Zugl.: München, Univ., Diss., 2008

Marine natural products which contain a £]- carboline skeleton are widely distributed in marine invertebrates. The discovery of natural £]- carboline metabolites as potent antitumor and antival agents has stimulated a great interest on the synthetic and pharmatological studies of£]- carboline derivatives. Herein, the preparation, charactrization and biolgical evaluation of 1-substituted 1,2,3,4-tetrahydro-£]- carboline and 3,4-dihydro-£]- carboline derivatives are reported. A facile synthetic method by the application of Pictet-Sengler reaction and DDQ oxidation allowed the preparation of compounds 63-72. Compounds 63-67 were synthesized from tryptamine and N-substituted-3-carbazole carboxaldehyde via Pictet-Spengler cyclization. Subsequent oxidation of compounds 63-67 by DDQ furnished compounds 68-72. The structures of compounds 63-67 were determined by several spectroscopic methods. A series of 1-substituted-1,2,3,4-tetrahydro-£]- carboline (63-67) and 3,4-dihydro-£]- carboline derivatives (68-72) have been evaluated to possess cytotoxicity against human tumor cells including KB16, DLD and NCI cell lines. On the other hand, chromatographic separation of acetone extract of Formosan grogonian coral Isis hippuris (collected in Gree island) has led to the isolation of four marine steroids namely hippurin-1 (74), 22-epi-hippurin-1 (80), 2-deacetylhippurin-1 (82) and 2-deacetyl-22-epi-hippurin-1 (83), as well as a new compound 4-hydroxy-5-(p-hydroxy phenyl)-pentane-2, 5-dione (86). The structures of all above compounds were established on the basis of spectral analysis. Biological studies revealed that compounds 74, 80, 82, 83 exhibited potent cytotoxicity against NUGC tumor cells, but compound 86 was inactive.

Previously, the natural£]-carboline metabolites as potent antitumor and antival agents have spurred a great interest on the synthetic and pharmacological studies of£]-carboline derivatives. Herein, a simple synthetic method by the application of Pictet-Spengler reaction and DDQ oxidation allowed the preparation of 1-substituted£]-carboline derivatives. Compounds 88-91 were synthesized from tryptamine and N-substituted-3-carbazole carboxaldehyde via Pictet-Spengler cyclization. Then, oxidation of compounds 88-91 by DDQ provided compounds 92-95. Their structures were determined by spectroscopic methods. Biological screening revealed that compounds 88 and 93 possessed in vitro cytotoxicties against two tumor cell lines (KB, Hepa), respectively. The ED50 value of compound 88 showed cytotoxicities against Hepa (Human hepatoma) tumor cell lines were 1.12 £gg/ml. The ED50 value of compound 93 showed cytotoxicities against KB (Human oral epidermoid carcinoma) tumor cell lines were 0.48 £gg/ml. On the other hand, the marine sponge Cacospongia sp. was collected along seashore area of Lan-Yu in Taiwan. Fractionation of the MeOH/CHCl3 extract by using silica gel column chromatography yielded a dauble bond isomer fasciculatin (97). The structure of 97 was identified by UV¡BIR¡BMS¡B1D and 2D NMR.

Techn. Univ., Diss.--Braunschweig, 2003.

Isatin-derived 1,2,4-triazines were employed as electron deficient azadienes in inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) chemistry with tethered alkynyl dienophiles, leading to biologically interesting heterocyclic lactam- and lactone-annulated α-carbolines in excellent yields under microwave promotion. The chemistry scope was probed using various alkynyl amines and alcohols, and the impact of the tether length between the triazines and the dienophiles was also investigated. This IEDDA methodology was subsequently applied to the synthesis of an α-carboline library, producing eighty-eight members starting with various isatin-derived triazines, indole-derivatives, and propargylamine derivatives. In a related project, a regioselective Lewis acid catalyzed amidation of dimethyl 5H-pyridazino[4,5-b]indole-1,4-dicarboxylate was established to selectively direct the amidation to occur at either the C1 or C4 ester positions. This chemistry was then applied to tether dienophiles to the pyridazinoindole ring via an amide linkage. Subsequent IEDDA cycloadditions of these pyridazinoindole/dienophile pairs afforded carbazoles in excellent yields under thermal conditions. The scope of this chemistry scope was also thoroughly probed, leading to a library of one hundred and eighty-eight members. The synthesis of a third heterocyclic scaffold using Diels-Alder chemistry was also accomplished. Asymmetric cycloadditions of anthrone with various maleimides were successfully achieved using different chiral organocatalysts. The identity of the optimal catalytic system depended upon the dienophile, with good enantioselectivities achieved (78-83% ee). This chemistry was successfully applied as the stereocontrol element in a Diels-Alder/Functional Group Transformation/retro-Diels-Alder sequence to prepare alkaloidal scaffolds in an optically enriched form.

