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Succès plasmidique : transmission inter-espèce d'un plasmide portant un gène de métallo-bêta-lactamase / Success of a plasmid : interspecies transfer of a plasmid carrying a metallo-b-lactamase-encoding geneDrieux, Laurence 30 May 2012 (has links)
Les métallo-b-lactamases (MBL) acquises constituent une menace sanitaire par risqué d’impasse thérapeutique dans les infections causées par les bacilles à Gram négatif, en particulier lorsque ces bactéries produisent une b-lactamase à spectre étendu (BLSE). La MBL VIM-1 est une carbapénémase qui hydrolyse toutes les β-lactamines, à l’exception des monobactames. Cette enzyme a émergé en Grèce où elle est désormais endémique chez les entérobactéries. Six souches de bacilles à Gram négatif produisant une carbapénémase ont été isolées chez un même patient qui avait été rapatrié de Grèce. Trois de ces souches, Providencia stuartii (Ps), Proteus mirabilis (Pm) et Escherichia coli (Ec), produisaient la MBL VIM-1 et la BLSE SHV-5. Dans chacune de ces trois souches, les gènes blaVIM-1 et blaSHV-5 étaient portés par un plasmide transférable par conjugaison in vitro. Les plasmides extraits des transconjugants présentaient le même profil de restriction et portaient un intégron de classe 1 identique dans lequel le gène blaVIM-1 était intégré. Nous avons émis l’hypothèse qu’un plasmide codant pour VIM-1 et SHV-5 avait été transféré de la souche Ps vers les souches Pm et Ec dans le tube digestif du patient et avons reproduit ce transfert in vivo dans un modèle de souris gnotoxéniques. Au cours de cette expérience, le plasmide codant pour VIM-1 et SHV-5 a été transféré avec succès de la souche Ps vers la souche réceptrice E. coli J53, en dehors de toute pression de sélection par les antibiotiques. Nous avons ensuite analysé la séquence complète du plasmide pTC2 extrait d’un transconjugant obtenu par conjugaion in vivo. Ce plasmide de type co-intégrat (IncA/C, IncR) de 180kb possédait un squelette de type IncA/C et une région de multirésistance (MDR1) au sein de laquelle était intégré un fragment de type IncR de 13kb. L’analyse de cette séquence nous a permis d’identifier un système de transfert de type IncA/C complet et intact et différents types de systèmes de maintien, à la fois au sein du squelette IncA/C et au sein du fragment IncR. La région mosaïque MDR1 contenait neuf séquences d’insertion (sept copies de l’IS26, une IS1 et une IS6100), 10 gènes de résistance aux antibiotiques et l’opéron mer de résistance au mercure qui étaient intégrés dans des transposons unitaires, des transposons composites ou des intégrons. Le plasmide pTC2 cumule des propriétés qui font de lui un véhicule performant de la résistance aux antibiotiques : un large spectre d’hôte, de bonnes capacités de transfert, de bonnes capacités de maintien dans une population bactérienne, une grande plasticité de sa région MDR1 et une grande variété de gènes de résistance. / Acquired metallo-b-lactamases (MBLs) represent a threat for the treatment of infections caused by Gram-negative bacteria, particularly by enterobacteria that already produce extended-spectrum b-lactamases (ESBL). VIM-1 MBL, which is a carbapenemase that can hydrolyze all classes of β-lactam antibiotics except monobactams, has emerged in Greece and is now commonly found in Enterobacteriaeae. Six carbapenemase-producing strains of Gram-negative bacilli were isolated from a unique patient transferred from Greece to a French hospital. Three of these strains, Providencia stuartii (Ps), Proteus mirabilis (Pm) and Escherichia coli (Ec) strains, were shown to produce the MBL VIM-1 and the ESBL SHV-5. In each of these three strains, the blaVIM-1 gene was carried by a plasmid transferable by in vitro conjugation. The plasmids extracted from the transconjugants displayed a unique restriction profile and harboured identical VIM-1-containing class 1 integrons. Considering the hypothesis that this VIM-1 plasmid had probably been transferred from the Ps strain to the Ec and Pm strains, we performed in vivo conjugation assays in the digestive tract of gnotobiotic mice colonized with E. coli J53, to demonstrate that the VIM-1 plasmid harboured by strain Ps was transferable in vivo, in absence of antibiotic pressure. We determined the complete nucleotide sequence of the VIM-1-encoding plasmid pTC2, which was isolated in a Greek Providencia stuartii multiresistant strain. This 180-kb plasmid was found to be a multireplicon plasmid (IncA/C, IncR), with a large IncA/C backbone and a mosaic multidrug resistance (MDR1) region, in which was inserted a 13-kb IncR fragment. A CD-search-based annotation of the plasmid allowed the identification of a complete IncA/C-type transfer system and of several putative maintenance modules, either on the IncA/C backbone, and on the IncR fragment. The complex MDR1 region contained nine insertion sequences (seven copies of the IS26, one IS1 and one IS6100), 10 resistance genes and a mercury resistance operon integrated either into unit transposons, composite transposons or integrons. The broad-host range, the transfer capacities, the stability, the high plasticity of the MDR1 region combined to the variety of resistance genes make pTC2 a superspreader of resistance determinants.
