Η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης και κατ’ επέκταση και της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HbF), μέσω ενεργοποίησης με φαρμακολογικούς παράγοντες ή μεταφοράς του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, αποτελούν σημαντικές στρατηγικές για την θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής και μεσογειακής αναιμίας. Καινοτομία αποτελεί η δημιουργία ενός ειδικού συνθετικού ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης, του Zif-VP64, με δομή δακτύλων ψευδαργύρου, ειδικά σχεδιασμένη για πρόσδεση σε αλληλουχία 18bp, περί την θέση -117HPFH του υποκινητή της γ-σφαιρίνης. Επιδίωξη της εργασίας αυτής ήταν η ανάπτυξη ενός μη ιϊκού, επισωματικού φορέα, που φέρει τον συνθετικό ενεργοποιητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, ικανού να λειτουργεί με επάρκεια σε κύτταρα του αιμοποιητικού ιστού. Η φορέας αυτός, Zif-VP64-Ep1, περιλαμβάνει τον ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης και την μεταγραφική κασέτα CMV-eGFP-S/MAR, για την εξασφάλιση της επισωματικής του κατάστασης μέσω του στοιχείου S/MAR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο φορέας Zif-VP64-Ep1: i. διαμολύνει επιτυχώς, K562 κύτταρα σε ποσοστό 45% παραμένοντας σε επισωματική κατάσταση και υποστηρίζοντας έκφραση του διαγονιδίου για τουλάχιστον 200 γενεές, προγονικά κύτταρα μυελού τον οστών ποντικού β-YAC BMCs σε ποσοστό 23% και CD34+ κύτταρα περιφερικού αίματος κινητοποιημένου υγιούς δότη σε ποσοστό 22,5%. ii. ο φορέας Zif-VP64-Ep1 υποστηρίζει σημαντική αύξηση των επιπέδων της γ-σφαιρίνης κατά 3.3±0.2 φορές σε Κ562 και 3.0±1 φορές σε CD34+ κύτταρα, και ενεργοποίηση του ανενεργού γονιδίου γ-σφαιρίνης σε κύτταρα β-YAC BMCs. Επιτυγχάνεται έτσι, για πρώτη φορά, επισωματική γονιδιακή μεταφορά του ενεργοποιητή Zif-VP64 και trans-ενεργοποίηση του γ-γονιδίου σε επίπεδο θεραπευτικής σημασίας. / The increase of HbF through activation of gamma-globin gene is a valid strategy for the treatment of hemoglobinopathies. Zif-VP64 is a selective, synthetic gamma-globin activator, containing a zinc-finger DNA protein that binds the gamma-globin promoter -117HPFH area and a transcription inducer that induces gamma globin gene in K562 cells, after viral transfer. We report the study of an episomal vector of this activator, which is based on a Scaffold/Matrix attachment region (S/MAR) that supports retention of episomes in the nucleus of the host cell. We constructed an episomal vector, Zif-VP64-Ep1, containing the activator Zif-VP64, the reporter gene cassette CMV-eGFP and the S/MAR element. Gene transfer into cells was done by electroporation or nucleofection. Expression of eGFP was documented by Florescent Microscopy and Flow Cytometry, while the fate of vector molecules in the cells was studied by Southern Blot and plasmid rescue experiments. Real time PCR, Western blotting and Intracellular Flow Cytometry were used to investigate gamma-globin mRNA, gamma-globin protein and HbF protein levels respectively. Binding specificity of the activator was determined by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Gene transfer was done in K562 cells producing long term stable cell lines; murine beta-YAC cells, where the YAC contains the complete human, beta-globin gene locus; and human progenitor hemopoietic CD34+ cells from healthy, mobilized individuals, with transfection efficiencies of 65%, 25% and 23% respectively. In K562 cells, gamma-globin mRNA levels showed an increase of 250%, gamma-globin protein of 350% and HbF protein of 165%, as compared to the corresponding levels in the untransfected K562 cells, at least 200 generations post-transfection. Interestingly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to mediate the activation of expression of the silent, human gamma-globin gene of the murine beta-YAC cells, at a level matching the (active) human beta-globin gene of the YAC, as well as the murine beta-globin gene, showing that it can efficiently activate the gamma-globin gene from within a heterochromatic region. Finally and most significantly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to transfect the human, hemopoietic progenitor CD34+ cells and to mediate a 3.0±1 fold increase of gamma globin mRNA, compared to untrasnfected CD34+ cells, as estimated in cultures of 7-8 days after transfection. In conclusion, activation of human gamma-globin by episomal gene transfer of a synthetic activator, in three different hemopoietic cells, is documented, including the CD43+ cells, that are the target cells for gene therapy of the Hemoglobinopathies. This is the first time that an S/MAR based episomal vector is used for gene transactivation in a cell line and progenitor cells, aiming at specific gene therapy.

Οι αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν πολλά υποσχόμενους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκε ο φορέας Zif-VP64-EP2 στα πλαίσια των μελετών γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Πρόκειται για ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο ενός τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα της γ-σφαιρίνης του Zif-VP64 υπό την επενέργεια του ισχυρού υποκινητή pSFFV καθώς και τo γονίδιο της eGFP με το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β υπό την επενέργεια του υποκινητή pCMV. Διαπιστώθηκε ότι το Zif-VP64-EP2 μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε διαμολυσμένα κύτταρα της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς Κ562. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2. / Self-replicating episomal vectors for gene transfer are a new and very promising experimental approach to gene therapy. In this study, it was created the vector Zif-VP64-EP2, within the context of developing self-replicating episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies. Zif-VP64-EP2 is a circular plasmid which includes the gene of an artificial transcription factor for gamma globin: Zif-VP64 under the control of pSFFV promoter and the gene of eGFP with the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene under the control of pCMV promoter. It was established that Zif-VP64-EP2 was retained within the transfected Κ562 hematopoietic progenitor cell. Its episomal situation for a long time (3 months) and its normal expression in K562 human cells constitutes a proof of the utility of Zif-VP64- ΕΡ2 system in gene therapy applications.