Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους (CNS) σε ασθενείς με προσθετικά υλικά, όπως ενδαγγειακούς καθετήρες και η σύγκριση με στελέχη που προκαλούν βακτηριαιμία. Συνολικά μελετήθηκαν 168 Staphylococcus epidermidis και 58 S. haemolyticus από βακτηριαιμίες (BSIs, 100 στελέχη) και εντοπισμένες λοιμώξεις σχετιζόμενες με την εφαρμογή προσθετικών υλικών (PDAIs, 126 στελέχη) από ασθενείς του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών (ΠΓΝΠ) και του Νοσοκομείου Παίδων Πεντέλης (ΝΠΠ). Η πλειοψηφία των στελεχών (89.8%) ήταν ανθεκτικά στην methicillin (MR-CNS) και πολυανθεκτικά (90.7%). Βιομεμβράνη συνέθεταν τα 106/226 στελέχη, ενώ 208 παρήγαγαν β-λακταμάση. Τα γονίδια σύνθεσης προσκολλητινών aap, fnbA και bap βρέθηκαν σε συχνότητα 40.3%, 35.8% και 20.4% αντίστοιχα. Οι S. epidermidis έφεραν τα γονίδια atlE και fbe σε ποσοστά 88.1% και 81%, αντίστοιχα. Από τα γονίδια σύνθεσης τοξινών, συχνότερο ήταν το γονίδιο της τοξίνης τοξικής καταπληξίας tst (8.4%) ενώ τα γονίδια που κωδικοποιούν τις εντεροτοξίνες sea, sec βρέθηκαν μόνο σε μικρό ποσοστό στελεχών S. epidermidis και S. haemolyticus (5.3% και 3.1% του συνολικού πληθυσμού αντίστοιχα). Κανένα στέλεχος δεν έφερε τα γονίδια σύνθεσης των εντεροτοξινών seb και sed. Ο πληθυσμός των στελεχών S. epidermidis έδειξε μεγάλη γενετική ποικιλομορφία, με 67 PFGE τύπους, μεταξύ των οποίων δύο κύριοι τύποι (a, b) με 50 και 36 στελέχη αντίστοιχα. Έλεγχος με MLST ανέδειξε τρεις κύριους κλώνους (ST2, ST5 και ST16) που ανήκαν στο ίδιο κλωνικό σύμπλεγμα (Clonal Complex 2). Τα στελέχη του PFGE τύπου a παρουσίασαν υψηλότερα ποσοστά αντοχής στα αντιμικροβιακά clindamycin, ciprofloxacin, fusidic acid, SXT και στις αμινογλυκοσίδες, ενώ τα στελέχη του τύπου b έφεραν συχνότερα το γονίδιο aap (p=0.049). Τα στελέχη S. haemolyticus παρουσίασαν μικρότερη γενετική ποικιλομορφία, με έναν κύριο PFGE τύπο (h), που περιελάμβανε 44/58 στελέχη (75.9% του συνολικού πληθυσμού). Τα στελέχη CNS από BSIs ήταν συχνότερα ανθεκτικά στην methicillin (p<0.001) και στα υπόλοιπα αντιμικροβιακά (p<0.05), ενώ υπερείχαν και στην παραγωγή biofilm (p=0.003). Αντιθέτως, οι CNS από PDAIs έφεραν συχνότερα τα γονίδια των προσκολλητινών aap (p=0.006) και bap (p=0.045). Σε ένα δεύτερο σκέλος της παρούσας ερευνητικής εργασίας μελετήθηκε ένας πληθυσμός S. lugdunensis από το ΠΓΝΠ (37 στελέχη) και το ΝΠΠ (1 στέλεχος). Ο S. lugdunensis κατέχει ιδιαίτερη θέση μεταξύ των CNS, καθώς μπορεί να μιμηθεί την παθογόνο δράση του S. aureus και να προκαλέσει σοβαρές λοιμώξεις. Είκοσι δύο S. lugdunensis απομονώθηκαν από ασθενείς με λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (Skin and Soft Tissue Infections: SSTIs), εννέα από εν τω βάθει λοιμώξεις (Deep Sited Infections: DSIs), συμπεριλαμβανομένων τριών στελεχών από ασθενείς με βακτηριαιμία, και επτά στελέχη από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά, κυρίως ενδαγγειακούς καθετήρες, (PDAIs). Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην methicillin (MS-CNS), στις αμινογλυκοσίδες (kanamycin, gentamicin), καθώς και στα: ciprofloxacin, rifampicin, teicoplanin, vancomycin, linezolid και daptomycin, ενώ μόνο τέσσερα στελέχη ήταν πολυανθεκτικά. Οι S. lugdunensis της συλλογής μας έδειξαν μικρή γενετική ποικιλομορφία. Τα 38 στελέχη ταξινομήθηκαν σε επτά κλώνους, με δύο κύριους PFGE τύπους (C και D), οι οποίοι περιελάμβαναν 22 και εννέα στελέχη αντίστοιχα. Τα 26 από τα 38 στελέχη έφεραν το οπερόνιο ica, ενώ συνολικά 14 ήταν biofilm-θετικά. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της παρουσίας του ica με κάποιο κλώνο, αλλά ούτε και με την παραγωγή βιομεμβράνης. Οι S. lugdunensis από PDAIs ήταν συχνότερα biofilm-θετικοί σε σχέση με τα στελέχη από SSTIs και DSIs, ενώ ο κύριος κλώνος C παρήγαγε biofilm σε μεγαλύτερο ποσοστό από τον D, δεύτερο σε συχνότητα κλώνο. Το γονίδιο fbl ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη S. lugdunensis που εξετάστηκαν, επιβεβαιώνοντας την φαινοτυπική ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους. Ο επόμενος κατά σειρά συχνότητας παράγοντας παθογένειας που ανιχνεύθηκε ήταν το γονίδιο atlL, το οποίο βρέθηκε σε 36 από τα 38 στελέχη (94.7%). Ακολουθούν οι παράγοντες vwbl και slush, που βρέθηκαν σε 31 (81.6%) και 15 (39.5%) S. lugdunensis, αντίστοιχα. Τα στελέχη από εν τω βάθει λοιμώξεις (DSIs) έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush σε σχέση με αυτά από PDAIs και SSTIs . Ο κλώνος C υπερείχε στην παρουσία του ermC, ενώ τα στελέχη που ανήκαν στον κλώνο D έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush. / Coagulase-negative staphylococci (CNS), especially Staphylococcus epidermidis and S. haemolyticus, have emerged as opportunistic pathogens in patients with low immune response or indwelling medical devices. In the present study, bloodstream (BSIs) and prosthetic-device associated infections (PDAIs) CNS isolates were compared in terms of biofilm formation, antimicrobial resistance, clonal distribution, adhesin and toxin genes carriage. A collection of 226 CNS (168 S. epidermidis and 58 S. haemolyticus) recovered from BSIs (100) and PDAIs (126) of different patients in the Patras tertiary-care University General Hospital (UGHP) and Pentelis Paediatric Hospital in Athens (PPHA), was tested for biofilm formation, antimicrobial susceptibility, mecA, ica operon, adhesin (aap, bap, fnbA, atlE, fbe) and toxin (tst, sea, seb, sec, sed) genes carriage. All CNS were classified into pulsotypes by PFGE, whereas S. epidermidis strains were assigned to sequence types by MLST. In total, 106 isolates (46.9%) produced biofilm, whereas 150 (66.4%) carried ica operon. Most isolates carried mecA and were multidrug resistant (90.7%). The adhesin encoding genes aap, fnbA and bap were identified in 40.3%, 35.8% and 20.4% of the total population, respectively. Genes encoding AtlE and Fbe were found in 88.1% and 81% of S. epidermidis isolates, respectively. CNS recovered from BSIs prevailed in biofilm formation (P=0.003), resistance to antimicrobials and mecA carriage (P<0.001) as compared to isolates derived from PDAIs. CNS from PDAIs carried more frequently aap and bap genes (P=0.006 and P=0.045, respectively). No statistically significant difference in toxin genes carriage was identified (P>0.05). Even though PFGE showed genetic diversity, especially among S. epidermidis, analysis of representative strains from the main PFGE types by MLST, revealed three major clones (ST2, ST5, ST16). A clonal relationship was found concerning antimicrobial susceptibility, ica and aap gene carriage, reinforcing the aspect of clonal expansion in hospital settings. Pathogenesis of BSIs is associated with biofilm formation and high-level antimicrobial resistance, whereas PDAIs are related to the adhesion capability of CNS. In the second part of this study we analyzed a collection of S. lugdunensis isolates recovered from different inpatients