Les changements des connections neuronales interviendraient dans la formation de la mémoire. J’ai développé de nouvelles approches basées sur l’imagerie photonique pour étudier (i) les interactions entre les microglies et les épines dendritiques, et (ii) le renouvellement des épines dans l’hippocampe in vivo. Ces deux phénomènes contribueraient au remodelage des circuits synaptiques intervenant dans la mémoire. (i) Les microglies sont impliquées dans de nouvelles fonctions en condition saine. J’ai examiné l’effet de la plasticité synaptique sur la dynamique morphologique des microglies, et sur leur interaction avec les épines. En combinant l’électrophysiologie et l’imagerie bi-photonique dans des tranches aigües de souris transgéniques, je démontre que la microglie intensifie son interaction physique avec les épines. Ainsi pour continuer l’étude de ces interactions et leur impact fonctionnel plus précisément, j’ai optimisé l’imagerie STED dans des tranches aigües. (ii) La plasticité structurale des épines est cruciale pour la mémoire, mais les connaissances à ce sujet dans l’hippocampe in vivo restent limitées. J’ai donc établi une technique d’imagerie chronique STED in vivo pour visualiser les épines dans l’hippocampe. Cette approche a révélé une densité double de celle reportée précédemment à l’aide de la microscopie bi-photonique. De plus j’ai observé un renouvellement des épines de 40% en 5 jours, représentant un taux important de remodelage synaptique dans l’hippocampe. Les approches d’imagerie super-résolutive permettent l’étude des interactions microglie-épine, et du renouvellement des épines hippocampiques avec une résolution inédite chez la souris vivante. / Activity-dependent changes in neuronal connectivity are thought to underlie learning and memory. I developed and applied novel high-resolution imaging-based approaches to study (i) microglia-spine interactions and (ii) the turnover of dendritic spines in the mouse hippocampus, which are both thought to contribute to the remodeling of synaptic circuits underlying memory formation. (i) Microglia have been implicated in a variety of novel tasks beyond their classic immune defensive roles. I examined the effect of synaptic plasticity on microglial morphological dynamics and interactions with spines, using a combination of electrophysiology and two-photon microscopy in acute brain slices. I demonstrated that microglia intensify their physical interactions with spines after the induction of hippocampal synaptic plasticity. To study these interactions and their functional impact in greater detail, I optimized and applied time-lapse STED imaging in acute brain slices. (ii) Spine structural plasticity is thought to underpin memory formation. Yet, we know very little about it in the hippocampus in vivo, which is the archetypical memory center of the mammalian brain. I established chronic in vivo STED imaging of hippocampal spines in the living mouse using a modified cranial window technique. The super-resolution approach revealed a spine density that was two times higher than reported in the two-photon literature, and a spine turnover of 40% over 5 days, indicating a high level of structural remodeling of hippocampal synaptic circuits. The developed super-resolution imaging approaches enable the examination of microglia-synapse interactions and dendritic spines with unprecedented resolution in the living brain (tissue).