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Eléments génétiques mobiles et évolution génomique chez les Archées Thermococcales / Mobile genetic elements and genome evolution in the Archaea ThermococcalesBadel, Catherine 02 July 2019 (has links)
Les réarrangements permettent une évolution rapide du génome par l’acquisition de séquences codantes exogènes, la perte de fonctions non-essentielles ou la création de nouvelles organisations génomiques. Différents mécanismes de réarrangements impliquant des éléments génétiques mobiles (EGM) ont été identifiés chez les archées, les bactéries et les eucaryotes. En revanche, on ignore l’origine des nombreuses inversions génomiques détectées pour les espèces du genre archéen Thermococcus. Mes travaux de thèse visent à améliorer la compréhension de l’évolution génomique chez les Thermococcales à travers l’étude de deux familles d’EGM : les familles de plasmides pTN3 et pT26-2. Plus précisément, je me suis intéressée aux recombinases à tyrosine (ou intégrases) que ces plasmides encodent et qui permettent leur intégration dans le chromosome de l’hôte. J’ai montré que l’intégrase plasmidique Intᵖᵀᴺ³ est responsable d’inversions dans le chromosome de son hôte Thermococcus nautili grâce à une activité catalytique inédite de recombinaison homologue. J’ai par la suite caractérisé deux autres intégrases de Thermococcales reliés phylogénétiquement à Intᵖᵀᴺ³ dont seulement une présente une activité de recombinaison homologue. La comparaison de leurs séquences primaires et la résolution de la structure de Intᵖᵀᴺ³ vont maintenant éclairer les déterminants génétiques responsables de la spécificité de site et de l’activité de recombinaison homologue. Les trois intégrases appartiennent à une classe de recombinases spécifique des archées qui catalyse une intégration suicidaire. Lors de l’intégration, le gène de l’intégrase est fragmenté et probablement désactivé. L’EGM intégré se retrouve piégé dans le chromosome. Les avantages évolutifs d’une telle activité suicidaire restent pour l’instant mystérieux. J’ai identifié 62 intégrases hyperthermophiles suicidaires et reconstruit leur histoire évolutive. Ces intégrases sont très prévalentes et recrutées par différents EGM. De plus, j’ai montré que l’une de ces intégrases présente in vitro une activité de recombinaison site-spécifique à des températures proches de l’ébullition de l’eau, représentant un avantage dans les environnements hyperthermophiles. / Genomes rapidly evolve through rearrangements that can generate new genome organizations or lead to the acquisition of foreign coding sequences or the loss of non-essential functions. Several mechanisms of rearrangement were uncovered for Archaea, Bacteria and Eukaryotes that involve mobile genetic elements (MGE). Species from the archaeal genera Thermococcus present numerous genomic inversions but none of the previously known inversion drivers. To better understand the genomic evolution of Thermococcales, I investigated two of their MGE families: the pTN3 and pT26-2 plasmid families. Specifically, I focused on the tyrosine recombinases (or integrase) that these plasmids encode and that catalyze their site-specific integration in the host chromosome. I demonstrated that the plasmidic integrase Intᵖᵀᴺ³ is responsible for chromosomal inversions in the host Thermococcus nautili through an unprecedented homologous recombination catalytic activity. I also characterized two other related Thermococcus integrases and only one catalyzes homologous recombination. The structure resolution of Intᵖᵀᴺ³ and primary sequence comparisons will now provide clues about the genetic determinants of site specificity and of the homologous recombination activity. The three integrases all belong to an archaeal-specific class of integrases that catalyzes a suicidal integration. The integrase gene is partitioned and presumably inactivated upon integration. The integrated MGE is then trapped into the chromosome. The evolutionary benefits of this suicide activity are puzzling. I identified 62 related suicidal hyperthermophilic integrases and reconstructed their evolutionary history. They are highly prevalent and recruited by diverse MGE. I also showed that one of these integrases can catalyze in vitro site-specific recombination at near boiling water temperature, representing an advantage in hyperthermophilic environments.