The chemical study of three New Zealand marine organisms is described, along with a survey of the chemistry and biological activity of eighty-five marine organisms collected from New Zealand waters. The study of the New Zealand marine bryozoan Pterocella vesiculosa has resulted in the isolation of three new compounds; pterocellin H, pterocellin I and 1-methyl-5-bromo-8-methoxy-β-carboline. These compounds were characterised using high resolution mass spectrometry, one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography. The biological activity of these compounds was investigated and a discussion of the results including a comparison with the activity of closely related compounds is also presented. The crude extracts of eighty-five marine organisms were surveyed to establish their biological activity and chemical constituents. The results of this study indicated which species had interesting biological activity. The chemical survey allowed geographical and intra-species comparisons of chemical constituents between samples, as well as potentially indicating the presence of known secondary metabolites. For the Pterocella vesiculosa samples the survey methodology clearly illustrated the presence of pterocellins A and B. Two marine organisms were chosen for further investigation based on their biological activity and chemical survey results. Bioactivity directed isolation procedures yielded no new compounds from the organisms. The sterol composition of these species is also presented.

Deux systèmes enzymatiques clés dans l'inflammation se sont révélés être impliqués dans de nombreux cancers (côlon, pancréas, sein, poumon) et notamment dans le cancer <br />de la prostate (CaP). La 5-lipoxygénase (5-LO) contrôle la formation des leucotriènes, médiateurs de l'inflammation de l'allergie. La cyclooxygénase existe sous deux isoformes : COX1 et COX2. COX1 est exprimée de manière constitutive et COX2 est exprimée de manière inductible. <br />La voie des cyclooxygénases contrôle la formation des prostaglandines, médiateurs de la réponse inflammatoire. En regard des similitudes de leurs surexpressions dans le cancer humain, <br />il est possible d'envisager un nouveau traitement du cancer ciblé sur la dérégulation <br />du métabolisme de l'acide arachidonique. L'objet de cette étude est de participer à la recherche sur le cancer de la prostate par la conception puis la synthèse en parallèle de <br />N-benzoyltétrahydro-γ-carbolines, inhibiteurs potentiels mixtes 5-LO / COXs. Dans ce but, <br />une stratégie de synthèse de type convergente fut développée à partir de chlorhydrates <br />de phénylhydrazine substitués en position para et de dérivés de pipéridin-4-one qui se cyclisent <br />en tétrahydro-γ-carbolines par catalyse acide (méthode de Fischer). Parallèlement à cette voie de synthèse, un composé inhibiteur de la 5-LO, le méthoxytétrahydropyranne (MTHP) du ZD-2138, est alkylé par une chaîne polyméthylénique à trois carbones. La condensation de la tétrahydro-γ-carboline et du MTHP alkylé en milieu basique fournit un composé dont l'azote indolique libre est ensuite benzoylé ou benzylé. Les activités 5-LO et COX1/COX2 ont été obtenues ex vivo <br />sur sang total humain. Les tests concernant l'inhibition de la prolifération cellulaire sont effectués sur différentes lignées cellulaires (de type L-1210, MCF7 et PC-3) afin de mettre en évidence <br />le pouvoir cytotoxique des composés.

