Η χρήση ενδοφλέβιων καθετήρων είναι πλέον συνώνυμη με τις λοιμώξεις που προκαλούνται από στελέχη S. epidermidis. Η ικανότητα του συγκεκριμένου μικροοργανισμού να σχηματίζει βιομεμβράνες σχετίζεται άμεσα με την παθογένειά του. Ορισμένες ερευνητικές ομάδες έχουν περιγράψει κάποιους από τους μηχανισμούς σχηματισμού βιομεμβράνης καθώς και μόρια που συμμετέχουν σε αυτούς. Η ερευνητική μας ομάδα έχει απομονώσει ένα όξινο, θειωμένο πολυσακχαρίτη (20-kDa PS ή PS) ο οποίος φαίνεται να είναι ο κύριος αντιγονικός καθοριστής της εξωκυττάριας βλεννώδους στιβάδας του S. epidermidis. Αντισώματα έναντι αυτού του πολυσακχαρίτη έχει δειχθεί ότι προστατεύουν από σταφυλοκοκκική κερατίτιδα, από νεογνική βακτηριαιμία ενώ ταυτόχρονα διαχωρίζουν τα στελέχη S. epidermidis από τους υπόλοιπους πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους. Ένας από τους κύριους στόχους της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου του PS στην προσκόλληση του S. epidermidis σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν ένα πρότυπο στέλεχος S. epidermidis που παράγει τον PS (ΑΤCC35983) και ένα κλινικό στέλεχος το οποίο έχει δειχθεί ότι δεν παράγει τον συγκεκριμένο πολυσακχαρίτη. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι ο PS διευκολύνει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Παρά το γεγονός ότι ο ακριβής μηχανισμός προσκόλλησης δεν έχει βρεθεί, εντούτοις μπορεί να συσχετισθεί με το μηχανισμό πρόσδεσης των σταφυλοκόκκων μέσω των αλυσίδων γλυκοσαμινογλυκανών στα στελέχη που παράγουν τον πολυσακχαρίτη. Σε ό,τι αφορά τα στελέχη που δεν παράγουν τον PS ο προαναφερόμενος μηχανισμός συμμετέχει μερικώς στην προσκόλληση του S. epidermidis. Ο δεύτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο μεταβάλλεται η έκφραση ορισμένων μακρομορίων του εξωκυττάριου χώρου διότι είναι γνωστό ότι οι πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας συμμετέχουν στην προσκόλληση του S. epidermidis σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα στελέχη S. epidermidis που διέφεραν τόσο ως προς το φαινότυπο όσο και ως προς τον γονότυπο. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν έδειξαν ότι δεν υπάρχουν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση των δύο κύριων πρωτεογλυκανών των ενδοθηλιακών κυττάρων, συνδεκάνης-1 και γλυπικάνης-1, σε κανένα από τα χρονικά διαστήματα που χρησιμοποιήθηκαν. Εντούτοις, τα αποτελέσματα δεν μπορούν να αποκλείσουν τη λειτουργία των πρωτεογλυκανων 202 ως γέφυρες που διευκολύνουν την πρόσδεση και τη μετέπειτα είσοδο του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Έχει δειχθεί ότι το ενδοθήλιο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε περιπτώσεις λοιμώξεων καθώς πραγματοποιείται ενεργοποίηση της έκφρασης ενός ευρέως φάσματος μορίων προσκόλλησης και εξωκυττάριου χώρου. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν και αξιολογήθηκαν τα ειδικά προφίλ έκφρασης τέτοιων μορίων μέσω Real-Time PCR, ELISA, ανοσοφθορισμού και ζυμογραφίας. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι αν και η γενική απόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε περιπτώσεις λοιμώξεων με στελέχη S. epidermidis είναι να αποικοδομήσουν τον εξωκυττάριο χώρο, τα γονίδια που ενεργοποιούνται είναι διαφορετικά και έχουν σχέση με τα στελέχη που χρησιμοποιούνται. Φαίνεται ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα προσπαθούν να μειώσουν τη συνοχή του εξωκυττάριου χώρου έτσι ώστε να διευκολύνουν την μετακίνηση ουδετεροφίλων στο σημείο της λοίμωξης. Μελλοντικές μελέτες στις οποίες θα χρησιμοποιηθούν γενετικά τροποποιημένα βακτηριακά στελέχη σε συν-καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων με μακροφάγα ή μονοκύτταρα θα διευκρινήσουν τις αλληλεπιδράσεις που πραγματοποιούνται in vivo. / The use of intravenous