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Comparative mitochondrial genomics toward understanding genetics and evolution of arbuscular mycorrhizal fungiNadimi, Maryam 03 1900 (has links)
Les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) sont très répandus dans le sol où ils forment des associations symbiotiques avec la majorité des plantes appelées mycorhizes arbusculaires. Le développement des CMA dépend fortement de la plante hôte, de telle sorte qu'ils ne peuvent vivre à l'état saprotrophique, par conséquent ils sont considérés comme des biotrophes obligatoires. Les CMA forment une lignée évolutive basale des champignons et ils appartiennent au phylum Glomeromycota. Leurs mycélia sont formés d’un réseau d’hyphes cénocytiques dans lesquelles les noyaux et les organites cellulaires peuvent se déplacer librement d’un compartiment à l’autre. Les CMA permettent à la plante hôte de bénéficier d'une meilleure nutrition minérale, grâce au réseau d'hyphes extraradiculaires, qui s'étend au-delà de la zone du
sol explorée par les racines. Ces hyphes possèdent une grande capacité d'absorption d’éléments nutritifs qui vont être transportés par ceux-ci jusqu’aux racines. De ce fait, les CMA améliorent la croissance des plantes tout en les protégeant des stresses biotiques et abiotiques. Malgré l’importance des CMA, leurs génétique et évolution demeurent peu connues. Leurs études sont ardues à cause de leur mode de vie qui empêche leur culture en absence des plantes hôtes. En plus leur diversité génétique intra-isolat des génomes nucléaires, complique d’avantage ces études, en particulier le développement des marqueurs moléculaires pour des études biologiques, écologiques ainsi que les fonctions des CMA. C’est pour ces raisons que les génomes mitochondriaux offrent des opportunités et alternatives intéressantes pour étudier les CMA. En effet, les génomes mitochondriaux (mt) publiés à date, ne montrent pas de polymorphismes génétique intra-isolats. Cependant, des exceptions peuvent exister. Pour aller de l’avant avec la
génomique mitochondriale, nous avons besoin de générer beaucoup de données de séquençages de l’ADN mitochondrial (ADNmt) afin d’étudier les méchanismes évolutifs, la génétique des population, l’écologie des communautés et la fonction des CMA. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de doctorat consiste à: 1) étudier l’évolution des génomes mt en utilisant l’approche de la génomique comparative au niveau des espèces proches, des isolats ainsi que des espèces phylogénétiquement éloignées chez les CMA; 2) étudier l’hérédité génétique des génomes mt au sein des isolats de l’espèce modèle Rhizophagus irregularis par le biais des anastomoses ; 3) étudier l’organisation des ADNmt et les gènes mt pour le développement des marqueurs moléculaires pour des études phylogénétiques. Nous avons utilisé l’approche dite ‘whole genome shotgun’ en pyroséquençage 454 et Illumina HiSeq pour séquencer plusieurs taxons de CMA sélectionnés selon leur importance et leur disponibilité. Les assemblages de novo, le séquençage conventionnel Sanger, l’annotation et la génomique comparative ont été réalisés pour caractériser des ADNmt complets. Nous avons découvert plusieurs mécanismes évolutifs intéressant chez l’espèce Gigaspora rosea dans laquelle le génome mt est complètement remanié en comparaison avec Rhizophagus irregularis isolat DAOM 197198. En plus nous avons mis en évidence que deux gènes cox1 et rns sont fragmentés en deux morceaux. Nous avons démontré que les ARN transcrits les deux fragments de cox1 se relient entre eux par épissage en trans ‘Trans-splicing’ à l’aide de l’ARN du gene nad5 I3 qui met ensemble les deux ARN cox1.1 et cox1.2 en formant un ARN complet et fonctionnel. Nous avons aussi trouvé une organisation de l’ADNmt très particulière chez l’espèce Rhizophagus sp. Isolat DAOM 213198 dont le génome mt est constitué par deux chromosomes circulaires. En plus nous avons trouvé une quantité considérable des séquences apparentées aux plasmides ‘plasmid-related sequences’ chez les Glomeraceae par rapport aux Gigasporaceae, contribuant ainsi à une évolution rapide des ADNmt chez les Glomeromycota. Nous avons aussi séquencé plusieurs isolats de l’espèces R. irregularis et Rhizophagus sp. pour décortiquer leur position phylogénéque et inférer des relations évolutives entre celles-ci. La comparaison génomique mt nous montré l’existence de plusieurs éléments mobiles comme : des cadres de lecture ‘open reading frames (mORFs)’, des séquences courtes inversées ‘short inverted repeats (SIRs)’, et des séquences apparentées aux plasimdes ‘plasmid-related sequences (dpo)’ qui impactent l’ordre des gènes mt et permettent le remaniement chromosomiques des ADNmt. Tous ces divers mécanismes évolutifs observés au niveau des isolats, nous permettent de développer des marqueurs moléculaires spécifiques à chaque isolat ou espèce de CMA. Les données générées dans mon projet de doctorat ont permis d’avancer les connaissances fondamentales des génomes mitochondriaux non seulement chez les Glomeromycètes, mais aussi de chez le règne des Fungi et les eucaryotes en général. Les trousses moléculaires développées dans ce projet peuvent servir à des études de la génétique des populations, des échanges génétiques et l’écologie des CMA ce qui va contribuer à la compréhension du rôle primorial des