hospitalized in UGHP (37 isolates) and PPHA (one isolate) during a six-year period (2008-2013). S. lugdunensis has emerged as a significant human pathogen with distinct clinical and microbiological characteristics. A collection of 38 S. lugdunensis was tested for biofilm formation, antimicrobial susceptibility, clonal distribution, virulence factors (ica operon, fbl, atlL, vwbl, slush) and antibiotic resistance genes (mecA, ermC) carriage. The majority (22) was isolated from skin and soft tissue infections (SSTIs), nine from deep-sited infections (DSIs), including three bacteraemias and seven from PDAIs. All isolates were oxacillin-susceptible, mecA-negative and fbl-positive. The higher resistance rate was detected for ampicillin (50%), followed by erythromycin and clindamycin (18.4%). Fourteen isolates (36.8%) produced biofilm, 26 carried ica operon, but no relation between ica carriage and biofilm formation was identified. Biofilm formation was more frequent in isolates recovered from PDAIs. Thirty six strains (94.7%) carried atlL, 31 (81.6%) vwbl, whereas, slush was detected in fifteen (39.5%). PFGE revealed low level of genetic diversity: strains were classified into seven pulsotypes, with two major clones C and D including 22 and nine strains, respectively. Type C strains, recovered from all infection sites, prevailed in biofilm formation and ermC carriage, whereas, type D strains, associated with SSTIs and DSIs, carried more frequently vwbl, slush or both genes. Despite susceptibility to antimicrobials, clonal expansion and carriage of virulence factors combined with biofilm-producing ability render this species an important pathogen that should not be ignored.

Ο S. epidermidis αποτελεί κύριο μέλος της χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων του ανθρώπου, ενώ συνιστά ένα από τα συχνότερα παθογόνα που προκαλούν νοσοκομειακές λοιμώξεις, ιδιαίτερα σε ανοσοκατασταλμένους ή ασθενείς φέροντες προσθετικά υλικά. Κύριος λοιμογόνος παράγοντας του S. epidermidis είναι ο σχηματισμός βιομεμβράνης. Διάφοροι πολυσακχαρίτες έχουν απομονωθεί από την εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis και έχουν συσχετισθεί με το σχηματισμό βιομεμβράνης καθώς και με την παθογόνο δράση τους. Ο πλέον μελετημένος και εδραιωμένος είναι ο ΡΙΑ, ενώ οι άλλοι πολυσακχαρίτες (PS/A ή PNSG ή PNAG και το SSA) απεδείχθησαν τελικώς ότι είναι ταυτόσημοι ή χημικώς ανάλογοι του ΡΙΑ. Ο ΡΙΑ είναι μία ομογλυκάνη αποτελούμενη από μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό και η σύνθεσή του ελέγχεται από ένζυμα που κωδικοποιούνται από τον icaADBC γενετικό τόπο. Η εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis περιέχει επίσης έναν πολυσακχαρίτη, τον 20-kDaPS, ο οποίος απομονώθηκε από ερευνητές του Πανεπιστημίου Πατρών και αποτελείται κυρίως από γλυκόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, και είναι μερικώς θειωμένος. Ο 20-kDaPS αντιορός αναστέλλει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την εμφάνιση βακτηριακής κερατίτιδας σε κουνέλια. Με βάση αναλύσεις κλινικών στελεχών, ο 20-kDaPS εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στελεχών S. epidermidis, ενώ δεν ανευρέθηκε σε στελέχη άλλων πηκτάση αρνητικών σταφυλοκόκκων. Η παρεμβολή αλληλουχιών εισδοχής σε διάφορα σημεία του icaADBC οπερονίου, το οποίο ελέγχει τη σύνθεση του ΡΙΑ, δεν παρεμβάλλεται στην έκφραση του 20-kDaPS. Η κατεργασία βακτηριακών κυττάρων S. epidermidis με