Apesar do amplo e histórico uso de produtos da biodiversidade brasileira com fins medicinais, pouco se sabe sobre o destino destes produtos após a sua absorção no organismo; quais são os produtos de metabolismo formados, sua toxicidade e cinética de eliminação. Neste trabalho foi estudado o metabolismo in vitro do diterpeno ácido caurenoico. Este terpeno está amplamente distribuído no reino vegetal tendo sua ocorrência destacada em dois dos maiores produtos fiterápicos consumidos pela população brasileira: o óleo de copaíba (Copaifera ssp.) e o xarope de guaco (Mikania glomerata e Mikania leavigata). Entre as principais reações do metabolismo em humanos, as reações de oxidação mediadas pelo citocromo P450(CIP450) têm um papel chave na detoxificação de xenobióticos. O objetivo deste trabalho foi estudar modelos biomiméticos in vitro das reações realizadas pelo CIP450 utilizando metaloporfirinas e reagentes de salen como catalisadores. Foram empregados sete catalisadores em meio homogêneo: Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTFPP) e (MnTFPP), Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTDCPP) (MnTDCPP), Cloreto de (R,R)-(-)N,N\'-bis(3,5-di-terc-butil-salicilideno)- 1,2-diaminociclo-hexil manganês III (R-Salen), Cloreto de (S,S)-(-)N,N\'-bis(3,5-di-tercbutil- salicilideno)-1,2-diaminociclo-hexil manganês III (S-Salen) e o Cloreto de 5,10,15,20- tetraquis(fenil)porfirina ferro III (FeTPP). Como doadores de oxigênio foram avaliados o iodosilbenzeno (PhIO), peróxido de hidrogênio (H2O2), terc-butil-hidroperóxido (TBHP) e (ácido 3-cloro-peroxibenzoico (MCPBA). Nos sistemas estudados foi observada a formação predominante de três produtos de oxidação: Um derivado epoxidado, um mono- e um di-hidroxilado, que tiveram sua estrutura proposta com base na análise do seu perfil de fragmentação em espectrometria de massas e comparação com dados previamente publicados na literatura. Foi observado que a natureza do oxidante influencia de forma mais pronunciada tanto a reatividade como a formação dos produtos. Foram avaliados também os catalisadores FeTFPP e o cloreto de 5,10,15,20-tetraquis-(4-N-metilpiridil)porfirina ferro III( FeTMPyP) imobilizados em suportes inorgânicos. A utilização destes catalisadores imobilizados resultou na maior reatividade do ácido caurenoico com a formação dos mesmos três produtos, mas em maior proporção em relação ao substrato. Por fim, foi realizada a catalise em meio biológico utilizando microssomas de ratos. Neste sistema foi gerado somente um produto que apresentou espectro de massas e tempo de retenção similar ao derivado di-hidroxilado obtido nas reações que utilizaram metaloporfirinas. Este trabalho trouxe evidências da rota de metabolismo de um importante produto natural, além de reforçar a capacidade de metaloporfirinas em realizar catálises biomiméticas, que serão úteis para a geração de metabólitos de fase um para estudos pré-clínicos. / In spite of the widespread and historical use of products of the Brazilian biodiversity for medical purposes, little is known about the fate of these products after their absorption into the organism; which are the products of metabolism, their toxicity and elimination kinetics. In this master thesis the in vitro metabolism of the diterpene kaurenoic acid was studied. This terpene is widely spread in the plant kingdom. Its presence can especially be highlighted in two of the most consumed phytotherapeutics by the brazilian population: the copaíba oil (Copaifera ssp.) and the guaco syrup (Mikania glomerata and Mikania leavigata. Among the principal metabolic reactions in humans, the oxidation reactions catalyzed by cytochrome P450 (CYP450) have a key role in the detoxification of xenobiotics. The objective of this thesis was the study of in vitro biomimetic models of the reactions carried out by CYP450 using metalloporphyrins and salen catalysts as analogs of the CYP450. Seven catalysts were applied in a homogeneous medium: 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTFPP) and (MnTFPP), 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTDCPP) and (MnTDCPP), (R,R)-(-)N,N-bis(3,5-di-tertbutylsalicylidene)- 1,2-diaminocyclohexyl manganese III (R-Salen) chloride, (S,S)-(-)N,Nbis( 3,5-di-terc- butylsalicylidene)-1,2-diaminocyclohexyl