Σκοπός της μελέτης ήταν να εξετάσουμε, σε ένα πειραματικό μοντέλο πειραματικής ηπατεκτομής (70%) αφ’ ενός και παροδικής απόφραξης του ηπατοδωδεκαδακτυλικού συνδέσμου (χειρισμός Pringle) αφ’ ετέρου, το φαινόμενο της βακτηριακής μετακίνησης, της ενδοτοξιναιμίας, καθώς και τις μεταβολές οι οποίες συμβαίνουν στην εντερική χλωρίδα και τον εντερικό βλεννογόνο. Σε αυτά τα δύο μοντέλα προσπαθήσαμε κατ’ αρχήν να πιστοποιήσουμε την αυξημένη μετακίνηση των εντερικών βακτηρίων στους μεσεντέριους λεμφαδένες και την διαπίδυση ενδοτοξινών από τον αυλό του εντέρου στην πυλαία και την αορτή. Στα ίδια μοντέλα προσπαθήσαμε να αναστείλουμε τα ανωτέρω φαινόμενα με φαρμακολογικούς χειρισμούς, μελετώντας πρώτον τη χορήγηση λακτουλόζης από το στόμα, η οποία έχει την ικανότητα να δεσμεύει την ενδοτοξίνη και να σχηματίζει σύμπλεγμα που δεν απορροφάται από το έντερο, με σκοπό τη μείωση της ενδοαυλικής απορροφήσιμης ενδοτοξίνης και δεύτερον τη χορήγηση δυσαπορρόφητων αντιβιοτικών από το στόμα, με σκοπό την ποσοτική ελάττωση του πληθυσμού της μικροβιακής χλωρίδας στον αυλό του εντέρου. Τα αποτελέσματα κάθε φάσης της μελέτης της ηπατεκτομής (70%) και του χειρισμού Pringle είχαν ως εξής: Η ηπατεκτομή (70%), προάγει την εντερική βακτηριακή μετακίνηση στους μεσεντέριους λεμφαδένες και στο ήπαρ, αυξάνει την ενδοτοξιναιμία και επιφέρει ιστολογικές αλλαγές στο ύψος των λάχνων. Η χορήγηση λακτουλόζης δημιουργεί τις κατάλληλες συνθήκες που επιφέρουν την μείωση των θετικών καλλιεργειών ιδιαίτερα αυτών του ήπατος και ελαττώνει την ενδοτοξίνη στην πυλαία. Η αποστείρωση του εντέρου με τη χορήγηση δυσαπορρόφητων αντιβιοτικών, μειώνει την εντερική βακτηριακή μετακίνηση στους μεσεντέριους λεμφαδένες και την ενδοτοξιναιμία. Ο χειρισμός Pringle, προάγει την εντερική βακτηριακή μετακίνηση και την ενδοτοξιναιμία, ενώ η απόπτωση ελαττώνεται με την αποστείρωση του εντέρου και τη χορήγηση λακτουλόζης μόνο άμεσα μετά τον χειρισμό. Η εξασφάλιση της ανατομικής και λειτουργικής ακεραιότητας του εντερικού βλεννογόνου έχει ιδιαίτερη σημασία στη διατήρηση του βλεννογόνιου εντερικού φραγμού και αποτρέπει την ενδοτοξιναιμία και τη βακτηριακή μετακίνηση. Η αποκατάσταση της δομικής και λειτουργικής ακεραιότητας του εντερικού βλεννογόνου, στην εκτεταμένη ηπατεκτομή, με τη χορήγηση μη απορροφήσιμων αντιβιοτικών και λακτουλόζης, αναστέλλει σημαντικά τα ανωτέρω φαινόμενα. / The purpose of this study is to investigate on an experimental model of extended hepatectomy(70%) and temporary occlusion of the hepatoduodenal ligament (Pringle maneuver), the phenomenon of bacterial translocation, endotoxaemia as well as the changes that are taking place, both in the intestinal flora and intestinal mucosa. In both models we attempt to demonstrate the increase translocation of intestinal bacteria to mesenteric lymph nodes (MLNs) and increase of endotoxin in the systemic and portal circulation. Using the same models, we attempted to inhibit the above phenomena with pharmacological manipulation. We examined the decrease of the endotoxins translocation, by administering per.os lactulose, which has the property to bind the endotoxin formatting a nonabsorbable comlex in the gut lumen. We also investigated the effect of nonabsorbable antibiotics per. os on reducing the intestinal flora. Our results indicated that, extended hepatectomy (70%) increased translocation of intestinal bacteria to mesenteric lymph nodes and liver and increased the endotoxaemia inducing the decrease of intestinal villus height. The administering of lactulose created the proper conditions which decreased positive liver cultures and reduced the endotoxin concentrations in portal blood. Gut decontamination by administration of nonabsorbable antibiotics