Le cerveau contient environ cent milliards de cellules nerveuses, ou neurones. Ces neurones communiquent entre eux par des structures fonctionnellement distinctes – l’axone et la dendrite – capables d’émettre et recevoir des signaux électriques ou chimiques à partir d’un compartiment présynaptique vers un compartiment, dit post-synaptique. Nous avons focalisé notre étude sur les synapses des neurones hippocampiques, qu’on estime responsables de fonctions cérébrales dites supérieures, comme la mémoire et l’apprentissage. Plus particulièrement, on s’est intéressé au développement et au maintien des épines dendritiques, dont les changements morphologiques sont intimement liés à la plasticité synaptique, autrement dit, capacité de réponse à l’activité synaptique. Les épines dendritiques ont pour origine les filopodes qui évoluent en épines lors du contact axonal. La transition entre filopode et épine implique une myriade de molécules, dont des récepteurs glutamatergiques, des protéines d’échafaudage et du cytosquelette d’actine capables de recevoir, transmettre et intégrer le signal présynaptique. Cependant, la coordination spatiale et temporelle de tous ces composants moléculaires au long de la formation et maturation d’une synapse reste largement méconnue.Scribble1 (Scrib1) est une protéine de polarité cellulaire (PCP) classiquement impliquée dans l’homéostasie de tissues épithéliaux ainsi que dans la croissance et progression des tumeurs. Scrib1 est aussi une protéine d’échafaudage critique pour le développement et le bon fonctionnement du cerveau. L’objectif de cette étude a donc été d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à un rôle potentiel de Scrib1 dans la formation et le maintien des synapses. Dans un premier temps, on a décrit l’importance d’interactions dépendantes des domaines PDZ sur le trafic des récepteurs glutamatergiques ainsi que sur la voie de signalisation de plasticité synaptique sous-jacente à la mémoire spatiale. Dans un second temps, nous avons évalué les conséquences fonctionnelles d’une mutation de Scrib1 récemment identifiée chez un patient humain atteint des troubles du spectre autistique (TSA) dans la morphologie et fonction des neurones. On a démontré que Scrib1 régule l’arborisation dendritique ainsi que la formation et le maintien fonctionnel des épines dendritiques via un mécanisme dépendent du cytosquelette d’actine. Le dérèglement de ces mécanismes pourrait être à l’origine du phénotype TSA. L’ensemble de ce travail met en évidence que Scrib1, protéine d’échafaudage clé dans le développement et la fonction du cerveau, joue une multitude de rôle du niveau subcellulaire au niveau cognitif. / The brain is made up of billions of nerve cells, or neurons. Neurons communicate with each other through functionally distinct structures - the axon and the dendrite - which are able to release and receive an electrical or chemical signal from a pre- to a post-synaptic compartment, respectively. We focused our study on hippocampal neurons synapses, which ultimately underlie high-order brain functions, such as learning and memory. In particular, we studied the development and maintenance of dendritic spines, whose changes in morphology are intimately correlated with synaptic plasticity, or the ability to respond to synaptic activity. Dendritic spines originate from motile dendritic filopodia, which mature into spines following axonal contact. The filopodia-to-spine transition involves a plethora of molecular actors, including glutamate receptors, scaffold proteins and the actin cytoskeleton, able to receive, transmit and integrate the pre-synaptic signal. The spatial and temporal coordination of all these molecular components throughout the formation and maturation of a synapse remains, however, unclear. Scribble1 (Scrib1) is planar cell polarity protein (PCP) classically implicated in the homeostasis of epithelial tissues and tumour growth. In the mammalian brain, Scrib1 is a critical scaffold protein in brain development and function. The main goal of this work was, therefore, to investigate the molecular mechanisms underlying Scrib1 role in synapse formation and maintenance. In a first part, we depict the importance of Scrib1 PDZ-dependent interactions on glutamate receptors trafficking as well as bidirectional plasticity signalling pathway underying spatial memory. In a second part, we focus on the functional consequences of a recently identified autism spectrum disorder (ASD) mutation of Scrib1 on neuronal morpholgy and function. We demonstrated that Scrib1 regulates dendritic arborization as well as spine formation and functional maintenance via an actin-dependent mechanism, whose disruption might underlie the ASD phenotype. Taken altogether, this thesis highlights the PCP protein Scrib1 as key scaffold protein in brain development and function, playing a plethora of roles from the subcelular to the cognitive level.