CMA en agriculture et environnement. / Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are the most widespread eukaryotic symbionts,
forming mutualistic associations known as Arbuscular Mycorrhizae with the majority of plantroots. AMF are obligate biotrophs belonging to an ancient fungal lineage of phylum
Glomeromycota. Their mycelia are formed by a complex network made up of coenocytic hyphae, where nuclei and cell organelles can freely move from one compartment to another. AMF are commonly acknowledged to improve plant growth by enhancing mineral nutrient uptake, in particular phosphate and nitrate, and they confer tolerance to abiotic and biotic stressors for plants. Despite their significant roles in ecosystems, their genetics and evolution are not well understood. Studying AMF is challenging due to their obligate biotrophy, their slow growth, and their limited morphological criteria. In addition, intra-isolate genetic polymorphism of nuclear DNA brings another level of complexity to the investigation of the biology, ecology and function of AMF. Genetic polymorphism of nuclear DNA within a single isolate limits the development of efficient molecular markers mainly at lower taxonomic levels (i.e. the inter-isolate level). Instead, mitochondrial (mt) genomics have been used as an attractive alternative to study AMF. In AMF, mt genomes have been shown to be homogeneous, or at least much less polymorphic than nuclear
DNA. However, by generating large mt sequence datasets we can investigate the efficiency and usefulness of developing molecular marker toolkits in order to study the dynamic and evolutionary mechanisms of AMF. This approach also elucidates the population genetics, community ecology and functions of Glomeromycota. Therefore, the objectives of my Ph.D. project were: 1) To investigate mitochondrial genome evolution using comparative mitogenomic analyses of closely related species and isolates as well as phylogenetically distant taxa of AMF; 2) To explore mt genome inheritance among compatible isolates of the model AMF Rhizophagus irregularis through anastomosis formation; and 3) To assess mtDNA and mt genes for marker development and phylogenetic analyses. We used whole genome shotgun, 454 pyrosequencing and HiSeq Illimina to sequence AMF taxa selected according to their importance and availability in our lab collections. De novo assemblies, Sanger sequencing, annotation and comparative genomics were then performed to characterize complete mtDNAs. We discovered interesting evolutionary mechanisms in Gigaspora rosea: 1) we found a fully reshuffled mt genome synteny compared to Rhizaphagus irregularis DAOM 197198; and 2) we discovered the presence of fragmented cox1 and rns genes. We demonstrated that two cox1 transcripts are joined by trans-splicing. We also reported an unusual mtDNA organization in Rhizophagus sp. DAOM 213198, whose mt genome consisted of two circular mtDNAs. In addition, we observed a considerably higher number of mt plasmidrelated sequences in Glomeraceae compared with Gigasporaceae, contributing a mechanism for faster evolution of mtDNA in Glomeromycota. We also sequenced other isolates of R. irregularis and Rhizophagus sp. in order to unravel their evolutionary relationships and to develop molecular toolkits for their discrimination. Comparative mitogenomic analyses of these mtDNAs revealed the occurrence of many mobile elements such as mobile open reading frames (mORFs), short inverted repeats (SIRs), and plasmid-related sequences (dpo) that impact mt genome synteny and mtDNA alteration. All together, these evolutionary mechanisms among closely related AMF
isolates give us clues for designing reliable and efficient intra- and inter-specific markers to discriminate closely related AMF taxa and isolates.
Data generated in my Ph.D. project advances our knowledge of mitochondrial genomes
evolution not only in Glomeromycota, but also in the larger framework of the Fungal kingdom and Eukaryotes in general. Molecular toolkits developed in this project will offer new opportunities to study population genetics, genetic exchanges and ecology of AMF. In turn, this work will contribute to understanding the role of these fungi in nature, with potential applications in both agriculture and environmental protection.
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