το ένζυμο dispersin B, το οποίο διασπά ειδικά τον β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό που συνθέτει το πολυμερές του ΡΙΑ, και με μετα-περιοδικό νάτριο που διασπά το δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα C-3 και C-4 των μονομερών Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, οδηγεί σε διάσπαση της βιομεμβράνης, χωρίς όμως να διαφοροποιείται αντιγονικά ο 20-kDaPS. Τα κλάσματα, μετά την έκλουση της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis από στήλη Q-Sepharose, που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ανοσοδραστικότητα για τον ΡΙΑ, στερούνται πλήρως 20-kDaPS. Η προεπώαση κλινικού στελέχους που δεν εκφράζει τον 20-kDaPS με τον πολυσακχαρίτη αναστέλλει την ενδοκυττάρωση, ενώ η προεπώαση του πρότυπου στελέχους ATCC35983 που συνθέτει τον 20-kDaPS με ειδικό αντιορό ενισχύει την ενδοκυττάρωση από τα ανθρώπινα μακροφάγα. Κατά συνέπεια, ο icaADBC γενετικός τόπος δεν εμπλέκεται στη σύνθεση του 20-kDaPS. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του PIA και του 20-kDaPS είναι διακριτές. Ο 20-kDaPS πιθανό να επιδεικνύει αντιφαγοκυτταρική δράση, ενώ τα ειδικά αντισώματα έχουν δράση οψωνίνης. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεμβράνης προστατεύει από τις αντιμικροβιακές ουσίες και το σύστημα ανοσίας. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης περιέχουν στην εξωκυττάρια ουσία τους μεγαλύτερα ποσά ΡΙΑ από τα ελεύθερα αναπτυσσόμενα, πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επιδεικνύουν μεγαλύτερη ικανότητα για προσκόλληση και επιβίωση εντός των ανθρώπινων μακροφάγων από τα πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επάγουν την παραγωγή μικρότερων ποσών φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFα, καθώς και Th1 κυτταροκινών, όπως οι IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, ενώ ενισχύουν τις IL-8, GM-CSF και IL-13. Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις αφορούν ζωντανά βακτηριακά κύτταρα καθώς και βακτηριακά κύτταρα μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη. Τα ανωτέρω δεδομένα συνάδουν με την ήπια συμπτωματολογία των σχετιζόμενων με βιομεμβράνη λοιμώξεων S. epidermidis και τη διαφυγή της επιτήρησης του ανοσολογικού συστήματος. Συμπερασματικά, ο 20-kDaPS αποτελεί κύριο συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis με αντιφαγοκυτταρικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του 20-kDaPS είναι πλήρως διακριτές του ΡΙΑ, του κύριου πολυσακχαρίτη που σχετίζεται με το σχηματισμό βιομεμβράνης, ενώ ο γενετικός τόπος icaADBC δε ρυθμίζει τη σύνθεση του 20-kDaPS. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεβράνη εξασφαλίζει αντίσταση στην ενδοκυττάρια θανάτωσή τους από τα μακροφάγα και καταστολή της ανοσιακής απόκρισης. / The skin commensal and opportunistic pathogen Staphylococcus epidermidis is a leading cause of hospital-acquired and biomaterial-associated infections. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA), a homoglycan composed of β-1,6-linked N-acetylglucosamine residues, synthesized by enzymes encoded by the icaADBC operon is a major functional factor in biofilm accumulation, promoting virulence in experimental biomaterial-associated S. epidermidis infections. Extracellular mucous layer extracts of S. epidermidis contain another major polysaccharide, referred to as 20-kDa polysaccharide (20-kDaPS), composed mainly out of glucose, N-acetylglucosamine, and being partially sulfated. 