Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η επίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) και Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae), πουαπομονώθηκαν από ελληνικά εδάφη, επί του κυριότερου και πιο επιβλαβούς εχθρού της καλλιέργειας του γλυκού σόργου, του λεπιδόπτερου Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). Μελετήθηκε στο εργαστήριο η επίδραση έξι στελεχών των παραπάνω μυκήτων στην επιβίωση των προνυμφών του εντόμου. Τα στελέχη των μυκήτων προκάλεσαν υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες του εντόμου, που κυμάνθηκε σε ποσοστά από 78%-98%. Αποτελεσματικότερα στελέχη ήταν τα B. bassiana (ΙΓΕ3), M. robertsii (Elateridae) και I. fumosorosea (Άγιος Στέφανος). Αυτές οι τρείς απομονώσεις επιλέχθηκαν προκειμένου να εξεταστεί η επίδραση της πυκνότητας των κονιδιακών εναιωρημάτων στη θνησιμότητα των προνυμφών. Καταγράφηκαν ποσοστά θνησιμότητας 7%-93% σε σχέση με την πυκνότητα των κονιδιακών εναιωρημάτων επί των προνυμφών. Διαπιστώθηκε ότι η ικανότητα που παρουσιάζουν οι εντομοπαθογόνοι μύκητες στον έλεγχο της επιβίωσης προνυμφών του εντόμου ήταν ανάλογη της χρησιμοποιημένης πυκνότητας των κονιδιακών εναιωρημάτων. Επίσης, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana (ΙΓΕ3) και M. robertsii (Elateridae) με εμπορικό σκεύασμα Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki όσον αφορά τη θανάτωση προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides. Η θνησιμότητα των προνυμφών καταγράφηκε καθημερινά για δεκαέξι ημέρες και κυμάνθηκε από 56-100% για τον M robertsii μαζί με το B thuringiensis subsp. kurstaki και 54-100% για τον B. bassiana μαζί με το βάκιλο. Επίσης, η συνδυασμένη δράση των μικροοργανισμών υπολογίστηκε για την όγδοη, δέκατη τρίτη και τη δέκατη έκτη μέρα και βρέθηκε προσθετική στους περισσότερους συνδιασμούς για την δέκατη τρίτη και δέκατη έκτη μέρα ενώ την όγδοη μέρα η συνδυαστική δράση των παθογόνων βρέθηκε αρνητική στους περισσότερους συνδιασμούς και χαρακτηρίζεται ως ανταγωνιστική. Η ανάπτυξη των εντομοπαθογόνων μυκήτων όταν καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα που περιείχε υδατικό διάλυμα B. thuringiensis subsp. kurstaki, δεν επηρεάστηκε από την παρουσία του βακτηρίου. Ο συνδυασμός του B. thuringiensis subsp. kurstaki με τους εντομοπαθογόνους μύκητες που εξετάσαμε είχε ως αποτέλεσμα να αυξηθεί η θνησιμότητα των προνυμφών του S. nonagrioides. Τα στελέχη ΙΓΕ3, Elateridae και Άγιος Στέφανος των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea αντίστοιχα, δοκιμάστηκαν επί των προνυμφών του S. nonagrioides σε τρεις κονιδιακές συγκεντρώσεις και μελετήθηκε η επίδρασή τους στην πρόσληψη τροφής, στην κατανάλωση τροφής και στην ανάπτυξη των προνυμφών. Παρατηρήθηκε μείωση της πρόσληψης τροφής από προνύμφες 3ης προνυμφικής ηλικίας σε ποσοστά 41-81%, μείωση του βάρους τους κατά 29-45% και μείωση των απορριμάτων κατά 46-81%. Παρατηρήθηκε επίσης ελάττωση της σχετικής ταχύτητας ανάπτυξης των προνυμφών κατά 31-72% και της σχετικής ταχύτητας κατανάλωσης τροφής κατά 12-35%. Τέλος, ο δείκτης πεπτικότητας, ο δείκτης μετατροπής της προσληφθείσας τροφής και ο δείκτης μετατροπής της αφομοιωμένης τροφής ήταν υψηλότεροι σε σχέση με τους αντίστοιχους του μάρτυρα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ενδεχομένως ότι η μόλυνση από τους εντομοπαθογόνους μύκητες προκαλεί επιδείνωση σε ορισμένες τροφικές διεργασίες της προνύμφης που θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην υπονόμευσή της από ασιτία. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα στο πεδίο προκείμενου να μελετηθεί η επίδραση της ενδοφυτικής παρουσίας των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea στις προνύμφες του εντόμου S. nonagrioides in planta. Kαι οι τρείς μύκητες έδρασαν αποτρεπτικά απέναντι στην προσπάθεια των προνυμφών να εισέλθουν στο στέλεχος του φυτού. Οι προνύμφες της 4ης προνυμφικής ηλικίας που πέτυχαν να εγκατασταθούν στο στέλεχος των φυτών δημιούργησαν στοές μικρότερου μήκους παρουσία των μυκήτων, και η θνησιμότητά τους ήταν μεγαλύτερη, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα των in vitro πειραμάτων. Ως προς τις επιπτώσεις της παρουσίας των ενδοφύτων στο φυτό ξενιστή, η επίδραση της παρουσίας των μυκήτων στην ανάπτυξη, την τελική βιομάζα και την κατανομή της βιομάζας σε υπέργειους ή υπόγειους ιστούς των φυτών καταγράφηκε ως ουδέτερη. Η συγκέντρωση της χλωροφύλλης και η περιεκτικότητα σε νερό δεν παρουσίασαν μεταβολές που μπορούν να αποδοθούν στην παρουσία των ενδοφύτων. Ωστόσο, ορισμένες παράμετροι της φωτοσυνθετικής διαδικασίας (καθαρή φωτοσύνθεση, ταχύτητα ροής ηλεκτρονίων, η πιθανότητα μετατροπής της συλληφθείσας ενέργειας σε ροή ηλεκτρονίων, η πιθανότητα μεταφοράς ηλεκτρονίων από τους ενδιάμεσους φορείς μέχρι την αναγωγή των τελικών υποδοχέων στο PSI και ο δείκτης ζωτικότητας της φωτοσυνθετικής συσκευής PItotal) επηρεάστηκαν αρνητικά μετά την προσβολή των στελεχών του σόργου από τις προνύμφες του εντόμου. Η ενδοφυτική παρουσία των μυκήτων B. bassiana και M. robertsii απέτρεψε τις παραπάνω αρνητικές επιδράσεις. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προσφέρουν ισχυρές ενδείξεις για επιτυχή χρησιμοποίηση ορισμένων στελεχών των εντομοπαθογόνων μυκήτων στον έλεγχο των προνυμφών του εντόμου S. nonagrioides τόσο στο εργαστήριο όσο και στο πεδίο. Επίσης, θα ήταν ενδιαφέρουσα η περαιτέρω μελέτη της χρήσης αυτών τωνεντομοπαθογόνων μυκήτων κάτω από συνθήκες μειωμένης διαθεσιμότητας νερού. / The aim of this study was to investigate the effect of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae), isolated from Greek soils against the main and most damaging pest of sweet sorghum, Mediterranean corn borer Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera: Noctuidae). Laboratory studies were performed to determine the effect of six strains of the above fungi on survival of larvae of S. nonagrioides. All strains of fungi causing high mortality among larvae, killed 78 - 98% of exposed larvae. The most effective were B. bassiana (IGE3), M. robertsii (Elateridae) and I. fumosorosea (Agios Stefanos). These three isolates were selected to examine the effect several conidial suspensions on the mortality of larvae. Recorded mortality was from 7% - 93% depending on the density of conidial suspensions used on larvae. From the above results was found that the capability provided by the entomopathogenic fungi to control the insect was according by the density of the conidial suspensions. Also, the interactions between commercial B. thuringiensis subsp. kurstaki and two entomopathogenic fungi were examined on larvae of S. nonagrioides in 8, 13 and 16 days post-treatment intervals. An overall positive interaction between the pathogens was observed and larval mortality at 16 days was 56–100% exposed to M. robertsii combined with B. thuringiensis subsp. kurstaki, whereas B. bassiana combined with B. thuringiensis subsp. kurstaki killed 54–100 % of exposed larvae. After 8 days, in 6 of the combinations, we found an additive relationship between the pathogens, whereas, a negative interaction was observed in 10 of them. In contrast, after 13 days, we observed a positive interaction in two combinations, which could be considered as synergistic, additive in ten combinations and negative in only four combinations. Finally, after 16 days, in eleven combinations we found an additive interaction, whereas negative interaction was recorded in five of them. We conclude that application of combined pathogens may be more effective for S.nonagrioides control. The strains IGE3, Elateridae and Agios Stefanos of B. bassiana, M. robertsii and I. fumosorosea respectively, were tested for their effectiveness on larval food intake, food consumption and larvae growth at three conidial concentrations. We observed a decrease in food intake by the larvae ranged between 41 and 81%, reduced larvae weight from 29 to 45% and reduced production of wastes from 46 to 81%. We also recorded significant differences