La thèse porte sur le développement de stratégies non conventionnelles de peptides contraints et la modulation des structures secondaires pour augmenter la reconnaissance biologique de ces peptides.Les peptides jouent un rôle important dans de nombreux processus et sont donc d’un intérêt grandissant pour l’industrie pharmaceutique. Cependant, leur utilisation comme médicament reste limitée à cause de leur flexibilité conformationnelle, leur sensibilité aux protéases et leur faible biodisponibilité et pharmacodynamie. Dans ce contexte, la caractérisation des interactions ligands-récepteurs est cruciale pour comprendre les processus de reconnaissance et le design d’agonistes sélectifs, potentiels nouveaux médicaments. Ainsi, le développement d’outils portant des modifications structurales présente un intérêt grandissant pour trouver de nouveaux médicaments. Ces changements structuraux permettent d’affiner les conformations privilégiées et donc de comprendre la spécificité d’interactions par rapport à des sous-types de récepteurs ayant des propriétés physicochimiques et pharmacologiques particulières.Dans la première partie de ce travail, une stratégie optimisée pour la synthèse de fragments N-terminaux (1-34) de la séquence PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 est décrite : H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. D’un point de vue synthètique, la formation de clusters dus à la présence de plusieurs résidus arginine, l’encombrement stérique, la longueur de la séquence et la présence de résidus hydrophobes dans la partie 19-28 du PTHrP rendent la synthèse difficile et donnent un enjeu important à la synthèse. C’est pourquoi, nous avons focalisé nos efforts sur l’optimisation du protocole opératoire. En particulier, nous avons montré l’intérêt d’utiliser une activation sous microondes pour la synthèse, avantages en termes de rendement et de pureté du peptide. La synthèse de PTHrP(1-34) a été optimisée à la fois sous activation par la temperature et sous microondes dans des conditions identiques. Les micoondes ont aussi été utilisé pour la synthèse de PTHrP(1-34)NH2. L’élongation de la chaine peptidique a été suivie par l’analyse UPLC-ESI-MS des fragments obtenus après micro clivage assisté par micro ondes. Cette stratégie nopus a permis , à travers la caractérisation des séquences délétées, d’identifier les points critiques de la synthèse, nécessitant les microondes. Dans la seconde partie de la thèse, ont été entreprises le design et la synthèse d’une série de cyclopeptides (i-to-i+5) 1,4- et 4,1-disubstitués pontés par un triazole, analogues de MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2 est un super agoniste agissant d’une manière non sélective des récepteurs de la mélanocortine MC1R, MC3R, MC4s, et MC5s. Ce peptide est caractérisé par un lien lactame entre les résidus Asp5 et Lys 10 stabilisant une structure β-turn, cruciale pour l’activité.Cependant MTII n’est pas sélectif des différents sous-type des récepteurs de la mélanocortine. L’importance particulière du système mélanocortine souligne le besoin de trouvé des analogues plus sélectifs, présentant une meilleure pharmacocinétique et une meilleure biodisponibilité. L’introduction du triazole [1,2,3] utilise dans nos analogues vise à stabiliser une conformation , à la place du lien lactame de MTII. La diversité est apportée par une variation de la position du triazole de i à i+5. Il est obtenu par une cycloaddition alcyne/azoture catalysée par le Cu(I) (CuAAC), générant très sélectivement l’adduit 1,4. Les analogues clickés de MTII présentant une position différente du triazole ont été synthétisé en phase solide et en solution. Les études conformationnelles et biologiques ont été conduites pour identifier l’analogue présentant la meilleure conformation β-turn conduisant à la meilleure activité biologique. / PhD Thesis of Chiara TESTANon conventional synthetic strategies of stapled peptides: modulation of secondary structures to optimise biological recognitionPeptides play an important role in many biologically relevant processes and are of outstanding interest in pharmaceutical research. However their use as drugs is limited by their conformational flexibility, instability to proteases, poor oral bioavailability, and pharmacodynamics. In this contest the characterization of ligand-receptor interactions is crucial to understand the biological processes and to design potent and selective agonist, which could be used as new drug candidates.Therefore, the development of an expansive toolbox of structural modifications that can be used to fine tune the predominant conformations to achieve modulation of specificity toward receptor subtypes, physicochemical and pharmacological properties continues to be of great interest in the development of peptide-based drugs.In the first