manganese III (S-Salen) chloride and 5,10,15,20-tetrakis(phenyl)porphyrin iron III chloride (FeTPP). As oxygen donors iodosylbenzene (PhIO), hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (TBHP) and metachlorperoxybenzoic acid (MCPBA) have been tested. In the majority of the systems the formation of three predominant oxidation products was observed: An epoxidated, a mono- and a dihydroxylated derivative, of which the chemical structure was proposed based on the analysis of the mass spectrometric fragmentation pattern. It was observed that the nature of the oxidant influences more markedly the reactivity as well as the formation of the products. The catalysts FeTFPP and 5,10,15,20-tetrakis- (4-N-methyl pyridine)porphyrin iron III chloride (FeTMPyP) immobilized with inorganic supports were assessed as well. Using these immobilized catalysts, a higher proportion of oxidation products of the kaurenoic acid was observed. Finally, the oxidation of kaurenoic acid was assessed using rat microsomes. In this system only one product was produced that showed a similar mass spectrum and retention time as the dihydroxylated derivative obtained in the reactions using metalloporphyrins.This thesis showed evidences of the route of metabolization of an important natural product, and additionally reinforces the capacity of metalloporphyrins in attaining biomimetic catalysis.

Apesar do amplo e histórico uso de produtos da biodiversidade brasileira com fins medicinais, pouco se sabe sobre o destino destes produtos após a sua absorção no organismo; quais são os produtos de metabolismo formados, sua toxicidade e cinética de eliminação. Neste trabalho foi estudado o metabolismo in vitro do diterpeno ácido caurenoico. Este terpeno está amplamente distribuído no reino vegetal tendo sua ocorrência destacada em dois dos maiores produtos fiterápicos consumidos pela população brasileira: o óleo de copaíba (Copaifera ssp.) e o xarope de guaco (Mikania glomerata e Mikania leavigata). Entre as principais reações do metabolismo em humanos, as reações de oxidação mediadas pelo citocromo P450(CIP450) têm um papel chave na detoxificação de xenobióticos. O objetivo deste trabalho foi estudar modelos biomiméticos in vitro das reações realizadas pelo CIP450 utilizando metaloporfirinas e reagentes de salen como catalisadores. Foram empregados sete catalisadores em meio homogêneo: Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTFPP) e (MnTFPP), Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTDCPP) (MnTDCPP), Cloreto de (R,R)-(-)N,N\'-bis(3,5-di-terc-butil-salicilideno)- 1,2-diaminociclo-hexil manganês III (R-Salen), Cloreto de (S,S)-(-)N,N\'-bis(3,5-di-tercbutil- salicilideno)-1,2-diaminociclo-hexil manganês III (S-Salen) e o Cloreto de 5,10,15,20- tetraquis(fenil)porfirina ferro III (FeTPP). Como doadores de oxigênio foram avaliados o iodosilbenzeno (PhIO), peróxido de hidrogênio (H2O2), terc-butil-hidroperóxido (TBHP) e (ácido 3-cloro-peroxibenzoico (MCPBA). Nos sistemas estudados foi observada a formação predominante de três produtos de oxidação: Um derivado epoxidado, um mono- e um di-hidroxilado, que tiveram sua estrutura proposta com base na análise do seu perfil de fragmentação em espectrometria de massas e comparação com dados previamente publicados na literatura. Foi observado que a natureza do oxidante influencia de forma mais pronunciada tanto a reatividade como a formação dos produtos. Foram avaliados também os catalisadores FeTFPP e o cloreto de 5,10,15,20-tetraquis-(4-N-metilpiridil)porfirina ferro III( FeTMPyP) imobilizados em suportes inorgânicos. A utilização destes catalisadores imobilizados resultou na maior reatividade do ácido caurenoico com a formação dos mesmos três produtos, mas em maior proporção em relação ao substrato. Por fim, foi realizada a catalise em meio biológico utilizando microssomas de ratos. Neste sistema foi gerado somente um produto que apresentou espectro de massas e tempo de retenção similar ao derivado di-hidroxilado obtido nas reações que utilizaram metaloporfirinas. Este trabalho trouxe evidências da rota de metabolismo de um importante produto natural, além de reforçar a capacidade de metaloporfirinas em realizar catálises biomiméticas, que serão úteis para a geração de metabólitos de fase um