in the relative growth rate of larvae, the relative consumption rate of larvae, the index digestibility, the conversion ratio of ingested food and the conversion ratio of assimilated food between infected and control individuals. Therefore, it is possible that infection of larvae by the fungi has an adverse effect on physiological and metabolic processes, which results in larva starvation. Subsequently, we performed experiments in the field, in order to investigate the plant–endophyte association behavior using B. bassiana, M. robertsii and I. fumosorosea, as well as the impact of these associations on larva activity when in planta and under environmental conditions. All three fungal species significantly prevented larvae from entering into plants’ stalk. Statistically significant differences were also observed in the length of tunnels created by larvae in the stem of the plant and in their mortality for individuals infected by the entomopathogenic fungi. These results confirm our findings of the in vitro experiments. Regarding the effect of endophytes on the host plant, a neutral impact was recorded for the development, final biomass and distribution of biomass to the aboveground and underground plant tissues. Temporary changes of chlorophyll concentration and leaf water content stability throughout the experimental period should not be attributed to the presence of endophytes. However, some aspects of the photosynthetic process (net photosynthesis, electron transport rate, as well as parameters of the photosynthetic machinery relative to electron flow round the two photosystems) negatively affected after infection of plants by the larvae. The presence of B. bassiana and M. robertsii ameliorated these adverse effects. The results of this study are strongly indicative of successful usage of certain fungi strains for biological control of S. nonagrioides larvae both in laboratory conditions and in the field.

Το βακτήριο Wolbachia είναι ένα ενδοκυττάριο και μητρικά κληρονομούμενο συμβιωτικό βακτήριο. Ανήκει στην ομοταξία των Alphaproteobacteria και την τάξη των Rickettsiales. Αποτελεί ίσως τον πιο διαδεδομένο ενδοκυττάριο συμβιωτικό οργανισμό στον πλανήτη, καθώς έχει εντοπιστεί μέχρι στιγμής σε πληθώρα αρθροπόδων και νηματωδών της φιλαρίασης. Πρόσφατες μελέτες εκτιμούν ότι πάνω από το 40% των ειδών αρθροπόδων είναι μολυσμένα με το βακτήριο Wolbachia. Το συμβιωτικό αυτό βακτήριο επηρεάζει τις βιολογικές λειτουργίες και ιδιότητες των ξενιστών του και είναι υπεύθυνο για μια σειρά αναπαραγωγικών ανωμαλιών, όπως η κυτταροπλασματική ασυμβατότητα, η παρθενογένεση, η θανάτωση των αρσενικών εμβρύων και η θηλυκοποίηση. Τα μοναδικά αυτά βιολογικά χαρακτηριστικά του βακτηρίου Wolbachia προσελκύουν όλο και περισσότερο το ενδιαφέρον διαφόρων ερευνητών τόσο για το ρόλο του βακτηρίου σε εξελικτικές διαδικασίες (κυρίως ειδογένεση) όσο και για τη χρησιμοποίησή του σε περιβαλλοντικά φιλικές εφαρμογές καταπολέμησης οργανισμών που είναι επιβλαβείς στους τομείς του γεωργικού και δασικού περιβάλλοντος, και της υγείας. Τα είδη του γένους Glossina (Diptera: Glossinidae), γνωστά και ως μύγες τσε-τσε, αποτελούν ξενιστές του βακτηρίου Wolbachia. Η μύγα τσε-τσε είναι ο σημαντικότερος φορέας των παθογόνων τρυπανοσωμάτων στην τροπική Αφρική, τα οποία προκαλούν την ασθένεια του ύπνου (sleeping sickness) στον άνθρωπο και την αντίστοιχη τρυπανοσωμίαση, γνωστή ως nagana, στα ζώα. Η χρησιμοποίηση του βακτηρίου Wolbachia σε μεθόδους βιολογικής καταπολέμησης της μύγας τσε-τσε προαπαιτεί την πλήρη γνώση της γενετικής του ταυτότητας και των αλληλεπιδράσεων του με το ξενιστή. Προς την κατεύθυνση αυτή, και στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia σε περισσότερα από 5300 άτομα από φυσικούς και εργαστηριακούς πληθυσμούς 11 διαφορετικών ειδών μύγας τσε-τσε από 13 Αφρικανικές χώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν τεράστια απόκλιση της παρουσίας του βακτηρίου τόσο μεταξύ ειδών όσο και μεταξύ πληθυσμών του ίδιου