La recrudescence des infections respiratoires impliquant des facteurs virulents d’origine bactérienne est devenue un problème majeur de santé publique. Mieux caractériser la réponse des cellules respiratoires dans la phase initiale d’exposition à des toxines bactériennes est important sur les plans physiopathologiques et thérapeutiques. Le but de ce travail est de décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués lors de l’exposition des cellules épithéliales respiratoires à l’adénylate cyclase (CyaA), une toxine produite par Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche. CyaA a été choisie car elle dispose de multiples moyens qui lui permettent d’envahir un grand nombre de cellules eucaryotes. Elle est notamment capable de transloquer son domaine catalytique directement dans la cellule cible puis d’utiliser la calmoduline endogène pour augmenter le taux d’AMPc à des niveaux supraphysiologiques. Cependant l’effet de ces changements sur la signalisation mécano-chimique (mécanotransduction) a été très peu décrit alors qu’elle affecte les fonctions et l’intégrité cellulaires. Nous proposons donc d’évaluer les fonctions cellulaires et les propriétés mécaniques et d’adhésion des cellules épithéliales respiratoires exposées à CyaA dans le but de déceler des modifications fondamentales dans les processus de mécanotransduction.Nous avons tout d’abord mené une étude préliminaire visant à définir les concentrations physiopathologiques de CyaA utilisées dans nos expériences. Nous avons ainsi déterminé le degré de viabilité cellulaire en fonction de 3 concentrations de CyaA (0.5 ; 5 ; 10 nM), ce qui a montré que la concentration 0.5 nM n’affectait pas la viabilité cellulaire tout en induisant des niveaux supraphysiologiques d’AMPc en moins d’une heure.Nous avons ensuite cherché à évaluer les effets de CyaA sur la migration et la réparation cellulaires, le battement ciliaire et la perméabilité cellulaire de cellules épithéliales représentatives des différents niveaux de l’arbre aérien. CyaA induit une diminution de la migration et de la réparation cellulaires, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité cellulaire traduisant un affaiblissement des jonctions latérales.Une étude en immunoflorescence a ensuite été conduite sur les structures intracellulaires et interfaciales des cellules épithéliales alvéolaires exposées aux 3 concentrations de CyaA. Cette étude a montré que CyaA est capable d’induire un remodelage du cytosquelette d’actine ainsi qu’une diminution du nombre des adhérences focales. Enfin, une analyse complète des propriétés mécaniques et des paramètres d’adhésion a été conduite sur les mêmes cellules au moyen de 2 techniques de micro/nanomanipulation revisitées pour permettre à la fois l’évaluation des liens multiples et de la rigidité cellulaire (Microscopie à Force Atomique (AFM) avec indentation et Magnétocytométrie (MTC)). Pour évaluer le rôle de l’AMPc sur les changements observés, les cellules épithéliales respiratoires ont été testées avec la forme active de CyaA et la forme enzymatiquement inactive de la toxine : CyaAE5, qui ne permet pas de synthétiser l’AMPc.Les expériences AFM ont révélé que le principal effet de CyaA est de diminuer le nombre de liens intégrine-ligand associés (une altération du clustering) alors qu’à la plus faible concentration de CyaA, nous observons une augmentation de la rigidité cellulaire, accompagnée d’un renforcement des liens individuels, évolutions confirmées par les résultats MTC. CyaAE5 ne parvient pas à produire ces mêmes effets.L’ensemble des résultats suggère que CyaA affecte de façon précoce la mécanotransduction des cellules exposées et ceci en cohérence avec les effets attendus de l’augmentation d’AMPc (remodelage du CSQ, altération des jonctions latérales, inhibition de l’expression de Rac1), ce qui apporte une nouvelle vision de la cytotoxicité induite par l’adénylate cyclase. / The increase in respiratory infections involving virulent factors of bacterial origin has become a major public health issue. A better knowledge of the cell respiratory response in the course of the initial cell invasion by bacterial toxins is important from the pathophysiological and therapeutical point of views.The purpose of this work is to decipher the cellular and molecular mechanisms involved in the exposition of respiratory epithelial cells to the adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by Bordetella pertussis which is the whooping cough agent. We have chosen this toxin for its multiple capacities of penetrating a wide range of eukaryotic cells. Indeed, this toxin enables direct translocation of its catalytic domain across the plasma membrane of target cells using the endogen calmoduline to increase the cAMP rate at supraphysiological levels. However, the effects of these changes on mechano-chemical signaling (mechanotransduction) pathways remain