para estudos pré-clínicos. / In spite of the widespread and historical use of products of the Brazilian biodiversity for medical purposes, little is known about the fate of these products after their absorption into the organism; which are the products of metabolism, their toxicity and elimination kinetics. In this master thesis the in vitro metabolism of the diterpene kaurenoic acid was studied. This terpene is widely spread in the plant kingdom. Its presence can especially be highlighted in two of the most consumed phytotherapeutics by the brazilian population: the copaíba oil (Copaifera ssp.) and the guaco syrup (Mikania glomerata and Mikania leavigata. Among the principal metabolic reactions in humans, the oxidation reactions catalyzed by cytochrome P450 (CYP450) have a key role in the detoxification of xenobiotics. The objective of this thesis was the study of in vitro biomimetic models of the reactions carried out by CYP450 using metalloporphyrins and salen catalysts as analogs of the CYP450. Seven catalysts were applied in a homogeneous medium: 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTFPP) and (MnTFPP), 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTDCPP) and (MnTDCPP), (R,R)-(-)N,N-bis(3,5-di-tertbutylsalicylidene)- 1,2-diaminocyclohexyl manganese III (R-Salen) chloride, (S,S)-(-)N,Nbis( 3,5-di-terc- butylsalicylidene)-1,2-diaminocyclohexyl manganese III (S-Salen) chloride and 5,10,15,20-tetrakis(phenyl)porphyrin iron III chloride (FeTPP). As oxygen donors iodosylbenzene (PhIO), hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (TBHP) and metachlorperoxybenzoic acid (MCPBA) have been tested. In the majority of the systems the formation of three predominant oxidation products was observed: An epoxidated, a mono- and a dihydroxylated derivative, of which the chemical structure was proposed based on the analysis of the mass spectrometric fragmentation pattern. It was observed that the nature of the oxidant influences more markedly the reactivity as well as the formation of the products. The catalysts FeTFPP and 5,10,15,20-tetrakis- (4-N-methyl pyridine)porphyrin iron III chloride (FeTMPyP) immobilized with inorganic supports were assessed as well. Using these immobilized catalysts, a higher proportion of oxidation products of the kaurenoic acid was observed. Finally, the oxidation of kaurenoic acid was assessed using rat microsomes. In this system only one product was produced that showed a similar mass spectrum and retention time as the dihydroxylated derivative obtained in the reactions using metalloporphyrins.This thesis showed evidences of the route of metabolization of an important natural product, and additionally reinforces the capacity of metalloporphyrins in attaining biomimetic catalysis.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-01-05T10:18:50Z No. of bitstreams: 1 larasoaresaleixodecarvalho.pdf: 1977890 bytes, checksum: 4b904155d536789131ed158997fa2884 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2017-01-31T10:33:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 larasoaresaleixodecarvalho.pdf: 1977890 bytes, checksum: 4b904155d536789131ed158997fa2884 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T10:33:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 larasoaresaleixodecarvalho.pdf: 1977890 bytes, checksum: 4b904155d536789131ed158997fa2884 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune, crônica, progressiva, inflamatória e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC) que afeta 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo mais aceito para o estudo da patogênese da EM, devido à sua similaridade clínica e histopatológica a esta doença. Ambas apresentam processos fisiopatológicos mediados por células Th1 e Th17, com produção de citocinas próinflamatórias, como Interferon-gama (IFN-), Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Interleucina 17 (IL-17) e pelo óxido nítrico (NO), produzido principalmente por macrófagos. Atualmente, os medicamentos utilizados para a EM atuam sobre alguns desses mediadores inflamatórios, porém devido ao alto custo e efeitos adversos apresentados torna-se necessária a busca por novas terapias que sejam capazes de modular a produção destes mediadores inflamatórios. Assim, no presente