είδους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο γενετικός χαρακτηρισμός των στελεχών Wolbachia από συνολικά 29 αντιπροσωπευτικά δείγματα διαφόρων πληθυσμών και ειδών μύγας τσε-τσε, ενώ σε αρκετά από αυτά παρατηρήθηκαν πολλαπλά στελέχη του βακτηρίου. Διαπιστώθηκε εντυπωσιακή γενετική ποικιλότητα στελεχών Wolbachia που απαντούν στα διάφορα είδη μύγας τσε-τσε καθώς και ασυμφωνία μεταξύ των φυλογενειών των στελεχών Wolbachia και των μυγών τσε-τσε ξενιστών της, γεγονός που σημαίνει οριζόντια μετακίνηση του συμβιωτικού βακτηρίου κατά την εξέλιξη. Επιπρόσθετα, εντοπίστηκαν για πρώτη φορά εκτεταμένα γεγονότα οριζόντιας μεταφοράς βακτηριακών γονιδίων στο γονιδίωμα τριών ειδών μύγας τσε-τσε: στο Glossina morsitans morsitans, Glossina pallidipes και Glossina austeni. Από εξελικτικής σκοπιάς, κρίσιμα ερωτήματα προκύπτουν από τα παραπάνω ευρήματα, και πιο συγκεκριμένα σχετικά με: την προέλευση-μηχανισμό αυτών των γεγονότων οριζόντιας μεταφοράς, τον χρονικό προσδιορισμό τους, τον πιθανό ρόλο τους σε διαδικασίες ειδογένεσης και την επιλεκτική εμφάνισή τους σε ορισμένα μόνο είδη Glossina π.χ. στo υποείδos Glossina morsitans centralis που είναι πολύ συγγενικό του Glossina morsitans morsitans δεν παρατηρήθηκε το φαινόμενο. Εξίσου σημαντική και επιβεβλημένη κρίνεται η διεξοδική διερεύνηση του ενδεχομένου τα βακτηριακά γονίδια που ενσωματώθηκαν στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα της μύγας τσε-τσε να ευθύνονται για την έκφραση νέων λειτουργιών-ιδιοτήτων (ή να μεταβάλλουν τις ήδη υπάρχουσες), ιδίως μάλιστα εάν αυτές συνδέονται με την αποδοτικότητα μετάδοσης της νόσου της τρυπανοσωμίασης μέσω του φορέα της, δηλαδή της μύγας τσε-τσε. Τέλος, διαπιστώθηκε πιθανή αρνητική συσχέτιση της παρουσίας του βακτηρίου Wolbachia με τον παθογόνο ιό Salivary Gland hypertrophy Virus (SGHV), γεγονός που συζητείται στα πλαίσια βιολογικών εφαρμογών καταπολέμησης του εντόμου-φορέα και της τρυπανοσωμίασης. Παράλληλα, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η προοπτική χρησιμοποίησης του βακτηρίου Wolbachia για τη βιολογική καταπολέμηση εντόμων αγροτικής ή /και περιβαλλοντικής σημασίας, όπως είναι οι αφίδες και η καρπόκαψα καστανιάς. Το γεγονός αυτό προϋποθέτει την ανίχνευση και τη γενετική ταυτοποίηση του βακτηρίου σε φυσικούς πληθυσμούς εντόμων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε ανίχνευση και χαρακτηρισμός του βακτηρίου Wolbachia σε 78 συνολικά άτομα από 22 είδη αφίδων, από 26 φυσικούς πληθυσμούς από την Ελλάδα. Από αυτούς τους 26 πληθυσμούς, μόλις οι 4 βρέθηκαν να είναι μολυσμένοι με το βακτήριο Wolbachia και συγκεκριμένα πληθυσμοί των ειδών: Aphis fabae, Aphis hederae, Metopolophium dirhodum και Baizongia pistaciae. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν για πρώτη φορά ότι η παρουσία του βακτηρίου Wolbachia στις αφίδες είναι πιθανά πιο διαδεδομένη από ότι προέκυπτε από προηγούμενες μελέτες. Επίσης, μελετήθηκε η ανίχνευση και ο χαρακτηρισμός του βακτηρίου Wolbachia στα είδη Cydia splendana, Cydia fagiglandana και Pammene fasciana. Το βακτήριο Wolbachia ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στα συγκεκριμένα είδη και μάλιστα διαπιστώθηκε ότι η συχνότητα εμφάνισής του ποικίλει τόσο μεταξύ των δύο ειδών Cydia όσο και μεταξύ των πληθυσμών του κάθε είδους. Στο είδος Pammene fasciana, το βακτήριο ανιχνεύθηκε σε όλα τα άτομα που μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής συζητούνται από τη σκοπιά τόσο της οικολογικής και εξελικτικής σημασίας τους όσο και της προοπτικής χρησιμοποίησης του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia για τον πληθυσμιακό έλεγχο επιβλαβών εντόμων όπως οι μύγες τσε-τσε, οι αφίδες και η καρπόκαψα καστανιάς. / Wolbachia is an intracellular and maternally inherited symbiotic bacterium that belongs to the class of Alphaproteobacteria and the order of Rickettsiales. It is the most ubiquitous intracellular symbiotic organism of the planet, since it has been estimated that over 40% of insect species, in addition to filarial