β-Carboline sind heterozyklische Indolalkaloide, die ubiquitär in unserer Umwelt und Nahrung vorkommen, aber auch endogen aus Tryptophan gebildet werden können. Aufgrund der strukturellen Verwandtschaft bestimmter β-Carboline zu dem dopaminergen Neurotoxin MPP+ wird ein möglicher Beitrag zur Pathogenese der Parkinson-Krankheit diskutiert. MPP+ ist seit langem für seine selektive Toxizität gegenüber dopaminergen Neuronen und das Auslösen von Parkinsonsymptomen bekannt. Insbesondere 2,9-DiMe-BC wurde in erhöhter Konzentration in der lumbalen cerebrospinalen Flüssigkeit von Parkinsonpatienten detektiert, jedoch nicht in Kontrollprobanden. Eine Inhibierung von Komplex I der mitochondrialen Atmungskette und eine selektive Toxizität auf DA Neurone konnten nachgewiesen werden. Die genauen Mechanismen des Zelltodes bleiben jedoch ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Mechanismen des Zelltodes, ausgelöst durch 2,9-DiMe-BC, in dopaminergen Primärzellkulturen des Mesencephalons von C57Bl/6-Mäusen untersucht. Drei weitere BC 2-Me-BC, 9-Me-BC und 1,9-DiMe-BC standen für Untersuchungen zur Verfügung. In ersten Experimenten wies 9-Me-BC und 1,9-DiMe-BC keine Toxizität gegenüber DA Neuronen auf. Aufgrund der höheren Toxizität von 2,9-DiMe-BC verglichen mit 2-Me-BC wurden nachfolgende Experimente mit dem zweifach methylierten BC durchgeführt. Durch die Behandlung mit 2,9-DiMe-BC konnte ein höherer Verlust der DA Neurone gegenüber anderen neuralen Zellen festgestellt werden. Eine selektive Aufnahme über den Dopamintransporter und damit verbundene Schädigung der DA Neurone, wie bei MPP+, konnte nicht nachgewiesen werden. Für 2,9-DiMe-BC wurde eine LC50 der DA Neurone von 14,1 µM und für MPP+ von 4,4 µM bestimmt. 2,9-DiMe-BC verursachte in der Gesamtkultur eine erhöhte Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies und eine gesteigerte Laktatproduktion. In diesem Zusammenhang kann eine Hemmung von Komplex I der Atmungskette vermutet werden. Des Weiteren konnte eine Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials und des ATP-Gehaltes gemessen werden. Eine Aktivierung des apoptotischen Zelltodes wurde mit einer erhöhten Aktivität von Caspase-3 nachgewiesen. Durch die Behandlung mit 2,9-DiMe-BC wurde in der Primärzellkultur jedoch auch in erhöhtem Maß Nekrose ausgelöst. Dabei wurde eine höhere Sensitivität von jüngeren Kulturen (8. DIV) gegenüber älteren (10. DIV) festgestellt. Genexpressionsanalysen konnten das Auslösen von oxidativem Stress und Apoptose durch 2,9-DiMe-BC bestätigen, da mehrere Gene dieser Prozesse hochreguliert wurden. Des Weiteren wurden Gene reguliert, die im Zusammenhang mit der Hitzeschock-Antwort, Entzündungsprozessen, DNA-Schädigung und Reparatur, Zellalterung und Proliferation stehen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 2,9-DiMe-BC die Mitochondrienaktivität hemmt, sowohl nekrotische als auch apoptotische Prozesse in der dopaminergen mesencephalen Primärzellkultur auslöst und die Entstehung von oxidativem Stress eine zentrale Rolle spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Untersuchung von unerwarteten neuroprotektiven Effekten von 9-Me-BC in der Primärzellkultur. Durch die Behandlung mit 9-Me-BC verringerte sich die LDH-Freisetzung und reduzierte sich die Anzahl der nekrotischen Zellen um 50 %. Nach 24 h konnte eine verminderte Caspase 3-Aktivität gemessen werden, die allerdings nach 48 h im Vergleich zur Kontrolle wieder zunahm. Hier wären längerfristige Untersuchungen zur Klärung dieser Frage anzuschließen. Des Weiteren erhöhte sich der intrazelluläre ATP-Gehalt. Möglicherweise fand eine energieabhängige Verschiebung von Nekrose zu Apoptose statt. Genexpressionsanalysen zeigten, dass verschiedene Gene von inflammatorischen und apoptotischen Signaltransduktionswegen herrunterreguliert wurden. Überraschenderweise erhöhte sich nach der Behandlung mit 9-Me-BC die Anzahl DA Neurone konzentrationsabhängig um bis zu 20 %. Diese Beobachtung ist neu und wurde über noch kein anderes BC berichtet. Der Effekt wurde durch die Inhibierung des DAT aufgehoben und lässt eine DAT-abhängige Aufnahme von 9-Me-BC vermuten. Die