largely unknown while it affects cellular functions and cell integrity. So, we perform an evaluation of cellular functions as well as mechanical and adhesion properties of respiratory epithelial cells exposed to CyaA toxin in order to detect some critical modifications in the mechanotransduction processes.In a preliminary study aiming at defining physiopathological concentrations of CyaA toxin used in our experiments, we determined the cell viability degree for 3 concentrations of CyaA toxin (0.5; 5 and 10 nM). We found that the smallest concentration (0.5 nM) did not affect cell viability whereas inducing supraphysiological cAMP levels in less than one hour.Then, we assessed the effects of CyaA toxin on cell migration and repair phenomenon, on ciliary beating and on cell permeability of epithelial cells representative of the different levels of the respiratory tract. The toxin induces a decrease in cell migration and repair, an increase in cell permeability suggesting a weakening of lateral cell-cell junctions.Immunostaining was performed on intracellular and interfacial structures of alveolar epithelial cells exposed to the 3 concentrations of CyaA toxin. Results show that CyaA toxin is able to induce cytoskeleton remodeling and a decrease in the number of focal adhesions. Finally, a refined analysis of mechanical properties and adhesion parameters was performed on the same cells by 2 techniques of micro/nanomanipulation modified to permit at the same time, an evaluation of cell adhesion and cell rigidity (Atomic Force Microscopy with indentation and force spectroscopy to characterize the number of bond during adhesion reinforcement and multiscale Magnetic Twisting Cytometry). To evaluate the role of cAMP on cellular and molecular changes, we tested the enzymatically inactive form of CyaA toxin called CyaAE5 which could not permit to increase the intracellular cAMP rate.The AFM experiments have revealed that the main effect of CyaA toxin is to decrease the number of associated integrin-ligand bounds (meaning an alteration of clustering) while, at the smallest concentration of CyaA toxin, we observe an increase in cell rigidity with an individual bound reinforcement, a result consistent with MTC results. Nevertheless, CyaE5 does not exhibit such cellular effects. On the whole, these results suggest that CyaA toxin affects the mechanotransduction pathways of cells exposed to the toxin, a result which is in agreement with the expected effects of cAMP increase (notably cytoskeleton remodeling, lateral junction alteration and inhibition of Rac1 expression) what brings a new vision of the cytotoxicity induced by the adenylate cyclase toxin.

Le transport de Na+ par ENaC et de Cl- par CFTR, dans l’épithélium des voies aériennes (VA), contrôle la clairance mucociliaire en modulant le volume du liquide de surface (ASL). L’expression et la fonction de ces canaux peuvent être modifiées au cours des maladies inflammatoires chroniques des VA. Dans un modèle de culture primaire de cellules épithéliales nasales humaines (CENH), nous avons démontré l’existence, au cours de la polypose nasosinusienne, d’une chute de la sécrétion de Cl- par CFTR dont l’expression est diminuée par le TGFß1, cytokine de l’inflammation. Nous avons ensuite étudié l’effet de l’élastase, et de son inhibiteur l’EPIhNE4 sur la fonction d’ENaC dans des CENH de patients atteints ou non de mucoviscidose (CF) où l’hyperactivité d’ENaC provoque une déshydratation de l’ASL. Nous avons démontré l’existence d’une activité sérine protéase endogène dans les CENH (patients CF ou non CF) qui, après inhibition, permet de révéler une augmentation de la fonction d’ENaC induite par l’élastase alors inhibable par l’EPI-hNE4. Enfin, nous avons analysé l’effet du 4 phenylbutyrate (4PBA), traitement proposé chez les patients CF, sur le canal ENaC. Le 4- PBA entraîne une augmentation de la fonction d’ENaC dans les CENH de patients CF ou non en adressant des sous-unités du canal à la membrane apicale via la régulation d’une molécule chaperone Hsc70. Le 4-PBA pourrait donc être utilisé dans des pathologies respiratoires avec défaut d’expression d’ENaC mais son usage pourrait être délétère chez les patients CF. La régulation des transports ioniques au cours des maladies inflammatoires chroniques des VA représente donc une cible thérapeutique intéressante / Na+ and Cl- transport by ENaC and CFTR respectively in airway epithelium (AE) control mucociliary clearance by regulating the airway surface liquid (ASL). Ion channel expression and function could be altered by chronic inflammation in AE. In primary cultures from human nasal epithelial cells (HNEC) we demonstrated, in nasal polyposis, a decrease of CFTR expression and Cl- secretion induced by TGFß1, an inflammatory cytokine. We also evaluated the effects of elastase, and its inhibitor EPI-hNE4, on ENaC function in HNEC from cystic fibrosis (CF where ENaC hyperactivity contributes to ASL dehydration) and non CF patients. We detected an endogenous serine protease activity in HNEC (CF or non CF) which, after inhibition, unmask an increase in ENaC function induced by elastase, this increase being then inhibited by EPI-hNE4. Finally, we investigated the effects of a drug now tested in CF patients treatment, the 4-phenylbutyrate (4PBA). 