nematodes, crustaceans, and arachnids are infected with Wolbachia. In arthropods Wolbachia affects the biological functions and properties of its hosts and it is responsible for a number of reproductive abnormalities, such as cytoplasmic incompatibility (CI), thelytokous parthenogenesis, feminization of genetic males and male killing. These unique biological characteristics of Wolbachia are attracting the interest of various researchers for: (a) decyphering the role of Wolbachia in evolutionary processes (mainly speciation), and (b) for its use in environmentally friendly applications for the control of agricultural pests and disease vectors. The species of genus Glossina (Diptera: Glossinidae) known as tsetse flies, have been found to be infected with Wolbachia. Tsetse flies are the sole vectors of pathogenic trypanosomes in tropical Africa, causing the “sleeping sickness” in humans and the “nagana” in animals. The potential use of Wolbachia for the control of tsetse flies, prerequisite a thorough knowledge of its genetic identity and the interactions with the host. To further characterize the prevalence of Wolbachia in tsetse flies an extensive screen of more than 5300 specimens from natural and laboratory populations of 11 different Glossina species originating from 13 African countries was carried out. Our results indicated a huge divergence in the prevalence of Wolbachia, both among the species and among populations of the same species. Further characterization by MLST and wsp genotyping was carried out for the Wolbachia strains of 29 representative populations and species of tsetse flies. An impressive genetic diversity of Wolbachia strains in tsetse flies was revealed. Interestingly, disconcordance between the phylogeny of Wolbachia and that of the tsetse flies was observed, suggesting horizontal transmission of Wolbachia during the evolution. Moreover, extended horizontal gene transfer events were detected for first time in Glossina morsitans morsitans, Glossina pallidipes και Glossina austeni. These results raise critical questions concerning: (a) the origin/mechanism of these horizontal gene transfer events, (b) their temporal determination, (c) their potential role as agents of speciation and (d) their selective appearance in only some Glossina species e.g in the subspecies Glossina morsitans centralis which is closely related with Glossina morsitans morsitans the phenomenon was not observed. Equally important will be to examine if genes from the chromosomal insertions were potentially expressed and examine if these genes are associated with the vectorial capacity of tsetse flies for the trypanosoma transmission. Finally, a negative correlation between the presence of Wolbachia with the Salivary Gland Hypertrophy Virus (SGHV) was identified. This is further discussed in the context of biological applications for control of tsetse fly-vector and trypanosomiasis. Finally in this thesis, the detection and characterization of Wolbachia in 78 specimens of 22 aphids species, from 26 natural populations, from Greece was examined. Only 4 out of 26 populations were found to be infected with Wolbachia, and specifically the species: Aphis fabae, Aphis hederae, Metopolophium dirhodum και Baizongia pistaciae. These results indicated that the presence of Wolbachia in aphids is probably more prevalent than it was derived from previous studies. Also, detection and characterization of Wolbachia in the Cydia splendana, Cydia fagiglandana and Pammene fasciana was carried out. Wolbachia was detected for first time in these species, and it was found that the prevalence of Wolbachia varies between the two species of Cydia and among populations of each species, with the infection in Pammene fasciana being fixed. At the end the ecological and evolutionary importance of Wolbachia, together with the use of the bacterium for the population control of harmful insects like tsetse flies, aphids and moths is further discussed.