20-kDaPS antiserum prevents adhesion of S. epidermidis on endothelial cells and development of experimental keratitis in rabbits. Here we provide experimental evidence that 20-kDaPS and PIA represent distinct molecules and that 20-kDaPS is implicated in endocytosis of S. epidermidis bacterial cells by human monocyte-derived macrophages. Analysis of 75 clinical coagulase-negative staphylococci from blood-cultures and central venous catheter tips indicated that 20-kDaPS is expressed exclusively in S. epidermidis but not in other coagulase-negative staphylococcal species. Tn917-insertion in various locations in icaADBC in mutants M10, M22, M23, and M24 of S. epidermidis 1457 are abolished for PIA synthesis, while 20-kDaPS expression appears unaltered as compared to wild-type strains using specific anti-PIA and anti-20-kDaPS antisera. While periodate oxidation and dispersin B treatments abolish immuno-reactivity and intercellular adhesive properties of PIA, no abrogative activity is exerted towards 20-kDaPS immunochemical reactivity following these treatments. PIA polysaccharide I-containing fractions eluted from Q-Sepharose were devoid of detectable 20-kDaPS using specific ELISA. Preincubation of non-20-kDaPS-producing clinical strains with increasing amounts of 20-kDaPS inhibits endocytosis by human macrophages, whereas, preincubation of 20-kDaPS-producing strain ATCC35983 with 20-kDaPS antiserum enhances bacterial endocytosis by human macrophages. In conclusion, icaADBC is not involved in 20-kDaPS synthesis, while the chemical and chromatographic properties of PIA and 20-kDaPS are distinct. 20-kDaPS exhibits anti-phagocytic properties, whereas, 20-kDaPS antiserum may have a beneficial effect on combating infection by 20-kDaPS-producing S. epidermidis. As stated above, biofilm formation is a major virulence factor of S. epidermidis. Biofilm protects bacterial cells from antimicrobial agents and components of the immune system. Interactions of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages with planktonic or biofilm phase S. epidermidis cells were also studied. Biofilm phase bacteria exhibited higher attachment, as well as, a ten fold higher intracellular survival in monocyte-derived macrophages than their planktonic counterparts. Stimulation of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages was performed with live or formalin-fixed bacterial cells. Supernatant concentration of selected cytokines was measured by Luminex® xMAP™ technology at different time points. As compared to planktonic phase, biofilm phase bacteria elicited lower amounts of proinflammatory cytokines and Th1 response cytokines, such as TNFα, IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, whereas, they enhanced production of IL-8, GM-CSF and IL-13. This phenomenon was independent of formalin pretreatment. Taken together, these results may contribute to interpretation of observed silent course of biofilm associated infections. In conclusion, 20-kDaPS represents a major component of S. epidermidis extracellular matrix and data show that 20-kDaPS posseses antiphagocytic and immunomodulatory properties. 20-kDaPS and PIA are immunochemically and chromatographically discrete molecules, whereas icaADBC locus is not involved in 20-kDaPS synthesis. Biofilm mode of growth ensures higher resistance rates to intracellular killing and down regulation of immune responses.