4-PBA promoted ENaC cell surface expression and activity in CF or non CF HNEC by increasing ENaC subunits translocation to plasma membrane via the regulation of Heat Shock Protein 70. 4-PBA treatment could therefore be of interest in the treatment of airway diseases when ENaC trafficking is disrupted but should be used with caution when treating CF patients where ENaC function is already upregulated. All together these results highlight the role of ion transport regulation during chronic inflammatory airway diseases and could lead to new therapeutic strategies

Chez les vertébrés, le battement coordonné des cils motiles présents par centaines à la surface apicale des cellules multiciliées (MCC) est requis pour propulser directionnellement les fluides biologiques à l'intérieur de certains organes (voies respiratoires, ventricules cérébraux, trompes utérines ou certaines structures embryonnaires). De nombreuses pathologies humaines sont associées à des défauts ciliaires ou à une perte des MCC (dyskinésies ciliaires, mucoviscidose, asthme,...). Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à élucider les mécanismes complexes contrôlant la différenciation des MCC et donc la formation des cils motiles (multiciliogenèse). Par des approches de génomiques fonctionnelles à partir de deux modèles d'épithéliums multiciliés évolutivement éloignés (épithélium respiratoire humain et épiderme d'embryon de Xénope) nous avons identifié la famille des microARN (petits ARN non-codants régulateurs de l'expression génique) miR-449 comme majoritairement exprimée dans les MCC. Nous avons montré que miR-449 contrôle la multiciliogenèse i) en bloquant le cycle cellulaire, ii) en réprimant directement la voie de signalisation Notch et iii) en inhibant l'expression de la petite GTPase R-Ras. Enfin, nos travaux montrent que l'ensemble de ces mécanismes est conservé chez les vertébrés. En conclusion, miR-449 est un nouveau régulateur clé de la multiciliogenèse conservé au cours de l'évolution. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des petits ARN régulateurs dans le traitement de certaines pathologies associées à des défauts ciliaires.

Objectifs : Ce travail a pour but de développer un larynx artificiel composé de 2 structures : 1) une structure inamovible en titane poreux prolongeant la trachée; 2) une double valve remplissant la fonction de sphincter. Matériels et Méthodes : L’intégration de la prothèse en remplacement trachéal a été testée in vitro et in vivo sur les modèles animaux rats, lapins et brebis. Suite à l’ensemble de ces résultats, nous avons réalisé la première application clinique du larynx artificiel. Résultats : 1) L’ajout d’un tube de silicone endoprothétique améliore la survie chez le gros animal; 2) l’intégration tissulaire de la prothèse de trachée associée à un matériel polymérique biodégradable était supérieure à celle des prothèses en titane poreux nu; 3) la vitesse de colonisation des prothèses en titane poreux était accélérée lorsque l’on diminuait la taille des billes. Un premier patient a été implanté avec une prothèse de larynx artificiel avec des résultats satisfaisants à 9 mois. Conclusions : Nos études concernant l’intégration de prothèses de trachées in vitro et in vivo ont permis de contribuer à l’aboutissement de la première application clinique de larynx artificiel. / Background: The aim of this work is the design of an artificial larynx made of 2 elements: 1) a non-removable bio-integrable structure designed to provide a connection with the remaining trachea; 2) a double valve that fulfills the sphincter function. Materials and Methods: In vitro and in vivo tests (rat, rabbit and sheep model) were performed to achieve the tracheal prosthesis integration. Following all these results, we carried out the first clinical application of an artificial larynx. Results: i) The long-term survival of the animals was improved when an endoprosthetic silicon calibration tube was used; ii) tissue integration of the prostheses in porous titanium filled with biodegradable polymer was better than the bare porous titanium; iii) prosthesis integration was improved when pore size was decreased. A first patient was implanted with an artificial functional larynx with satisfactory results after 9 months of implantation. Conclusion: The whole in vivo and in vitro studies concerning the integration of the tracheal prosthesis has contributed to the success of the first clinical application of the artificial larynx.