catheters and other medical implanted devices is synonymous to Staphylococcus epidermidis infections. The ability of the specific microorganism to cause infections is directly related to its ability to form biofilms. Some of the mechanisms and molecules participating in the formation of biofilm have been elucidated. Our research group has isolated an acidic, sulfated polysaccharide (20-kDa PS or PS) that appear to be the main antigenic component of S. epidermidis extracellular mucous layer. Antibodies against this polysaccharide protect from staphylococcal keratitis, neonate bacteremia and discriminate S. epidermidis strains from other CoNS. In the present dissertation one of the major goals was to evaluate the role of PS in S. epidermidis’ adherence to human endothelial cells. A PS reference strain (ATCC35983) and a non-PS producing clinical strain were used. Results obtained showed that PS facilitates S. epidermidis’ adherence to endothelial cells in a dose dependent manner. Although the fine mechanism for such a binding is not as yet clear, it may be correlated with the staphylococcal binding through glycasaminoglycan chains at least for the strains that produce this polysaccharide. As long as the non-PS producing strains are concerned the involvement of the above mentioned mechanism has partial contribution to S. epidermidis adherence. Considering that cell surface proteoglycans are involved in S. epidermidis adherence to endothelial cells, the second major goal of this study was to examine whether gene expression of certain matrix biomacromolecules is modified in S. epidermidis infected endothelial cells as compared to non-infected ones. Four different phenotypically and genotypically strains were used. Results show no significant difference in expression of two main cell-surface proteoglycans, syndecan-1 and glypican-1, in all time points and for all strains used. These results, however, cannot exclude that proteoglycans may be the bridge facilitating S. epidermidis adherence and subsequently invasion to endothelial cells. It has been established that endothelium plays a crucial role in inflammation. This is achieved by the consequent expression of a wide variety of adhesion and extracellular matrix molecules. In the present study, the specific expression profile of such molecules was also evaluated using Real-Time PCR, ELISA, immunofluorescence and zymography. Obtained results indicate that, even though the general reaction of endothelial cells is to disintegrate the structure of the extracellular matrix, the genes activated are different with respect to the 204 strains that were used. It seems that the endothelial cells’ effort to decrease the extracellular matrix cohesion is a way to facilitate migration of macrophages at the site of infection. Future studies using genetically modified bacterial strains in cocultures of endothelial cells with macrophages or monocytes will elucidate the interactions that actually happen in vivo.

Η κατανόηση των φαινομένων που λαμβάνουν χώρα κατά την αλληλεπίδραση κυττάρου βιοϋλικού και η συσχέτιση μηχανικών παραμέτρων του κυττάρου με πολύπλοκες διεργασίες στο εξωκυττάριο (ECM) περιβάλλον οδηγεί το μέλλον στο σχεδιασμό των βιοϋλικών. Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση της προσκόλλησης και των μεταβολών των μηχανικών ιδιοτήτων οστεοβλαστών στους αρχικούς χρόνους προσκόλλησης σε υπόστρωμα του βιοπολυμερούς χιτοζάνης. Η προετοιμασία υποστρωμάτων χιτοζάνης έγινε με ομοιοπολική πρόσδεση του βιοπολυμερούς σε επιφάνεια γυαλιού (επιφάνεια ελέγχου). Με φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίων από ακτίνες Χ επιβεβαιώθηκε η μεταβολή της επιφανειακής χημικής σύστασης. Η μέση επιφανειακή τραχύτητα, με χρήση Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης, βρέθηκε 4 φορές μεγαλύτερη στη χιτοζάνη σε σύγκριση με το γυαλί, ενώ η μέση γωνία διαβροχής ήταν περίπου 3 φορές μεγαλύτερη στη χιτοζάνη. Ο αριθμός και η μέση επιφάνεια εξάπλωσης των προσκολλημένων κυττάρων, προσδιορίστηκαν από φωτογραφίες ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου σάρωσης και χρήση λογισμικού ανάλυσης εικόνας. Μέχρι τα 30 λεπτά, ο αριθμός ήταν μεγαλύτερος στη χιτοζάνη, ενώ μετά τα 45 λεπτά, στο γυαλί. Σε όλους τους χρόνους, η μέση επιφάνεια εξάπλωσης ήταν μεγαλύτερη στη χιτοζάνη. Για την ποσοτικοποίηση της προσκόλλησης, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροπιπέττας σε πειράματα αποκόλλησης μεμονωμένων οστεοβλαστών. Υπολογίστηκε η “ώθηση αποκόλλησης”, I, ως το ολοκλήρωμα της εφαρμοζόμενης δύναμης στο χρόνο (I=SFdt) για την πλήρη αποκόλληση ενός κυττάρου και βρέθηκε στατιστικά μεγαλύτερη στη χιτοζάνη σε όλους τους χρόνους. Με την τεχνική Ποσοτικής Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης, η έκφραση των γονιδίων ιντεγκρινών αν, α4, β1 και β3 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στη χιτοζάνη από τα 30 στα 120 λεπτά. Με συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης στη χιτοζάνη στα 30 και στα 120 λεπτά. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροπιπέττας σε πειράματα εφελκυσμού και ερπυσμού των οστεοβλαστών και υπολογίστηκαν οι μεταβολές του μέτρου Young, Ε, και του φαινόμενου ιξώδους, η. Οι μέσες τιμές βρέθηκαν αυξημένες στην πορεία της προσκόλλησης στις δύο επιφάνειες, παρουσιάζοντας υψηλότερες τιμές στη χιτοζάνη. Η παρούσα διατριβή είναι μια ολοκληρωμένη φαινομενολογική προσέγγιση της μηχανικής συμπεριφοράς της οστεοβλάστης κατά την προσκόλληση. Η προσκόλληση στη χιτοζάνη συνοδεύεται από μεταβολές στη μηχανική συμπεριφορά και συνδέεται με κρίσιμες βιοχημικές διεργασίες. / The understanding of the phenomena that take place during cell-biomaterial interaction and the correlation of cell mechanical parameters with complicated processes at the extracellular environment (ECM) is driving the future of biomaterial design. The aim of the present study was the investigation of attachment and of alterations of mechanical properties of osteoblasts during the initial phase of attachment on chitosan biopolymer substrate. The preparation of the chitosan substrates was done with covalent immobilization of the biopolymer on glass surface (control substrate). X-Ray photolelectron spectroscopy confirmed the alteration of the surface chemical composition. Mean surface roughness, as measured by Atomic Force Microscopy, was increased 4-fold compared to glass, while the mean contact angle was found 3 times higher on chitosan substrate. The mean number and spreading area of the attached cells, were determined by Scanning Electron Microscopy images and the use of image processing program. Up to 30 minutes, the number of attached cells was higher on chitosan, while after 45 minutes, it was on glass. At all time points, the mean spreading area was greater on chitosan. To quantify attachment, the micropipette aspiration technique was used at experiments of detachment of individual osteoblasts. The ‘’detachment impulse’’, I, was calculated, as the integral of the applied force at time required (I=SFdt) for complete detachment of one cell, and it was found statistically higher on chitosan at all attachment times. With the quantified Polymerase Chain Reaction, the αν, α4, β1 and β3 gene integrin expression was found significantly increased from 30 to 120 minutes of attachment on chitosan. Using confocal scanning microscopy, higher expression of focal adhesion kinase was observed on chitosan at 30 and 120 minutes of attachment. Additionally, the micropipette aspiration technique was used at stretching and creep experiments so as to calculate the alterations of cell’s Young modulus, E, and apparent viscosity, η. Mean values were increased at the course of spreading for both surfaces, demonstrating greater values on chitosan. The present study is a complete phenomenological approach of the mechanical behavior of osteoblasts during attachment. Attachment on chitosan is accompanied by alterations of the mechanical behavior and is associated with critical biochemical processes.