signifikante Erhöhung der Anzahl beschränkte sich nur auf DA Neurone, während sich der Gesamtanteil der Neurone nur geringfügig erhöhte und die übrigen Zellen unbeeinflusst blieben. Zusätzlich wurden ein erhöhter intrazellulärer DA-Gehalt und eine gesteigerte Aufnahme von [3H]DA um 20 % nachgewiesen. Die [3H]DA-Aufnahme und morphologische Untersuchungen zeigten funktionale und reife DA Neurone, es wurde aber auch die Theorie der Neuentstehung durch mögliche Differenzierungsprozesse untersucht. Interessanterweise wurde die Genexpression von einem breiten Spektrum neurotropher Faktoren (Shh, Wnt1, Wnt5a) und Transkriptionsfaktoren (En1, Nurr1, Pitx3), die für die Differenzierung und Entwicklung DA Neurone entscheidend sind, durch die Behandlung mit 9-Me-BC hochreguliert. Zusätzlich erhöhte sich die Expression der DA Markergene Aldh1a1, Dat und Th. Dabei war die Hochregulierung der Genexpression bei allen Faktoren bis auf Shh und Wnt1 von der Anwesenheit des BC abhängig. Ein weiterer Aspekt, der auf eine Differenzierung hindeuten könnte, war die verringerte Anzahl mitotischer BrdU-positiver Zellen. Das Erscheinen DA Neurone könnte also auf Differenzierung und Entwicklung von undifferenzierten Zellen oder Vorläuferzellen beruhen. Jedoch wäre auch eine Induktion der TH von vorher TH-negativen Zellen denkbar. Eine weitere Erklärung könnte das Vorherrschen eines dynamischen Gleichgewichts von Absterben und Neuentstehung DA Neurone innerhalb der Primärzellkultur sein und der Absterbeprozess durch protektive Effekte von 9-Me-BC unterbunden wurde. Zukünftige Experimente sollten zu einer weiteren Aufklärung, der diesem Phänomen zu Grunde liegendenen Mechanismen beitragen. Auch durch die Behandlung mit dem Harman 1,9-DiMe-BC erhöhte sich die Anzahl der DA Neurone konzentrationsabhängig, jedoch erwies sich im Vergleich zu 9-Me-BC nur eine Konzentration von 50 µM als signifikant. Innerhalb dieser Arbeit wurden auf Genexpressionsebene mit Hilfe von Microarrays und qRT-PCR mögliche neuroprotektive Effekte des Dopaminagonisten Lisurid im gleichen Zellkulturmodell untersucht. Lisurid gehört zur Substanzklasse der Ergotalkaloide und wird zur Behandlung der Parkinson-Krankheit eingesetzt. Bei Voruntersuchungen in der DA mesencephalen Primärzellkultur wies Lisurid eine protektive Wirkung für DA Neurone gegen Glutamattoxizität auf. Durch qRT-PCR konnten nur 50 % der ausgewählten Gene der Microarraydaten validiert werden. Nach 24 h Behandlung mit Lisurid wurde die Genexpression von dem Transportprotein Transthyretin (Ttr) hochreguliert, dessen erhöhte Biosynthese und Sekretion interessanterweise mit einer Verminderung der Aggregation des Amyloid-β-Proteins assoziiert wird. Die Genexpression der Aldoketoreduktase 1c20 (Ark1c20) wurde um 50 % herrunterreguliert. Die Bedeutung dieses Ergebnisses bedarf weiterer Abklärung, da eine gewebspezifische Expression bisher nur für die Leber gefunden wurde. Das Thyroidhormonrezeptorbindende Protein 3 (Thrap3), die Mitogen aktivierte Kinase Kinase Kinase 12 (Map3k12) und der G-Protein gekoppelte Rezeptor 27 (Gpr27) waren in ihrer Genexpression hochreguliert. Ein Einfluss von Lisurid auf Signaltransduktionswege konnte somit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde durch Lisurid die Expression der Transkriptionsfaktoren NeuroD1 und Tcf3 hochreguliert, die in Differenzierungsprozesse involviert sind. NeuroD1 gilt dabei als proneurales Gen und ist somit möglicherweise an Vorgängen der Neuroprotektion beteiligt. Keines der validierten differentiell exprimierten Gene des 24 h Experimentes war nach einem Behandlungszeitraum von 6 h reguliert. Die Änderungen der Genexpression nach Preinkubation mit Lisurid und anschließender Glutamatbehandlung und Behandlung mit Glutamat allein überschnitten sich weitestgehend. Demnach war vor allem die Glutamatbehandlung für die differentielle Genexpression verantwortlich. Eine zusätzliche Neusynthese von radikalfangenden Proteinen durch Preinkubation mit Lisurid konnte auf Genebene nicht gefunden werden. Es ist jedoch nicht auszuschließen, da eine Regulation auf post-transkriptioneller Ebene möglich ist.