trabalho, investigou-se o efeito imunomodulatório in vitro do ácido caurenoico e do partenolido sobre a produção de NO, TNF-α, IFN-, IL-17 e Interleucina 6 (IL-6) em culturas de esplenócitos de camundongos induzidos com EAE. Para isso, a EAE foi induzida em fêmeas de camundongos C57Bl/6 com MOG35-55 e após 22 dias da indução elas foram eutanasiadas para obtenção dos esplenócitos. Estas células, reestimuladas com MOG35-55 e lipopolissacarídeo (LPS), receberam as substâncias testadas em três concentrações diferentes (25, 50 e 100 µM para o ácido caurenoico, e 1, 5 e 20 µM para o partenolido). O ácido caurenoico reduziu os níveis de NO, TNF-α, IFN-, IL-6 e IL-17 nas duas maiores concentrações avaliadas. O partenolido diminuiu a produção de IL-6 nas três concentrações, de NO e IL-17 nas duas maiores concentrações e de TNF-α, IFN- somente na maior concentração avaliada. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o ácido caurenoico e o partenolido podem modular a produção dos mediadores químicos em questão, demonstrando o grande potencial destas substâncias para o desenvolvimento de novas abordagens na EAE, modelo animal da EM. / Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease, chronic, progressive, inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS) that affects 2.5 million people worldwide. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most accepted model for studying the pathogenesis of MS due to its clinical and histopathologic similarity to this disease. Both have pathophysiological processes mediated by Th1 and Th17 cells, with production of pro-inflammatory cytokines such as interferon-gamma (IFN-), Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) and interleukin 17 (IL-17) and mediated nitric oxide (NO), mainly produced by macrophages. Currently used medications for MS act on some of these inflammatory mediators, but due to the high cost and adverse effects displayed becomes necessary to search for new substances which are capable of modulating the production of these inflammatory mediators. Thus, in the present study investigated the in vitro effect immunomodulatory of the kaurenoic acid and parthenolide on the production of NO, TNF-α, IFN-, IL-17 and Interleukin 6 (IL-6) in splenocyte cultures of mice induced with EAE. For this, EAE was induced in female C57Bl/6 with MOG35-55 and animals were euthanized on the 22th day post induction for obtaining splenocytes. These cells restimulated with MOG35-55 and lipopolysaccharide (LPS) were given the substances tested at three different concentrations (25, 50 and 100 µM for kaurenoic acid and 1, 5 and 20 µM for the parthenolide). The kaurenoic acid reduced the levels of NO, TNF-α, IFN-, IL-6 and IL-17 at the two highest concentrations tested. Parthenolide was able decrease the production of IL-6 in all tested concentrations, although the NO and IL-17, was only decreased by the two highest concentration and TNF-α, IFN was decreased only the highest concentration analyzed. The results obtained in this study suggest that kaurenoic acid and parthenolide may modulate the production of inflammatory mediators, demonstrate the great potential of these substances as prototypes for the development of new approaches in EAE, an animal model of MS.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T11:08:43Z No. of bitstreams: 1 dalyaramendonçadematos.pdf: 2975621 bytes, checksum: 30567d62bd6e7554f436a9bbad1397de (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:38:38Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T11:54:12Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-24T13:01:20Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-24T13:01:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2016-09-23 / O ácido caurenoico é um diterpeno caurânico encontrado em diversas espécies vegetais tais como Mikania glomerata (guaco), Copaifera langsdorffi (copaíba) e Smallanthus sonchifolia (yacon). Essa substância apresenta ação tripanocida, larvicida, antimicrobiana, analgésica, anti-inflamatória, relaxante da musculatura lisa, hipotensora, diurética, hipoglicêmica e citotóxica. Por tratar-se de uma molécula promissora para o desenvolvimento de novos fármacos, o objetivo de nosso estudo é determinar o perfil farmacocinético e a biodisponibilidade