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Η βιολογική απομάκρυνση του αζώτου μέσω της νιτροποίησης και της απονιτροποίησης είναι οι διεργασίες οι οποίες χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία των αστικών και των βιομηχανικών υγρών αποβλήτων καθώς και για την προεπεξεργασία του πόσιμου νερού. Η νιτροποίηση (βιολογική οξείδωση της αμμωνίας) υλοποιείται από δύο διαφορετικές κατηγορίες αυτότροφων βακτηριών. Η πρώτη ομάδα (νιτρωδοποιητές) μετατρέπει την αμμωνία ( + 4 NH ) σε νιτρώδη ( − 2 NO ) και στη συνέχεια η δεύτερη ομάδα, οι νιτρικοποιητές, οξειδώνει περαιτέρω το ενδιάμεσο προϊόν σε νιτρικά. Η απονιτροποίηση είναι η βιολογική διεργασία, η οποία ευθύνεται για την απομάκρυνση του αζώτου με τη μορφή των νιτρικών και/ή νιτρωδών από τα απόβλητα με μετατροπή σε αέριο άζωτο. Τα τελευταία χρόνια, γίνεται σημαντική ερευνητική προσπάθεια για να παρακαμφθεί το στάδιο της νιτρικοποίησης. Είναι επιθυμητό η αμμωνία να οξειδώνεται σε νιτρώδη και μετά απευθείας να λαμβάνει χώρα η απονιτροποίηση, παρά να γίνεται πρώτα η μετατροπή σε νιτρικά στα συστήματα απομάκρυνσης αζώτου. Θεωρητικά εξοικονομείται περίπου 25% σε δέκτη ηλεκτρονίων (οξυγόνο) και 40% σε δότη ηλεκτρονίων, ενώ επίσης ο ρυθμός απονιτροποίησης αυξάνεται κατά 63% με μικρότερη παραγωγή βιομάζας για κάθε μονάδα αζώτου που απομακρύνεται, πράγμα το οποίο είναι πολύ ελκυστικό από οικονομικής πλευράς, καθώς μειώνεται αρκετά το κόστος λειτουργίας της διεργασίας. Η παράκαμψη αυτή συνήθως επιτυγχάνεται ρυθμίζοντας κατάλληλα τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου, το pH και τη θερμοκρασία. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εξεταστεί το φαινόμενο «υστέρησης» που παρουσιάζουν οι νιτρικοποιητικοί μικροοργανισμοί εξαιτίας της μετάβασης από ανοξικές σε αερόβιες συνθήκες. Επίσης το συγκεκριμένο φαινόμενο μοντελοποιήθηκε για τη διεργασία της νιτροποίησης για (α) ένα αντιδραστήρα συνεχούς λειτουργίας (CSTR) στον οποίο λάμβανε χώρα ανάπτυξη βιομάζας τόσο στον υγρό όγκο όσο και στα τοιχώματα του αντιδραστήρα (προσκολλημένη) και (β) σε αντιδραστήρες διαλείποντος έργου. Με σκοπό να παρακαμφθεί η νιτρικοποίηση χρησιμοποιήθηκε ένας αντιδραστήρας διαλείποντος έργου (SBR) για να προσομοιωθεί η διεργασία της νιτροποίησης λαμβάνοντας υπόψη το φαινόμενο υστέρησης των νιτρικοποιητικών βακτηρίων. Η προσομοίωση αυτή έδειξε ότι είναι δυνατό να παρακαμφθεί η νιτρικοποίηση χρησιμοποιώντας 3 ζεύγη αερόβιας – ανοξικής φάσης, με συνολική διάρκεια κάθε φάσης 4.5 και 5.5 ωρών αντίστοιχα, επιτυγχάνοντας ταυτόχρονα σχεδόν πλήρη απομάκρυνση του αζώτου. Οι μονάδες βιολογικής επεξεργασίας των υγρών αποβλήτων γίνονται συχνά δέκτες αρκετών ξενοβιοτικών ουσιών, τα οποία πρέπει να επεξεργαστούν ταυτόχρονα με τα αστικά απόβλητα προτού εναποτεθούν στους υδάτινους αποδέκτες. Η παρουσία αυτών των ουσιών στις εισροές των βιολογικών καθαρισμών είναι πιθανόν παρεμποδιστικός παράγοντας για ευαίσθητες βιολογικές διεργασίες όπως η νιτροποίηση. Παρεμπόδιση αυτής της διεργασίας, μπορεί κάτω από ανεξέλεγκτες συνθήκες να οδηγήσει σε αποτυχία της βιολογικής απομάκρυνση αζώτου. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η τυχόν παρεμπόδιση 12 ξενοβιοτικών ουσιών σε (α) νιτρωδοποιητικά βακτήρια και (β) νιτρικοποιητικά βακτήρια τα οποία είχαν απομονωθεί από την ενεργό ιλύ. Από τα πειράματα αυτά προέκυψαν αξιοσημείωτα φαινόμενα παρεμπόδισης για κάποιες από τις εξεταζόμενες ουσίες. Η συγκεκριμένη παρεμπόδιση μοντελοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το μη – ανταγωνιστικό μοντέλο παρεμπόδισης. / In the recent years significant research effort has been spent in bypassing the nitrification process. It is beneficial if ammonium is oxidized to nitrite and is thereafter directly denitrified rather than first being converted to nitrate in biological nitrogen removal systems. the bypass is often accimplished by changing the concentration of the dissolved oxygen, the pH and the temperature. The aim of this work was to examine the \"delay\" effect exhibited by nitrite oxidezers during the transition from anoxic to aerobic conditions. Furthermore, this effect was modeled for the nitrification process that took place in a)a continuously stirred tank reactor (CSTR) and b)in batch reactors. In order to bypass nitrification, a system called Sequencing Batch Reactor (SBR) was used to simulate the nitrification process by taking into account the delay effect of nitrite oxidizers. Sewage Treatment Plants (STPs) are usual receptors of xenobiotic compounds which may inhibit biological processes such as nitrification irrevesibly. This work also examined the possible inhibitory effect of twelve xenobiotic compounds an a)a mixed culture of autotrophic ammonium-oxidizing bacteria and b)nitrite-oxidizing bacteria isolated from activated sludge.

Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα που προκύπτουν από την χρήση εμφυτευμάτων και ιατρικών συσκευών και που εμποδίζουν την μακροχρόνια χρήση τους είναι η εμφάνιση νοσοκομειακών σηψαιμικών επεισοδίων σχετιζόμενων με λοιμώξεις που προκαλούνται από πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους, και κυρίως από τον S. epidermidis. Με δεδομένο ότι η εκτεταμένη χορήγηση αντιβιοτικών έχει οδηγήσει στην επικράτηση πολυανθεκτικών βακτηριακών στελεχών της φυσιολογικής χλωρίδας, η κατασκευή αντιβακτηριακών ή και βακτηριοστατικών βιοϋλικών κρίνεται επιβεβλημένη. Για το σκοπό αυτό απαραίτητη είναι η μελέτη και η κατανόηση του μηχανισμού προσκόλλησης των βακτηρίων στην επιφάνεια του βιοϋλικού. Στην κατεύθυνση αυτή διερευνήθηκε η επίδραση των φυσικοχημικών αλληλεπιδράσεων βακτηρίων-υλικών, του ρυθμού διάτμησης και της σχετικής συνεισφοράς τους στην ικανότητα των βακτηρίων να προσκολλώνται στην επιφάνεια του βιοϋλικού αλλά και να ενεργοποιούν τα γονίδια ica που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή της εξωκυττάριας βλεννώδους ουσίας (slime) και συγκεκριμένα μιας πολυσακχαρικής φύσεως προσκολλητίνης (polysaccharide intercellular adhesin, PIA). Για τη μελέτη αυτή τροποιήθηκαν επιφανειακά με τεχνικές πλάσματος υπάρχοντα βιοϋλικά, παρασκευάστηκαν αυτό-οργανούμενα μονοστρωματικά συστήματα σε γυαλί και χαρακτηρίστηκαν φυσικοχημικά. Ελέγθηκε επίσης εάν οι θεωρίες κολλοειδών συστημάτων, και συγκεκριμένα η θερμοδυναμική, η DLVO και η εκτεταμένη DLVO μπορούν να εξηγήσουν τα πειραματικά αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βακτηριακή προσκόλληση μειώνεται με την αύξηση της επιφανειακής ενέργειας και του πολικού χαρακτήρα των υλικών, ενώ δεν επηρεάζεται σημαντικά από το μη πολικό τους χαρακτήρα. Η θερμοδυναμική θεωρία εξήγησε ικανοποιητικά τα αποτελέσματα για υψηλής ιοντικής ισχύος διαλύματα, ενώ η DLVO για χαμηλής. Η εκτεταμένη DLVO θεωρία εξήγησε ικανοποιητικά την επίδραση της φυσικοχημείας τόσο του διαλύματος όσο και της επιφάνειας στη βακτηριακή προσκόλληση. Η αύξηση του ρυθμού διάτμησης μείωσε την προσκόλληση των βακτηρίων με τρόπο που εξαρτώνταν από τις φυσικοχημικές αλληλεπιδράσεις βακτηρίων-υλικών, ενώ παράλληλα μείωσε την προβλεψιμότητα των παραπάνω θεωριών. Επομένως, η βακτηριακή προσκόλληση θεωρήθηκε ως αποτέλεσμα του συνδιασμού φυσικοχημικών αλληλεπιδράσεων και σχηματισμού μακρομοριακών δεσμών. