Η αδειοδότηση της αντιγραφής αποτελεί μία ιδιαίτερα σημαντική διαδικασία, η οποία λαμβάνει χώρα στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής με το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου, που περιλαμβάνει το ORC, το Cdc6, το Cdt1 καθώς και τις MCM 2-7. Η συγκεκριμένη διαδικασία, πραγματοποιείται μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο, κατά τη μετάβαση από την M φάση στη G1. Οι παράγοντες που συμμετέχουν υπόκεινται σε εκτεταμένη ρύθμιση προκειμένου να εξασφαλιστεί η απουσία επαναντιγραφής και γονιδιωματικής αστάθειας. Η πρωτεόλυση μορίων που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς που χρησιμοποιούν τα κύτταρα για τη ρύθμιση των επιπέδων διαφόρων παραγόντων. Το CRL4Cdt2 αποτελεί μία Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης, η οποία είναι επιφορτισμένη με τη ρύθμιση των επιπέδων του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 κατά την S φάση καθώς και μετά από βλάβες στο γενετικό υλικό. H συγκεκριμένη διαδικασία έχει διαπιστωθεί πως λαμβάνει χώρα σε όλα τα μετάζωα, καθώς και στον σχιζοσακχαρομύκητα. Μεταξύ των υποστρωμάτων του Cdt2 περιλαμβάνονται επίσης το Set8 και το p21. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, πραγματοποιήθηκε μελέτη των περιοχών της πρωτεΐνης Cdt2 που είναι υπεύθυνες για τη στρατολόγηση της στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης στο γενετικό υλικό. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε καρκινικά κύτταρα MCF7 που υπέστησαν εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό με UV-C ακτινοβόληση και χρήση ειδικών πολυκαρβονικών φίλτρων με μικροπόρους. Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν φορείς που εκφράζουν το αμινο-τελικό (2-417αα) και το καρβοξυ-τελικό (390-730αα) άκρο της πρωτεΐνης, καθώς και ένα μετάλλαγμα ολόκληρης της πρωτεΐνης όπου 6 SQ θέσεις που εντοπίζονται καρβοξυ-τελικά έχουν μεταλλαχθεί σε αλανίνες και δεν μπορούν να φωσφορυλιωθούν από τις ATM/ATR κινάσες. Μετά τη διεξαγωγή των πειραμάτων συσσώρευσης, διαπιστώθηκε πως στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης στρατολογούνται μόνο το Cdt2 6A(SQ) και Cdt2 (390-730). Ωστόσο, η συσσώρευση τους παρουσιάζεται ελαφρώς ασθενέστερη σε σχέση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου. Η συγκεκριμένη παρατήρηση καταδεικνύει πως στην περίπτωση του Cdt2 6A(SQ) η φωσφορυλίωση στις συγκεκριμένες SQ θέσεις είναι σημαντική για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης στην περιοχή της βλάβης. Η στρατολόγηση του Cdt2 (390-730) στην περιοχή της βλάβης, συνιστά μία σημαντική παρατήρηση, η οποία υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη Cdt2 διατηρεί την ικανότητα συσσώρευσης στην περιοχή της βλάβης, παρά την απουσία των αλληλουχιών που βρίσκονται στο αμινο-τελικό άκρο και συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση με τα υποστρώματα αλλά και στο σχηματισμό του συμπλόκου της λιγάσης. Προκειμένου να μελετηθεί η κινητική στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης των μεταλλαγμάτων που παρουσιάζουν συσσώρευση, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (FRAP). Τα αποτελέσματα, κατέδειξαν πως τόσο στα κύτταρα χωρίς βλάβη, αλλά και σε αυτά με εντοπισμένη βλάβη υπάρχει παρόμοια κινητική μεταξύ της πρωτεΐνης αγρίου τύπου και των δύο μεταλλαγμάτων. Έτσι, η ύπαρξη μεταλλάξεων σε 6 SQ θέσεις στην περίπτωση του Cdt2 6A(SQ), αλλά και η απώλεια των αμινοτελικών αλληλουχιών στο Cdt2 (390-730) δεν μεταβάλλουν την κινητική στην περιοχή της βλάβης. Τέλος, έγινε μελέτη της συμβολής της φωσφορυλίωσης από τις ATM/ATR κινάσες, στη συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης. Γι’ αυτό το λόγο έγινε χρήση της καφεΐνης, που αποτελεί αναστολέα των συγκεκριμένων κινασών. Τα αποτελέσματα, κατέδειξαν πως υπάρχει πολύ ασθενέστερη συσσώρευση στη συγκεκριμένη περίπτωση σε σχέση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου και το Cdt2 6A(SQ). Με αυτό τον τρόπο υποδεικνύεται πως η φωσφορυλίωση σε όλες τις SQ θέσεις του μορίου, είναι σημαντική για τη συσσώρευση του στην περιοχή της βλάβης. / Replication licensing is a crucial process which takes place at the origins of replication. It involves the formation of the pre-replicative complex consisting of ORC, Cdc6, Cdt1 and MCM 2-7. This process takes place during the late M to early G1 transition and happens only once per cell cycle. The tight regulation of the factors that participate in replication licensing prevents rereplication and genomic instability. Proteolysis is a central mechanism of the cell cycle which