part of the work it is described an optimized strategy for the synthesis of the N-terminal fragments (1-34) of PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 sequence is: H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. Considering the presence of clusters of arginines, sterically hindered and hydrophobic amino acid residues in the 19-28 sequence of PTHrP, and the considerable length of the peptide, the synthesis of PTHrP(1-34)NH2 is quite challenging. Therefore we focused our effort in the optimization of a synthetic protocol for this peptide. In particular, we showed the advantages that the use of microwaves have, in obtaining the best results in terms of yield and purity of the final peptide. The synthesis of PTHrP(1-34) was performed following the conventional RT and the MW-assisted SPPS protocol. In both cases the synthesis was performed using the same instrument, the same excess of reagents and molar ratios.Microwaves have also been used to monitor the synthesis of the peptide PTHrP(1-34)NH2. In fact, during the elongation of the peptide chain were analyzed by UPLC-ESI-MS intermediate fragments obtained through micro-cleavages assisted by microwaves. This strategy has allowed us, through the characterization of sequences of deletion, to understand what are the critical points of the synthesis that may require the use of microwaves.In the second part of the thesis we reported the design and the synthesis of a series of (i-to-i+5) 1,4- and 4,1-disubstituted [1,2,3]triazole-bridged cyclopeptides, derived from the scaffold of MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2, is a potent long acting non-selective super-agonist of melanocortin receptors MC1R, MC3R, MC4s, and MC5s. This peptide is characterized by lactam bridge between residues Asp5 and Lys10 stabilizing a type-II β-turn structure, that is critical for its bioactivity. Nevertheless, MTII is not selective for the different subtype of melanocortin receptors. The particular importance of melanocortin system, underscores the unmet need for highly selective, pharmacokinetically diverse, and bioavailable agonists and antagonists analogs. The introduction of [1,2,3]triazole was aimed to stabilize a β-turn conformation replacing the lactam bridge of MTII with an i-to-i+5 side chain-to-side chain cyclization via CuI-catalyzed azido-to-alkyne 1,3-dipolar cycloaddition (CuAAC) generating 1,4- or 4,1-disubstituted [1,2,3]triazolyl-containing ring structures. Clicked MT-II analogs presenting different permutations of bridges, containing 4 or 5 methylenes, and a triazolyl moiety were synthesized by a combination of solid phase assembly of the peptide and in solution CuAAC. Conformational and biological studies were performed on the peptides synthesized to identify the location and direction of the [1,2,3]triazolyl in the bridge that best reproduce the β-turn conformation leading to highly potent and sel

La thèse porte sur le développement de stratégies non conventionnelles de peptides contraints et la modulation des structures secondaires pour augmenter la reconnaissance biologique de ces peptides.Les peptides jouent un rôle important dans de nombreux processus et sont donc d'un intérêt grandissant pour l'industrie pharmaceutique. Cependant, leur utilisation comme médicament reste limitée à cause de leur flexibilité conformationnelle, leur sensibilité aux protéases et leur faible biodisponibilité et pharmacodynamie. Dans ce contexte, la caractérisation des interactions ligands-récepteurs est cruciale pour comprendre les processus de reconnaissance et le design d'agonistes sélectifs, potentiels nouveaux médicaments. Ainsi, le développement d'outils portant des modifications structurales présente un intérêt grandissant pour trouver de nouveaux médicaments. Ces changements structuraux permettent d'affiner les conformations privilégiées et donc de comprendre la spécificité d'interactions par rapport à des sous-types de récepteurs ayant des propriétés physicochimiques et pharmacologiques particulières.Dans la première partie de ce travail, une stratégie optimisée pour la synthèse de fragments N-terminaux (1-34) de la séquence PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 est décrite : H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. D'un point de vue synthètique, la formation de clusters dus à la présence de plusieurs résidus arginine, l'encombrement stérique, la longueur de la séquence et la présence de résidus hydrophobes dans la partie 19-28 du PTHrP rendent la synthèse difficile et donnent un enjeu important à la synthèse. C'est pourquoi, nous avons focalisé nos efforts sur l'optimisation du protocole opératoire. En particulier, nous avons montré l'intérêt d'utiliser une activation sous microondes pour la synthèse, avantages en termes de rendement et de pureté du peptide. La synthèse