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων ica έδειξαν ότι η έκφρασή τους αυξάνεται με την μείωση της επιφανειακής ενέργειας του υλικού και την αύξηση του ρυθμού διάτμησης. / One of the major problems arising from the use of implants and medical devices and impeding their long-term use is the emergence of nosocomial septic incidents related to infections caused by Coagulase negative staphylococci, most notably by S. epidermidis. The extensive use of antibiotics has resulted in multi-resistant bacterial strains of normal flora, making the need for developing antibacterial biomaterials of great importance. For this purpose it is necessary to study and understand the mechanism of bacterial adhesion to the surface of biomaterials. In this direction, we investigated the influence of the physicochemical interactions between bacteria and materials, the shear rate and their relative contribution on the ability of bacteria to adhere to the biomaterial surface and to activate the ica genes, which are responsible for the production of extracellular polymeric (slime), and in particular for the production of polysaccharide intercellular adhesin (PIA), that mediates cell-cell interactions. For this study, the surface of existing biomaterials was modified by plasma methods, self-assembled monolayers were prepared on glass, and the materials were physicochemicaly characterized. The applicability of the colloidal theories, such as the thermodynamic, the DLVO and the extended DLVO, for the prediction of bacterial adhesion was examined as well. The results showed that the increase in material surface energy and its polar component reduced bacterial adhesion, whereas adhesion was not significantly influenced by the non-polar character of the material surface. The thermodynamic theory explained satisfactorily the results for high ionic strength solutions, while DLVO for solutions with low ionic strength. The extended DLVO theory explained well the effects of both the solution and material surface properties to bacterial adhesion. The increase in shear rate reduced the number of adherent bacteria in a manner that depended on the bacteria-material physicochemical interactions, but not in the way that the above theories predicted. Therefore, bacterial adhesion considered as the result of a combination of the physicochemical and hydrodynamic interactions, and the formation of macromolecular bonds. The investigation of ica genes expression showed that the expression enhanced by the decrease in the material surface energy the increase in shear rate.

Ο S. epidermidis αποτελεί κύριο μέλος της χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων του ανθρώπου, ενώ συνιστά ένα από τα συχνότερα παθογόνα που προκαλούν νοσοκομειακές λοιμώξεις, ιδιαίτερα σε ανοσοκατασταλμένους ή ασθενείς φέροντες προσθετικά υλικά. Κύριος λοιμογόνος παράγοντας του S. epidermidis είναι ο σχηματισμός βιομεμβράνης. Διάφοροι πολυσακχαρίτες έχουν απομονωθεί από την εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis και έχουν συσχετισθεί με το σχηματισμό βιομεμβράνης καθώς και με την παθογόνο δράση τους. Ο πλέον μελετημένος και εδραιωμένος είναι ο ΡΙΑ, ενώ οι άλλοι πολυσακχαρίτες (PS/A ή PNSG ή PNAG και το SSA) απεδείχθησαν τελικώς ότι είναι ταυτόσημοι ή χημικώς ανάλογοι του ΡΙΑ. Ο ΡΙΑ είναι μία ομογλυκάνη αποτελούμενη από μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό και η σύνθεσή του ελέγχεται από ένζυμα που κωδικοποιούνται από τον icaADBC γενετικό τόπο. Η εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis περιέχει επίσης έναν πολυσακχαρίτη, τον 20-kDaPS, ο οποίος απομονώθηκε από ερευνητές του Πανεπιστημίου