducing agents were applied to purify MT isolated from fish (Oreochromis niloticus) bile and liver. Spectrophotometrical analyses were used to quantify the resulting MT samples, and SDS-PAGE gels were used to qualitatively assess the different procedure results. A response surface methodology was applied for bile samples. In an environmental context, biliary MT was lower than liver MT, and, bile MT seems to be more adequate in environmental monitoring scopes. / [fr] Ce travail a développé une nouvelle méthode pour l identification et la quantification des peptides, par l optimisation de certaines stratégies disponibles appropriées pour le marquage des peptides avec des métaux lanthanide, une séparation par nano-HPLC et détection UV, et suivi par MALDI MS. Tout d abord, les peptides ont été marqués avec les trois métaux lanthanides différents et un réactif fonctionnel - DOTA. Les résultats montrent que la réaction de transformation en dérivé à l aide du réactif chélateur DOTA-NHS-ester a été efficace pour des peptides individuels et des mélanges de peptides, vérifiées à partir de la relation m/z obtenue par MALDI MS. En parallèle, nous avons effectué l optimisation pour la purification de métalloprotéine dans la bile de poisson, qui est signalée entant que biomarqueurs de contamination métallique de l environnement. Des procédures différentes et les agents réduisant ont été apliqués pour purifier les MT isolées de la bile et du foie des poissons (Oreochromis niloticus). Des analyses spectrophotométriques ont été utilisées pour quantifier les échantillons de MT, et le gel SDS-PAGE a été utilisé pour évaluer qualitativement les différents résultats de la procédure. Chaque procédure a en suíte été évaluée statistiquement, une méhtode des surfaces de réponse a été appliquée. Les MT de la bile semblent être plus adéquate pour la surveillance de l environnement en ce qui concerne l exposition récente à des xénobiotiques qui peuvent influer sur l expression protéomique et metalloproteomique de cette matrice biologique.