The glycine receptor (GlyR) mediates fast inhibitory neurotransmission in the central nervous system (CNS). Although GlyR α1 subunits are widely distributed, α3 subunits are found only on spinal cord pain sensory neurons where they mediate central inflammatory pain sensitization. Thus, the α3 subunit is a potential therapeutic target for anti-inflammatory analgesia. It is yet to be understood why α3 subunits are represented in these synapses. Thus, α3 subunit-specific modulators are required both as therapeutic leads and as pharmacological probes for basic research. The Thesis, which consists of three independent studies, investigated the molecular pharmacology of three classes of compounds at GlyRs, especially those containing the α3 subunit. The dihydropyridines (DHPs), nifedipine and nicardipine, modulate native GlyRs at micromolar concentrations. Nicardipine has a biphasic potentiating and inhibitory effect, whereas nifedipine causes inhibition only. The first study investigated the molecular mechanism by which these compounds inhibit recombinant GlyRs. The rate of onset of inhibition in the open state was accelerated by pre-application of DHP in the closed state, with the degree of acceleration proportional to the concentration of pre-applied DHP. This implies a non-inhibitory binding site close to the DHP inhibitory site. DHP inhibition was use-dependent and independent of glycine concentration, consistent with a pore-blocking mode of action. DHP sensitivity was abolished by the G2’A mutation, providing a strong case for DHP binding site in the pore. Nifedipine exhibited an approximately 10-fold higher inhibitory potency at α1-containing relative to α3-containing receptors, whereas nicardipine was only weakly selective for α1-containing GlyRs. The differential sensitivities of nifedipine and nicardipine for different GlyR isoforms suggest that DHPs may be a useful resource to screen as pharmacological tools for selectively inhibiting different synaptic GlyR isoforms. To date there are few compounds known to pharmacologically discriminate between α1 and α3 subunit-containing GlyRs. The second study stemmed from an observation that β-alanine and taurine act as weak partial agonists of α3 GlyRs but as strong partial agonists at α1 GlyRs. Using chimeras of α1 and α3 subunits, we identified the relatively structurally divergent M4 transmembrane domain and C-terminal tail as a specific determinant of the efficacy difference. As mutation of individual non-conserved M4 residues had little influence on agonist efficacies, the reduced efficacy of α3 GlyRs is most likely a distributed effect of all non-conserved M4 residues. Given the lack of contact between M4 and other transmembrane domains, the efficacy differences are probably mediated by differential interactions between the respective M4 domains and the surrounding lipid environment. The strong influence of M4 primary structure on partial agonist efficacy suggests that the relatively poorly conserved α3 GlyR M4 domain may be a promising domain to target in the search for α3 GlyR-specific modulators. β-carbolines have recently been shown to inhibit glycine receptors in a subunit-specific manner. The third study screened four structurally similar β-carbolines, harmane (HM), tryptoline (TP), norharmane (NHM) and 6-methoxyharmalan (MH) at recombinantly expressed α1, α1β, α2 and α3 glycine receptors. The four compounds exhibited only weak subunit-specificity, rendering them unsuitable as pharmacological probes. Because they displayed competitive antagonist activity, we investigated the roles of known glycine binding residues in coordinating the four compounds. The structural similarity of the compounds, coupled with the differential effects of C-loop mutations (T204A, F207Y) on compound potency, implied direct interactions between variable β-carboline groups and mutated residues. Mutant cycle analysis employing HM and NHM revealed a strong pairwise interaction between the HM methyl group and the C-loop in the region T204 and F207. These results, which define the orientation of the bound β-carbolines, were supported by molecular docking simulations. The information may also be relevant to understanding the mechanism of β-carboline binding to GABAAR where they are potent pharmacological probes. The identification of compounds that specifically abolish α3 GlyR-mediated currents should provide a useful means to investigate the physiological roles of this subunit. Drugs that potently and selectively enhance α3-subtype GlyR function may potentially serve as lead compounds since α3-subtype GlyRs have emerged as a potential therapeutic target for pain treatment. Results from studies forming the Thesis have identified several structural elements that might be useful for developing novel α3 subunit-specific drugs in the future.

Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2001.