Πατρών και αποτελείται κυρίως από γλυκόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, και είναι μερικώς θειωμένος. Ο 20-kDaPS αντιορός αναστέλλει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την εμφάνιση βακτηριακής κερατίτιδας σε κουνέλια. Με βάση αναλύσεις κλινικών στελεχών, ο 20-kDaPS εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στελεχών S. epidermidis, ενώ δεν ανευρέθηκε σε στελέχη άλλων πηκτάση αρνητικών σταφυλοκόκκων. Η παρεμβολή αλληλουχιών εισδοχής σε διάφορα σημεία του icaADBC οπερονίου, το οποίο ελέγχει τη σύνθεση του ΡΙΑ, δεν παρεμβάλλεται στην έκφραση του 20-kDaPS. Η κατεργασία βακτηριακών κυττάρων S. epidermidis με το ένζυμο dispersin B, το οποίο διασπά ειδικά τον β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό που συνθέτει το πολυμερές του ΡΙΑ, και με μετα-περιοδικό νάτριο που διασπά το δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα C-3 και C-4 των μονομερών Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, οδηγεί σε διάσπαση της βιομεμβράνης, χωρίς όμως να διαφοροποιείται αντιγονικά ο 20-kDaPS. Τα κλάσματα, μετά την έκλουση της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis από στήλη Q-Sepharose, που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ανοσοδραστικότητα για τον ΡΙΑ, στερούνται πλήρως 20-kDaPS. Η προεπώαση κλινικού στελέχους που δεν εκφράζει τον 20-kDaPS με τον πολυσακχαρίτη αναστέλλει την ενδοκυττάρωση, ενώ η προεπώαση του πρότυπου στελέχους ATCC35983 που συνθέτει τον 20-kDaPS με ειδικό αντιορό ενισχύει την ενδοκυττάρωση από τα ανθρώπινα μακροφάγα. Κατά συνέπεια, ο icaADBC γενετικός τόπος δεν εμπλέκεται στη σύνθεση του 20-kDaPS. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του PIA και του 20-kDaPS είναι διακριτές. Ο 20-kDaPS πιθανό να επιδεικνύει αντιφαγοκυτταρική δράση, ενώ τα ειδικά αντισώματα έχουν δράση οψωνίνης. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεμβράνης προστατεύει από τις αντιμικροβιακές ουσίες και το σύστημα ανοσίας. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης περιέχουν στην εξωκυττάρια ουσία τους μεγαλύτερα ποσά ΡΙΑ από τα ελεύθερα αναπτυσσόμενα, πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επιδεικνύουν μεγαλύτερη ικανότητα για προσκόλληση και επιβίωση εντός των ανθρώπινων μακροφάγων από τα πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επάγουν την παραγωγή μικρότερων ποσών φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFα, καθώς και Th1 κυτταροκινών, όπως οι IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, ενώ ενισχύουν τις IL-8, GM-CSF και IL-13. Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις αφορούν ζωντανά βακτηριακά κύτταρα καθώς και βακτηριακά κύτταρα μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη. Τα ανωτέρω δεδομένα συνάδουν με την ήπια συμπτωματολογία των σχετιζόμενων με βιομεμβράνη λοιμώξεων S. epidermidis και τη διαφυγή της επιτήρησης του ανοσολογικού συστήματος. Συμπερασματικά, ο 20-kDaPS αποτελεί κύριο συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis με αντιφαγοκυτταρικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του 20-kDaPS είναι πλήρως διακριτές του ΡΙΑ, του κύριου πολυσακχαρίτη που σχετίζεται με το σχηματισμό βιομεμβράνης, ενώ ο γενετικός τόπος icaADBC δε ρυθμίζει τη σύνθεση του 20-kDaPS. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεβράνη εξασφαλίζει αντίσταση στην ενδοκυττάρια θανάτωσή τους από τα μακροφάγα και καταστολή της ανοσιακής απόκρισης. / The skin commensal and opportunistic pathogen Staphylococcus epidermidis is a leading cause of hospital-acquired and biomaterial-associated infections. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA), a homoglycan composed of β-1,6-linked N-acetylglucosamine residues, synthesized by enzymes encoded by the icaADBC operon is a major functional factor in biofilm accumulation, promoting virulence in experimental biomaterial-associated S. epidermidis infections. Extracellular mucous layer extracts of S. epidermidis contain another major polysaccharide, referred to as 20-kDa polysaccharide (20-kDaPS), composed mainly out of glucose, N-acetylglucosamine, and being partially sulfated. 20-kDaPS antiserum prevents adhesion of S. epidermidis on endothelial cells and development of experimental keratitis in rabbits. Here we provide experimental evidence that 20-kDaPS and PIA represent distinct molecules and that 20-kDaPS is implicated in endocytosis of S. epidermidis bacterial cells by human monocyte-derived macrophages. Analysis of 75 clinical coagulase-negative staphylococci from blood-cultures and central venous catheter tips indicated that 20-kDaPS is expressed exclusively in S. epidermidis but not in other coagulase-negative staphylococcal species. Tn917-insertion in various locations in icaADBC in mutants M10, M22, M23, and M24 of S. epidermidis 1457 are abolished for PIA synthesis, while 20-kDaPS expression appears unaltered as compared to wild-type strains using specific anti-PIA and anti-20-kDaPS antisera. While periodate oxidation and dispersin B treatments abolish immuno-reactivity and intercellular adhesive properties of PIA, no abrogative activity is exerted towards 20-kDaPS immunochemical reactivity following these treatments. PIA polysaccharide I-containing fractions eluted from Q-Sepharose were devoid of detectable 20-kDaPS using specific ELISA. Preincubation of non-20-kDaPS-producing clinical strains with increasing amounts of 20-kDaPS inhibits endocytosis by human macrophages, whereas, preincubation of 20-kDaPS-producing strain ATCC35983 with 20-kDaPS antiserum enhances bacterial endocytosis by human macrophages. In conclusion, icaADBC is not involved in 20-kDaPS synthesis, while the chemical and chromatographic properties of PIA and 20-kDaPS are distinct. 20-kDaPS exhibits anti-phagocytic properties, whereas, 20-kDaPS antiserum may have a beneficial effect on combating infection by 20-kDaPS-producing S. epidermidis. As stated above, biofilm formation is a major virulence factor of S. epidermidis. Biofilm protects bacterial cells from antimicrobial agents and components of the immune system. Interactions of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages with planktonic or biofilm phase S. epidermidis cells were also studied. Biofilm phase bacteria exhibited higher attachment, as well as, a ten fold higher intracellular survival in monocyte-derived macrophages than their planktonic counterparts. Stimulation of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages was performed with live or formalin-fixed bacterial cells. Supernatant concentration of selected cytokines was measured by Luminex® xMAP™ technology at different time points. As compared to planktonic phase, biofilm phase bacteria elicited lower amounts of proinflammatory cytokines and Th1 response cytokines, such as TNFα, IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, whereas, they enhanced production of IL-8, GM-CSF and IL-13. This phenomenon was independent of formalin pretreatment. Taken together, these results may contribute to interpretation of observed silent course of biofilm associated infections. In conclusion, 20-kDaPS represents a major component of S. epidermidis extracellular matrix and data show that 20-kDaPS posseses antiphagocytic and immunomodulatory properties. 20-kDaPS and PIA are immunochemically and chromatographically discrete molecules, whereas icaADBC locus is not involved in 20-kDaPS synthesis. Biofilm mode of growth ensures higher resistance rates to intracellular killing and down regulation of immune responses.