reduced the intestinal flora, the intestinal bacteria translocation to MLNs and endotoxaemia. Pringle maneuver promoted the intestinal bacterial translocation and endotoxaemia. Apoptosis decreases, by gut decontamination and administration of lactulose only immediately after Pringle maneuver. The anatomic and functional integrity reassurance, of intestinal mucosa, has strong significance for the preservation of intestinal mucosal barrier to prevent endotoxaemia and bacterial translocation. The structural and functional establishment of enteric mucosa integrity, after extended hepatectomy, by administration of nonabsorbable antibiotics and lactulose, inhibit considerably the above phenomena.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρεί να διερευνήσει την επίδραση της πειραματικής ηπατεκτομής στην δομή του εντερικού βλεννογόνου μελετώντας την απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων στις κρύπτες, τα επίπεδα ενδοτοξίνης στην πυλαία φλέβα και την αορτή, καθώς επίσης και τα επίπεδα του οξει-δωτικού stress. Μελετά επίσης τα επίπεδα του οξειδωτικού stress στο εναπομείναν ήπαρ. Επιπλέον, σε μια προσπάθεια θεραπευτικής παρέμ-βασης, διερευνήθηκε ο ρόλος των ρυθμιστικών εντερικών πεπτιδίων BBS και NT στις ανωτέρω παραμέτρους . Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα πεπτίδια αυτά εξα-σκούν ένα ευρύ φάσμα δράσεων στον εντεροηπατικό άξονα και βελτι-ώνουν την ακεραιότητα του γαστρεντερικού βλεννογόνου έπειτα από την επίδραση διαφόρων βλαπτικών παραγόντων. Η απουσία χολής ενδοαυλικά, αποστερεί τον εντερικό βλεννο-γόνο, από τις βακτηριοστατικές, αντιενδοτοξινικές και τροφικές της ιδιότητες, οδηγώντας σε αύξηση των βακτηριδίων και της ενδοτοξίνης ενδοαυλικά και σε εντερική ατροφία. Οι μεταβολές αυτές προάγουν τη μετακίνηση βακτηρίων και ενδοτοξινών στην πυλαία φλέβα και ακο-λούθως, μέσω μιας κατασταλμένης εκκαθαριστικής ικανότητας των κυττάρων Kupffer εξαιτίας της μειωμένης μάζας τους, στη συστη-ματική κυκλοφορία. Η συστηματική ενδοτοξιναιμία ενεργοποιεί τη συστηματική φλεγμονώδη απάντηση, η οποία σχετίζεται με τη δυσλει-τουργία που αναπτύσσεται σε απομακρυσμένα όργανα, ενώ συνεισφέ-ρει και στην περαιτέρω επιδείνωση της λειτουργίας του εντερικού φραγμού και της ηπατικής βλάβης. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιβεβαίωσαν την παρουσία πυλαίας και συστηματικής ενδο-τοξιναιμίας σε πειραματική ηπατεκτομή. Η προκαλούμενη από την πειραματική ηπατεκτομή ατροφία του εντερικού βλεννογόνου τεκμη-ριώθηκε με μορφομετρική ανάλυση και με μετρήσεις του DNA και της πρωτεΐνης. ΄Ενας πιθανός μηχανισμός προαγωγής της ατροφίας του εντερικού βλεννογόνου είναι η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου στις κρύπτες, με αύξηση της απόπτωσης και μείωση της μιτωτικής δραστηριότητας. Επιπλέον η πειραματική ηπατεκτομή οδήγησε τις εντερικές λειτουργί-ες σε μια κατάσταση χαμηλού οξειδωτικού stress όπως φαίνεται καθαρά από τη μείωση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων και της οξει-δωμένης γλουταθειόνης (GSSG) καθώς και από την αύξηση της ανηγ-μένης γλουταθειόνης (GSG). Είναι άξιο παρατήρησης ότι το οξειδωτι-κό stress δεν φαίνεται να είναι το πρωταρχικό αίτιο της πρόκλησης κυτταρικής απόπτωσης και ατροφίας λαχνών που παρατηρείται μετά από μερική ηπατεκτομή, αν και αυτή η επέμβαση μειώνει το οξειδωτι-κό stress κάτω από το control. Από το άλλο μέρος αυτές οι επιδράσεις εξαλείφθηκαν υπό συνθήκες ακόμη πιο μειωμένου οξειδωτικού stress που προκλήθηκαν μετά την χορήγηση των ρυθμιστικών πεπτιδίων BBS και NT Τα ρυθμιστικά εντερικά πεπτίδια, BBS και NT, δρώντας είτε άμεσα, μέσω ειδικών υποδοχέων των επιθηλιακών κυττάρων του εντέ-ρου, είτε έμμεσα, βελτιώνοντας τη μικροκυκλοφορία του εντέρου, μείωσαν σημαντικά την απόπτωση και ανέστρεψαν την εντερική ατρο-φία. Η πρόληψη, από τα ρυθμιστικά πεπτίδια, των επαγόμενων από την ηπατεκτομή κυτταρικών και βιοχημικών μεταβολών του εντερικού βλεννογόνου, οδήγησε σε σημαντική μείωση της πυλαίας και συστη-ματικής ενδοτοξιναιμίας. Επιπλέον, η BBS και η NT, εξασκώντας αντιοξειδωτική δράση και στο ήπαρ, προστάτεψαν το εναπομείναν ήπαρ από δυο μείζονες παράγοντες ηπατικής βλάβης, που είναι το οξειδωτικό stress και η ενδοτοξιναιμία. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχ-νουν ότι η δυσλειτουργία του εντερικού φραγμού στην ηπατεκτομή σχετίζεται με την επαγωγή κυτταρικών και βιοχημικών μεταβολών στον εντερικό βλεννογόνο, οι οποίες χαρακτηρίζονται από πρόκληση οξειδωτικού stress και επαγωγή της απόπτωσης. Τα ρυθμιστικά εντε-ρικά πεπτίδια BBS και NT προλαμβάνοντας τις μεταβολές αυτές του εντερικού βλεννογόνου μειώνουν σημαντικά την πυλαία και συστημα-τική ενδοτοξιναιμία. Επίσης, εξασκούν προστατευτική δράση εναντίον του οξειδωτικού stress στο ήπαρ. Η συνδυασμένη ευεργετική επίδραση των ρυθμιστικών πεπτιδίων, τόσο στη δυσλειτουργία του εντερικού φραγμού και την ενδοτοξιναιμία, που ευθύνονται για την ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και βλάβης απομακρυσμένων οργάνων, όσο και στο οξειδωτικό stress, εισηγούνται μια νέα θεραπευτική προσέγγιση στην ηπατεκτομή. / This doctoral thesis explores the effect of experimental hepatectomy on the structure of the intestinal mucosa by studying apoptosis and proliferation of epithelial cells in crypts, endotoxin levels in portal vein and aorta, as well as levels of oxidative stress. It also investigates the level of oxidative stress on the remaining liver tissue. In addition, in an attempt of therapeutical approach, the role of the regulatory intestinal peptides BBS and NT in the above parameters has also been evaluated. Previous studies have demonstrate that the above peptides present a wide range of actions on the intestinal-liver axis, thus improving integrity of the gastrointestinal mucosa after it has been affected by various harmful factors. Intestinal mucosa in the absence of bile in the lumen lacks its bacteriostatic, anti-endotoxin and trophic effects, leading in a raise of bacteria and endotoxin in the lumen as well as intestinal atrophy. These changes are promoting bacteria and endotoxin translocation to the portal vein and from there, to the systematic circulation, a procedure augmented by the supression of the cleaning ability of Kuppfer cells due to their reduced mass in hepatectomy. Systemic endotoxinaemia activates the systematic inflammatory response (SIR) related to the dysfunction of distal organs, and contributing to further damage to the mucosal barrier and the liver. This study confirmed the presence of portal and systemic endotoxinaimia in experimental hepatectomy. The subsequent atrophy of the intestinal mucosa has been documented with morphologic analyses as well as DNA and protein measurements. A possible explanation of the observed atrophy might be disturbance in balance between cellular proliferation and cellular death in the crypts by increased apoptosis and decreased mitotic activity. In addition, experimental hepatectomy led the intestinal functions in a state of low oxidative stress, as it is clearly shown by the decrease of lipid peroxidation and oxidized glutathione (GSSG), and the increase of glutathione (GSH). Interestingly enough, oxidative stress does not seem to be the primary cause of cellular apoptosis and decreased cell proliferation in the crypts (leading to mucosa atrophy), which are observed after partial hepatectomy, although this operation decreased oxidative stress below the control