Les protéines d’adhésions homophiles N-cadhérine jouent un rôle majeur dans le développement du cerveau, notamment en agissant sur la croissance et la plasticité synaptique. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la N-cadhérine dans ces deux processus en utilisant des neurones issus de cultures primaires déposés sur des substrats micropatternés. Ces substrats sont recouverts de N-cadhérine purifiée afin d’induire des adhésions N-cadhérines sélectives au niveau de micro-motifs régulièrement espacés. Mes deux premières études sont basées sur le modèle d’embrayage moléculaire, décrivant le processus par lequel la motilité du cytosquelette d’actine se couple aux adhésions au niveau de la membrane cellulaire afin de générer des forces de traction aux zones de contact avec le substrat, permettant ainsi l’avancée cellulaire (Giannone et al., 2009). Plusieurs études ont mis en avant l’existence d’un tel modèle (Mitchison et Kirschner, 1988 ; Suter et Forscher, 1998), cependant le mécanisme exact permettant d’expliquer ce couplage mécanique de l’actine aux protéines d’adhésions reste mal connu. Via des techniques de pinces optiques, des travaux précédemment menés dans l’équipe ont prouvé l’existence d’un couplage entre le flux d’actine et les adhésions N-cadhérine permettant la migration du cône de croissance (Bard et al., 2008). Cette technique n’a cependant pas permis la visualisation directe de l’engagement d’un tel mécanisme. Nous avons donc couplé l’utilisation des substrats micro-patternés à la microscopie haute résolution sptPALM/TIRF afin de visualiser directement la dynamique des protéines impliquées dans l’embrayage moléculaire. Dans le premier article, j’ai montré pour la première fois l’existence d’interactions transitoires entre le flux d’actine et les adhésions N-cadhérines au niveau du cône de croissance, reflétant un embrayage glissant à l’échelle de la molécule unique (Garcia et al., en préparation). Dans le second article, en travaillant sur des neurones plus matures, nous avons pu montrer l’engagement d’un embrayage moléculaire trans-synaptique entre adhésions N-cadhérines et flux d’actine permettant la stabilisation du filopode dendritique et ainsi sa transition en épine mature (Chazeau/Garcia et al., en préparation). J’ai également participé à une troisième étude dans laquelle j’ai observé l’effet des substrats micropatternés recouverts de N-cadhérine, sur la synaptogenèse. J’ai ainsi pu prouver que la N-cadhérine déposée sur les micro-motifs, stimule la croissance dendritique et axonale et joue un rôle prépondérant dans la maturation morphologique des neurones. Cependant, la N-cadhérine est incapable d’induire la formation de synapses contrairement aux protéines d’adhésion neurexine/neuroligine ou SynCam (Czöndör et al., 2013). / The homophilic adhesion molecule N-cadherin plays major roles in brain development, notably affecting axon outgrowth and synaptic plasticity. During my PhD work, I addressed the role of N-cadherin in these two processes, using primary neurons cultured on micro-patterned substrates. These substrates are coated with purified N-cadherin to trigger selective N-cadherin adhesions in a spatially controled manner. My two first studies are based on the “molecular clutch” paradigm, by which the actin motile machinery is coupled to adhesion at the cell membrane to generate forces on the substrate and allow cells to move forward (Giannone et al., 2009). Many publications have provided evidence for such a mechanism (Mitchison et Kirschner, 1988 ; Suter et Forscher, 1998), but the exact mechanisms underlying the molecular coupling between the actin retrograde flow and adhesion proteins remain elusive. The team previously inferred, using optical tweezers, that a molecular clutch between the actin flow and N-cadherin adhesions drives growth cone migration (Bard et al., 2008), but could not achieve a direct visualization of the engagement process with this technique. Here, we combined the use of micropattern substrates with high resolution microscopy sptPALM/TIRF to visualize directly the dynamics of the main proteins involved in the molecular clutch. In my first paper, I reveal for the first time transient interactions between the actin flow and N-cadherin adhesions in growth cones, reflecting a slipping clutch process at the individual molecular level (Garcia et al., in preparation). In a second study, working with more mature neurons, we revealed that engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the actin flow underlies the stabilization of dendritic filopodia into mature spines (Chazeau/Garcia et al., in preparation). I also participated to a third study, where I observed the effect of N-cadherin coated substrates on synaptogenesis. I showed that, although N-cadherin on micro-patterned substrates stimulated axonal and dendritic elongation and played a major role in morphological maturation, it was not able to induce synapse formation like neurexin/neuroligin or SynCAM adhesions (Czöndör et al., 2013).