de PTHrP(1-34) a été optimisée à la fois sous activation par la temperature et sous microondes dans des conditions identiques. Les micoondes ont aussi été utilisé pour la synthèse de PTHrP(1-34)NH2. L'élongation de la chaine peptidique a été suivie par l'analyse UPLC-ESI-MS des fragments obtenus après micro clivage assisté par micro ondes. Cette stratégie nopus a permis , à travers la caractérisation des séquences délétées, d'identifier les points critiques de la synthèse, nécessitant les microondes. Dans la seconde partie de la thèse, ont été entreprises le design et la synthèse d'une série de cyclopeptides (i-to-i+5) 1,4- et 4,1-disubstitués pontés par un triazole, analogues de MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2 est un super agoniste agissant d'une manière non sélective des récepteurs de la mélanocortine MC1R, MC3R, MC4s, et MC5s. Ce peptide est caractérisé par un lien lactame entre les résidus Asp5 et Lys 10 stabilisant une structure β-turn, cruciale pour l'activité.Cependant MTII n'est pas sélectif des différents sous-type des récepteurs de la mélanocortine. L'importance particulière du système mélanocortine souligne le besoin de trouvé des analogues plus sélectifs, présentant une meilleure pharmacocinétique et une meilleure biodisponibilité. L'introduction du triazole [1,2,3] utilise dans nos analogues vise à stabiliser une conformation , à la place du lien lactame de MTII. La diversité est apportée par une variation de la position du triazole de i à i+5. Il est obtenu par une cycloaddition alcyne/azoture catalysée par le Cu(I) (CuAAC), générant très sélectivement l'adduit 1,4. Les analogues clickés de MTII présentant une position différente du triazole ont été synthétisé en phase solide et en solution. Les études conformationnelles et biologiques ont été conduites pour identifier l'analogue présentant la meilleure conformation β-turn conduisant à la meilleure activité biologique.

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In peptide-based medicinal chemistry, mimicry of turn conformations is important because of the significance of such secondary structures for molecular recognition. In this context, N-aminoimidazol-2-one (Nai) residues have demonstrated ability to mimic the central residue of turn conformers. Moreover, potential to functionalize the 4- and 5-positions of the Nai heterocycle offer opportunities to add and orient side chain functionalities with constrained c-geometry. Methods have been developed to employ Nai residues for peptide mimicry. Previously, Nai dipeptide esters with substituents at the imidazol-2-one 4-position were obtained as racemic mixtures. By employing alternative C-terminal groups, epimerization has now been minimized. Functionalization of the Nai 5-position after cyclization has also been achieved by novel chemistry. For example, (4-Me, 5-aldehyde)Nai residues were obtained by 5-position formylation. The aldehyde was then reduced and oxidized to provide alcohol and acid functionality. Reductive aminations on (4-Me, 5-aldehyde)Nai residues using different primary and secondary amines and amino methylation of (4-Me)Nai residues were also used to prepare constrained diaminobutyric acid analogs. In the interest to prepare Nai analogs that can serve as constrained phenylalanine residues, palladium-catalyzed chemistry was developed to cross-couple different aryl iodides at the 5-position. In model peptides, the (4-Me, 5-aryl)Nai residues were predicted by molecular dynamic calculations to be located at the i+1 position of type II’ β-turn conformations with the aryl side chain positioned in the gauche (–). The synthesis of biologically relevant Nai peptides was next explored using methods for accessing enantioenriched residues and conditions for their 5-position arylation. Peptide derivatives of growth hormone releasing peptide-6 (GHRP-6) were targeted using the Nai residues because the corresponding semicarbazide analogs had exhibited selective and relatively high binding affinity for the cluster of differentiation receptor (CD36) receptor and potential to mediate macrophage-driven inflammation in conditions leading to age-related macular degeneration, atherosclerosis and angiogenesis. Previous studies with GHRP-6 analogs demonstrated that replacement of Trp4 with a semicarbazide possessing an aromatic side chain favored a turn conformation and selective CD36 binding affinity. Solid-phase methodology was developed to synthesize [(4-Me, 5-Aryl)Nai4]-GHRP-6 analogs and used to prepare four different Nai peptides on Rink amide resin. All four analogs were effective at mediating nitric oxide (NO) overproduction in macrophages cells treated with a Toll-like receptor 2 (TLR2) agonist. Although biological evaluation of the [(4-Me,5-Aryl)Nai4]-GHRP-6 analogs is still being performed, their ability to modulate