Objectifs : Ce travail a pour but de développer un larynx artificiel composé de 2 structures : 1) une structure inamovible en titane poreux prolongeant la trachée; 2) une double valve remplissant la fonction de sphincter. Matériels et Méthodes : L'intégration de la prothèse en remplacement trachéal a été testée in vitro et in vivo sur les modèles animaux rats, lapins et brebis. Suite à l'ensemble de ces résultats, nous avons réalisé la première application clinique du larynx artificiel. Résultats : 1) L'ajout d'un tube de silicone endoprothétique améliore la survie chez le gros animal; 2) l'intégration tissulaire de la prothèse de trachée associée à un matériel polymérique biodégradable était supérieure à celle des prothèses en titane poreux nu; 3) la vitesse de colonisation des prothèses en titane poreux était accélérée lorsque l'on diminuait la taille des billes. Un premier patient a été implanté avec une prothèse de larynx artificiel avec des résultats satisfaisants à 9 mois. Conclusions : Nos études concernant l'intégration de prothèses de trachées in vitro et in vivo ont permis de contribuer à l'aboutissement de la première application clinique de larynx artificiel.

Chez les vertébrés, le battement coordonné des cils motiles présents par centaines à la surface apicale des cellules multiciliées (MCC) est requis pour propulser directionnellement les fluides biologiques à l’intérieur de certains organes (voies respiratoires, ventricules cérébraux, trompes utérines ou certaines structures embryonnaires). De nombreuses pathologies humaines sont associées à des défauts ciliaires ou à une perte des MCC (dyskinésies ciliaires, mucoviscidose, asthme,...). Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à élucider les mécanismes complexes contrôlant la différenciation des MCC et donc la formation des cils motiles (multiciliogenèse). Par des approches de génomiques fonctionnelles à partir de deux modèles d’épithéliums multiciliés évolutivement éloignés (épithélium respiratoire humain et épiderme d’embryon de Xénope) nous avons identifié la famille des microARN (petits ARN non-codants régulateurs de l’expression génique) miR-449 comme majoritairement exprimée dans les MCC. Nous avons montré que miR-449 contrôle la multiciliogenèse i) en bloquant le cycle cellulaire, ii) en réprimant directement la voie de signalisation Notch et iii) en inhibant l’expression de la petite GTPase R-Ras. Enfin, nos travaux montrent que l’ensemble de ces mécanismes est conservé chez les vertébrés. En conclusion, miR-449 est un nouveau régulateur clé de la multiciliogenèse conservé au cours de l’évolution. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des petits ARN régulateurs dans le traitement de certaines pathologies associées à des défauts ciliaires. / In vertebrates, the coordinated beating of hundreds of motile cilia present at the apical surface of multiciliated cells (MCC) is required for propel directionally flow of biological fluids inside some organs (airways, cerebral ventricles, fallopian tubes or some embryonic structures). Many human diseases are associated with ciliary defects or loss of MCC (ciliary dyskinesia, cystic fibrosis, asthma ...). In this context, my thesis has sought to elucidate the complex mechanisms that control the differentiation of MCC and thus the formation of motile cilia (multiciliogenesis). By functional genomic approaches from two evolutionarily distant models of multiciliated epithelia (human respiratory epithelium and epidermis of Xenopus embryo) we identified the miR-449 family of microRNAs (small non-coding RNAs regulating gene expression) as mainly expressed in MCC. Then, we showed that miR-449 controlled multiciliogenesis by i) blocking the cell cycle ii) directly suppressing the Notch pathway and iii) by inhibiting the expression of the small GTPase R-Ras. Finally, we have demonstrated that all these mechanisms were conserved in vertebrates. In conclusion, miR-449 is a new key and conserved regulator of multiciliogenesis. Our findings could pave the way for new therapeutic strategies using small regulatory RNAs in the treatment of several diseases associated with ciliary defects.