is important for the regulation of several factors. CRL4Cdt2 is an E3 ubiquitin ligase important for the regulation of the licensing factor Cdt1 during S phase and post DNA damage. It is known that the ubiquitination of Cdt1 by Cdt2 happens in all metazoans and in fission yeast. Set8 and p21 are also substrates of Cdt2. In this study, we investigated the domains of Cdt2 which are important for its recruitment at sites of localized DNA damage. To this end, we employed MCF7 cancer cells which were UV irradiated with polycarbonate filters with micropores. We used plasmids containing N-terminal (2-417aa) and C-terminal (390-730aa) constructs of the protein and a mutant of the entire protein containing alanine substitutions in 6 SQ sites located at the C-terminus of the protein which cannot be phosphorylated by the ATM/ATR kinases. The recruitment experiments indicated that only in the case of Cdt2 (390-730) and Cdt2 6A(SQ) there is recruitment at the site of localized DNA damage. However the recruitment in both cases was weaker compared to the wild type protein. In the case of Cdt2 6A(SQ) this observation indicates the importance of the phosphorylation of the six SQ sites for the recruitment of the protein at the site of damage. Cdt2 (390-730) recruitment indicates that Cdt2 can still get recruited at the site of damage even though it lacks motifs important for the recognition of the substrate and the formation of the ligase complex. In order to study the kinetics of the protein constructs that exhibit recruitment at the site of localized DNA damage we employed Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). The results showed that the kinetics of the constructs were similar to the wild type in undamaged cells and in cells with localized damage. This shows that the lack of phosphorylation of 6 SQ sites of Cdt2 6A(SQ) and the loss of the N-terminal motifs of Cdt2 (390-730) are not sufficient to cause any difference in the kinetics at the site of damage. Finally, we wanted to investigate the importance of the phosphorylation by the ATM/ATR kinases for the recruitment of Cdt2 at the sites of localized DNA damage. To this end, we employed the ATM/ATR inhibitor caffeine and we tracked the recruitment at the site of damage. The results showed that the recruitment was weaker compared to the wild type Cdt2 and the Cdt2 6A(SQ). This indicates the importance of the phosphorylation of the 9 SQ sites across the protein for the recruitment at the site of damage.

Η αδειοδότηση της αντιγραφή του DNA συνίσταται στη συγκρότηση προαντιγραφικών συμπλόκων στη χρωματίνη, στα οποία μετέχουν οι πρωτεΐνες ORC, Cdt1, Cdc6 και MCM2-7. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται μετά από βλάβη στο DNA και ενδέχεται να συνδέει το σύστημα αδειοδότησης και το σύστημα απόκρισης σε βλάβη στο DNA. Στη διδακτορική αυτή διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης και απόκρισης σε βλάβη στο DNA με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας σε ανθρώπινα κύτταρα, εστιάζοντας στους παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και MCM4. Ο παράγοντας Cdt1 μελετήθηκε μετά από καθολική και εντοπισμένη έκθεση ανθρώπινων κυττάρων σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Δείχθηκε ότι ακτινοβόληση με UV οδηγεί στην αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Ο χρόνος αποικοδόμησης της πρωτεΐνης Cdt1 όμως διαφοροποιείται σημαντικά ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και συγκεκριμένα παρουσιάζει καθυστέρηση στην κυτταρική σειρά καρκινώματος μαστού MCF7 σε σχέση με άλλες καρκινικές σειρές (HeLa, U2OS) και φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Μελέτη της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο μετά από εντοπισμένη ακτινοβόληση μιας μικρής υποπεριοχής του πυρήνα έδειξε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία πριν από την αποικοδόμηση της. Παράλληλα, παρατηρήθηκε συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης από UV των πρωτεϊνών PCNA, Cdt2 (συστατικό του Cul4-DDB1Cdt2 συστήματος ουβικουιτίνωσης, που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1), καθώς και της πρωτεΐνης p21 που στοχεύεται από το ίδιο σύστημα. Πειράματα επαναφοράς φθορισμού σε ζωντανά κύτταρα (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) έδειξαν ότι στις περιοχές εντοπισμένης ακτινοβόλησης με UV οι πρωτεΐνες Cdt1, Cdt2, PCNA και p21 εμφανίζουν τροποποιημένη κινητική συμπεριφορά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ανέδειξαν έναν ανασταλτικό ρόλο για το Cdt1 στο μονοπάτι επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων με ομόλογο ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια της G1 φάσης. Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, εισάγαμε μια νέα in vivo μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης που στηρίζεται στην εφαρμογή της FRAP τεχνικής σε MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με την πρωτεΐνη MCM4 σημασμένη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (GFP-MCM4). Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς της πρωτεΐνης MCM4 σε ζωντανά κύτταρα και σε πραγματικό χρόνο. Δείχθηκε ότι το σύστημα αναπαράγει τη λειτουργία της ενδογενούς MCM4 πρωτεΐνης και μπορεί να διακρίνει επιτυχώς μεταξύ αδειοδοτημένης και μη κατάστασης. Ακολούθως, το σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας στην αδειοδότηση της χρωματίνης για αντιγραφή. Διαπιστώθηκε ότι επίδραση με υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί σε μείωση του κλάσματος της MCM4 που είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη. Περαιτέρω μέλετη έδειξε ότι η μείωση αυτή παρουσιάζεται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και περιορίζεται στην περιοχή της βλάβης, δείχνοντας ότι αποτελεί εντοπισμένη απόκριση του κυττάρου στην ύπαρξη βλάβης. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή ανέδειξε την αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβη στο DNA και εισήγαγε μια νέα μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Μελετήθηκαν οι παράγοντες του συστήματος αδειοδότησης Cdt1 και MCM4, οι οποίοι αποκρίνονται στη βλάβη στο DNA, με το Cdt1 να παίζει ρόλο στην επιλογή επιδιορθωτικού μηχανισμού μετά από πρόκληση βλάβης διπλών θραύσεων του DNA και την πρωτεΐνη MCM4 να εμφανίζει μειωμένη πρόσδεση στη χρωματίνη στην περιοχή της βλάβης μετά από ακτινοβόληση με UV. / Licensing DNA for replication involves the formation of pre-replicative complexes on chromatin, consisting of the proteins ORC, Cdt1, Cdc6 and MCM2-7. Cdt1 is degraded following DNA damage and this suggests a regulatory crosstalk between DNA licensing and DNA damage response (DDR) systems. Here the molecular interplay between these two systems was studied in human cell cultures. The kinetics of Cdt1 degradation in response to UV irradiation was shown to differ in different human cell lines, exhibiting a delay in MCF7 cells in comparison to HeLa, U2OS and human fibroblasts, which implies a difference in the DDR sensitivity of these cells. By studying the spatial regulation of Cdt1 in response to localized DNA damage, the accumulation of Cdt1 in UV irradiated sites prior to its degradation was recorded. Proteins participating in the degradation of Cdt1 through ubiquitin dependent proteolysis (PCNA and Cdt2), as well as protein p21 which is targeted by the same ubiquitin ligase following DNA damage, were also shown to accumulate at UV irradiated sites. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments showed that Cdt1, Cdt2, PCNA and p21 exhibit altered kinetics at UV irradiated sites. Silencing of Cdt1 expression revealed an inhibitory role of Cdt1 in the repair of double strand breaks through homologous recombination during the G1 phase of the cell cycle. In the second part of this thesis, we introduced an in vivo licensing assay based on FRAP in MCF7 cells stably expressing MCM4 tagged with the Green Fluorescent Protein (GFP). This assay allows the study of the kinetic behaviour of MCM4 in live cells and in real time. A plasmid expressing GFP-MCM4 was constructed and MCF7 cells stably expressing this plasmid were produced. The GFP-MCM4 cell line was further characterized to ensure a correct cell cycle profile, GFP-MCM4 levels, subcellular localization, interactions with other MCM proteins and binding to chromatin. FRAP experiments on the stable GFP-MCM4 cells verified that the assay could successfully distinguish between licensed and unlicensed state. Using this assay, the effect of UV irradiation on MCM4 kinetics was studied. UV irradiation led to a decrease in the fraction of MCM4 binding to chromatin. This effect was more profound in middle G1 phase and was restricted to the site of UV irradiation. In conclusion, this thesis addressed the interaction of DNA licensing and DNA damage response systems and introduced an in vivo DNA licensing assay. Licensing proteins Cdt1 and MCM4 were shown to respond to DNA damage, with Cdt1 affecting the double strand break repair choice pathway and MCM4 exhibiting reduced chromatin binding following UV irradiation.