oral do ácido caurenoico em ratos. Foram utilizados Ratos Wistar (n=6), aos quais foram administrados 50 ou 100 mg/kg de ácido caurenóico por via IV ou oral. Os animais foram canulados pela veia jugular, permitindo a administração intravenosa do ácido caurenoico e coletas seriadas de sangue do tempo zero até 10 horas. A extração do ácido caurenoico do plasma foi realizada após acidificação com ácido acético 1% (v/v), seguida de precipitação de proteínas com acetonitrila. A quantificação do analito foi realizada utilizandose cromatografia líquida de alta eficiência com detecção ultravioleta (CLAE-UV), empregando-se as seguintes condições analíticas: coluna C18 (150 x 4.6 mm, 5 μm) mantida a 40°C, eluição isocrática com fase móvel composta por acetonitrila:água acidificada com ácido ortofosfórico 0,1% (70:30 v/v), fluxo de 1 mL/min, detecção em 200 nm e volume de injeção de 80 μL. A metodologia proposta foi validada e mostrou-se precisa, exata, robusta, confiável e linear entre 0,75 e 100 μg/mL. A partir do decaimento plasmático dos animais que receberam 50 mg/kg do ácido caurenoico por via intravenosa, foram determinados os seguintes parâmetros farmacocinéticos: Cmax = 22,2 ± 1,6 mg/L, Vd = 14,5 ± 1,5 L/kg, CL = 17,7 ± 1,5 mL/min/kg, ASC = 2859 ± 278 mg/L.h e T1/2 = 9,5 ± 0.6 h. Os resultados obtidos apontaram que o ácido caurenoico, administrado por via intravenosa, apresentou um comportamento cinético linear e bicompartimental na dose testada. Não foram encontrados níveis quantificáveis da substância nas amostras provenientes de ratos tratados com 50 ou 100 mg/kg de ácido caurenoico, por via oral, impossibilitando a definição de sua biodisponibilidade oral e sugerindo uma baixa absorção por esta via. Este é o primeiro estudo farmacocinético desta molécula e, esta avaliação, mesmo que pré-clínica, pode contribuir para o processo de desenvolvimento de novos medicamentos a partir desse diterpeno. / Kaurenoic acid is a kaurane-type diterpene found in several plant species such as Mikania glomerata (guaco), Copaifera langsdorffi (copaíba) and Smallanthus sonchifolia (yacon). Previous studies described several biological activities for this substance such as antitrypanosomal, antimicrobial, analgesic, anti-inflammatory, smooth muscle relaxant, hypotensive, diuretic, hypoglycemic and cytotoxic. As this molecule represents a lead compound for the development of new drugs, the aim of our study is to determine the pharmacokinetics profile and oral bioavailability of kaurenoic acid in rats. Wistar rats (n = 6) received 50 or 100 mg/kg of kaurenoic acid by intravenous or oral routes. The insertion of a cannula into the right external jugular vein of Wistar rats allowed intravenous administration of kaurenoic acid and collection of blood samples within predetermined time intervals. Extraction procedures from plasma consisted of acidification with 1% acetic acid (v/v), followed by precipitation of proteins with acetonitrile. The supernatant was submitted to highperformance liquid chromatography with UV detection (HPLC-UV) for quantification of kaurenoic acid. The established analytical conditions were: C18 column (150 x 4.6 mm, 5 μm) maintained at 40 ° C, isocratic elution with a mobile phase consisting of acetonitrile: acidified water with 0.1% orthophosphoric acid (70:30 v/v), a flow of 1 mL/min, UV detection at 200 nm and injection volume of 80 μL. The proposed methodology proved to be precise, accurate, robust and reliable. The linearity range is between 0.75 and 100 μg/mL. Plasma decay of animals receiving an intravenously dose of 50 mg/kg allowed the determination of the following pharmacokinetic parameters: Cmax = 22.2 ± 1.6 mg/L; Vd = 14.5 ± 1.5 L/kg; CL = 17.7 ± 1.5 mL/min/kg; AUC = 2859 ± 278 mg/L.h and T1/2 = 9.5 ± 0.6 h. Kaurenoic acid administered intravenously showed a linear and two-compartment kinetic behavior at the tested dose. As no measurable levels of substance were found in the samples from mice treated orally with kaurenoic acid, the determination of oral bioavailability was not possible, suggesting poor absorption through this route. This is the first pharmacokinetic study of this molecule and this preclinical assessment can contribute to the process of development of new drugs with this diterpene.