NO overproduction strongly indicated backbone and side chain conformational requirements for biological activity. In sum, this thesis has provided effective methods for preparing novel constrained peptide analogs for mimicry of the backbone and side chain geometry in β-turns. Enantiomerically enriched Nai residues were synthesized, introduced into peptide sequences, and functionalized at the 4- and 5-positions. Employment of the 4,5-disubstituted Nai analogs in the study of peptide medicinal chemistry offers powerful potential for exploring structure-activity relationships to identify and replicate biologically active conformers. / Le développement de mimes de tours peptidiques pose un intérêt particulier en chimie médicinale, en raison de leur importance dans la reconnaissance moléculaire. Dans ce contexte, les résidus N-aminoimidazol-2-one (Nai) ont démontré une tendance à occuper la position centrale de repliements peptidiques. De plus, la présence de l’unité imidazolone offre un potentiel de fonctionnalisation en position 4 et 5 pouvant jouer le rôle de chaînes latérales rigidifiées dans l’espace χ. Des méthodes ont été développées pour rendre possible l’utilisation de résidus Nai en chimie peptidique. Par le passé, des esters de dipeptide Nai possédant un substituant à la position 4 de l’hétérocycle ont été synthétisés de manière racémique. L’utilisation de groupement C-terminaux a permis de grandement réduire l’épimérisation due à l’utilisation de base forte utilisée durant l’étape de cyclisation. La fonctionnalisation de la position 5 du cycle après la cyclisation a aussi été rendue possible par le développement de nouvelles conditions réactionnelles. Par exemple, des conditions de formylation ont donné des résidus (4-Me, 5-Aldéhyde)Nai. La fonction aldéhyde a été réduite et oxydée, donnant accès a des fonctions alcool et acide carboxylique. L’amination réductrice du squelette (4-Me, 5-Aldéhyde)Nai en utilisant des amines primaires et secondaires ainsi que l’amino-méthylation de résidus (4-Me)Nai ont donné accès à des résidus d’acide diaminobutyrique rigidifiés. Dans le but de préparer des analogues Nai pouvant servir de mimes rigidifiés de résidus phénylalanine, la catalyse au palladium a rendu possible l’installation de groupements 5-aryle par couplage croisé avec différents iodoaryles. Dans un modèle de peptide, le résidu (4-Me, 5-aryl)Nai a été soumis à une analyse par dynamique moléculaire qui a révélé le positionnement de la portion Nai à la position i+1 d’un tour β de type II’, avec la chaine latérale aryle adoptant une conformation gauche (-). Ayant en main des conditions de synthèse énantioenrichie ainsi que de diversification de la position 5, la construction de peptides Nai possédant un intérêt biologique a été entreprise. Des dérivés du peptide Growth hormone releasing peptide-6 (GHRP-6) ont été ciblés car les analogues semicarbazide correspondant ont précédemment démontré avoir à la fois de la sélectivité et une affinité relativement grande pour le Cluster of differentiation receptor (CD36). Ils ont ainsi le potentiel de moduler l’inflammation attribuable aux macrophages dans des conditions menant à la dégénérescence maculaire liée à l’âge, l’athérosclérose et l’angiogenèse. Des études précédentes ont démontré que le remplacement du résidu Trp4 du GHRP-6 par un semicarbazide possédant une chaîne latérale aromatique favorisait l’adoption d’un repliement de la chaîne peptidique et une affinité sélective envers le récepteur CD36. Une méthode de synthèse sur phase solide d’analogues [(4-Me, 5-Aryle)Nai4]-GHRP-6 a été développée et utilisée pour synthétiser quatre différents peptides Nai en utilisant la résine Rink amide. Les quatre analogues se sont montrés efficaces à réduire la surproduction d’oxide nitrique (NO) dans les cellules macrophages traitées avec un agoniste du Toll-like receptor 2 (TLR2). Malgré le fait que l’évaluation biologique des analogues [(4-Me, 5-Aryle)Nai4]-GHRP-6 soit toujours en cours, leur habilité à moduler la surproduction d’oxide nitrique montre qu’ils possèdent la bonne géométrie quant à la chaîne principale et la chaîne latérale aromatique pour interagir avec le récepteur. En somme, la présente thèse a fourni des méthodes efficaces de synthèse de nouveaux analogues de peptides rigidifiés pour mimer les chaînes principale et latérales de tours β. Les résidus Nai énantioenrichis ont été synthétisés, introduits dans des séquences peptidiques d’intérêt sur phase solide et fonctionnalisés à la 4ième et 5ième position. L’utilisation de ces analogues Nai 4,5-disubstitués en chimie médicinale et peptidique offre un potentiel considérable dans l’exploration de la relation structure-activité de peptides d’intérêt biologique pour identifier et mimer les conformères bioactifs.

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