levels. On the other hand, these effects are prevented at more decreased levels of oxidative sress induced by the regulatory intestinal peptides BBS and NT. BBS and NT may act either directly, through specific receptors of the intestinal epithelial cells, or indirectly, by improving the intestinal microcirculation, leading to reversal of intestinal atrophy. Prevention, by these peptides, of the hepatectomy induced cellular and biochemical changes in the intestinal mucosa led to significantly reduced portal and systematic endotoxinaemia. In addition, BBS and NT, through antioxidative action to the liver, protected the remaining liver tissue from two major factors of liver lesions: oxidative stress and endotoxinaimia. Concluding, the results of this study show that dysfunction of the intestinal mucosa barrier in the hepatectomy is associated with the induction of cellular and biochemical changes in the intestinal mucosa, which are characterized by the promotion of oxidative stress and apoptosis. The regulatory intestinal peptides BBS and NT preventing these changes in the intestinal mucosa are significantly reducing portal and systematic endotoxinaimia. They also act by protecting against oxidative stress in the liver. This combined beneficial effect of these peptides, both in the dysfunction of the intestinal mucosa barrier and endotoxinaimia, which are responsible for the development of septic complications and distal organ lesions as well as in oxidative stress, might suggests a new therapeutical approach in hepatectomy.

ΣΚΟΠΟΣ: Σήμερα είναι πλέον γνωστό ότι το χολοστατικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία από το φυσιολογικό ήπαρ. Η ηπατική αναγέννηση μετά μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ) ρυθμίζεται από διάφορους παράγοντες οι οποίοι ενεργοποιούν ή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων. Ένα από τα κυτταρικά στοιχεία που συμβάλλει στην αναγέννηση του ήπατος είναι το ηπατοκύτταρο με χολαγγειακή μορφολογία (DΗ). Από την άλλη μεριά, η απόπτωση φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ηπατική αναγέννηση. Στην παρούσα μελέτη, μετά από Ρηχ σε φυσιολογικούς ποντικούς και σε άλλους με ίκτερο, με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία, ερευνήσαμε: α) τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ισχαιμικής ηπατικής βλάβης και αναγέννησης, β) το δυνητικό ρόλο των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία κατά τη διάρκεια της ηπατικής αναγέννησης και γ)την έκφραση των γονιδίων bcl-2 και bax, τα οποία σχετίζονται με την απόπτωση, καθώς και την παρουσία της απόπτωσης. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Η μελέτη συμπεριέλαβε 140 ποντικούς Wistar οι οποίοι χωρίστηκαν σε 14 ομάδες: Ι –control, II - εγχείρηση sham. III-IV-V-παροδικός αγγειακός αποκλεισμός ηπατικής αρτηρίας και πυλαίας φλέβας (ολική ηπατική ισχαιμία) (TLI) για 15-30-60 λεπτά αντίστοιχα. VI - απολίνωση του κοινού χοληδόχου πόρου (BDL) για 10 ημέρες, VII-VIII-ΙΧ-BDL-ΤLI-ΡΗχ. Χ-μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ 68%}, XI- ΡΗχ + TLI (30 min), XII-BDL+ΡΗχ, XIII-BDL+ ΡΗχ+TLI (30 min) και XIV- BDL+TLI (30 min) + ΡΗχ. Τα ζώα θυσιάστηκαν 24 και 48 ώρες μετά από Ρηχ, με εξαίρεση τις περιπτώσεις όπου η κατάσταση υγείας ήταν κρίσιμη. Η μελέτη του ηπατικού ιστού περιελάμβανε: (α) Η&Α stain, (β) υβριδισμό in situ (ανίχνευση mRΝΑ των bcl-2 και bax σε παραφίνη, (γ) ανάλυση Western Blot για τη μελέτη των πρυτεϊνικών επιπέδων των bcl-2 και bax, (δ) in situ υβριδισμός (TUNEL) για την ανίχνευση παραγόντων απόπτωσης, (ε) ανοσοϊστοχημικά stains σε παραφίνη (μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης) με σκοπό να μελετηθεί η έκφραση των ακόλουθων αντιγόνων: κυτοκερατίνη 7 και 19 (χολικός φαινότυπος), ηπατοκυτταρίκή και α1-σντιθρυψίνη (ηπατοκυτταρικός φαινότυπος), βιμεντίνη, CD34, α-φετοπρωτείνη, GST-π(γλουταθειονιν-S-τρανσφεράση-π). Κι67 (κυτταρικός πολλαπλασιασμός), bcl-2 και bax (γονίδια απόπτωσης). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ήπαρ από ποντικούς α)με TLI ανέπτυξε βλάβες ηπατικής ισχαιμίας, β)με BDL βλάβες ηπατικής απόφραξης, γ)με BDL+TLI ανέπτυξαν βλάβες ηπατικής ισχαιμίας μαζί με αλλαγές λόγω απόφραξης των χοληφόρων. Το ποσοστό του επηρεασμένου ηπατικού παρεγχύματος (%ηπατικής νέκρωσης) ήταν υψηλότερο στις ομάδες με TLI+BDL. Σε αυτές τις ομάδες, ο ηπατοκυτταρικός δείκτης (δείκτης πολλαπλασιασμού) του Κi67 ήταν μικρότερος από τον αντίστοιχο της ομάδας χωρίς TLI. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το χολοστστικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία κι εκδηλώνει μειωμένη αναγεννητική ικανότητα, συγκρινόμενο με μη χολοστατικό ήπαρ. Βιοψίες ήπατος έδειξαν χαρακτήρες ηπατικής αναγέννησης προερχόμενης από τη ζώνη 2, η οποία επεκτεινόταν στη ζώνη 1 και κάποιες φορές στη ζώνη 3. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ανέδειξαν κύτταρα θετικά στο ΑΕ1 και κύτταρα θετικά στο ΗΕΡΡΑΡ. Σε όλες τις ομάδες με TLI τα ηπατοκύτταρα χολαγγειακής μορφολογίας εμφανίζονταν κυρίως σε περιοχές περι-πυλαίες. Εξέφραζαν κυτοκερατίνες 19 και 7, ηπατοκυτταρίκή και α1-αντιθρυψίνη ενώ εμφάνιζαν και συνδυασμένη έκφραση CΚ7/CΚ19 και ηπατοκυτταρική ή ΑΕ1/CΚ19 και α1-αντιθρυψϊνη. Το ποσοστό των κυττάρων αυτών ήταν ευθέως ανάλογο με το χρόνο επιβίωσης των ζώων (r=0,354, ρ<0,05). Όσον αφορά την απόπτωση, προ ηπατεκτομής, τα επίπεδα του bcl-2 ( πρωτεΐνη ή mRΝΑ) ήταν υψηλότερα σε ποντικούς με ίκτερο απ' ό,τι στους ποντικούς controls. Επιπλέον τα επίπεδα του bax (πρωτεΐνη ή mRΝΑ) και ο σωματικός δείκτης απόπτωσης (ΑΒΙ) ήταν υψηλότερα σε χολοστατικό ήπαρ. Μετά ηπατεκτομή, παρατηρήθηκε πρώιμη ελάττωση των επιπέδων πρωτεϊνών και mRΝΑ του γονιδίου bcl-2 και μια ύστερη αύξηση του προ-αποπτωτικού γονιδίου bax και του ΑΒΙ, σε σύγκριση με τα controls. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Σε περιπτώσεις αποφρακτικού ίκτερου (χολαγγειοπάθεια), η ηπατική ισχαιμία καθιστά το όργανο πιο ευαίσθητο σε ενδεχόμενη βλάβη, καθώς προκαλεί ευρύτερη νέκρωση παρεγχύματος και ελαττώνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων, Η διεργασία αναγέννησης του ήπατος επιτελείται κυρίως μέσω του πολλαπλασιασμού μη νεκρωτικών κυττάρων τα οποία εκφράζουν ηπατοκυτταρικά ή χολαγγειακά επιθηλιακά χαρακτηριστικά. Σε τέτοιες περιπτώσεις, το κύριο στοιχείο της ηπατικής αναγέννησης αποτελεί η παρουσία των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία (κύτταρα που εκδηλώνουν φαινότυπο ενδιάμεσο μεταξύ κυττάρων χολαγγειακής και ηπατικής προέλευσης) και η διαφοροποίηση τους σε ώριμα ηπατοκύτταρα. Τέλος, η απόπτωση έχει ρόλο στο χολοστατικό ήπαρ με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία και πιστεύεται ότι μπορεί να συμβάλλει στην παρουσία κατεσταλμένης αναγεννητικής απόκρισης που παρατηρήθηκε σε ήπαρ ποντικών με ίκτερο μετά από μερική ηπατεκτομή. / AIM: Today, it is known that cholestatic liver is more susceptible to ischemia than normal liver. Liver regeneration after partial hepatectomy (PHx) is regulated by several factors that activate or inhibit hepatocyte proliferation. One of the cellular elements that contributes to liver regeneration is ductular hepatocyte (DH). On the other hand, apoptosis seems to play an important role in cellular proliferation and liver regeneration. In this study and. after PHx. in normal and jaundiced rats with or without superimposed ischemia, we assessed a) the histopathologic features of hepatic Ischemic damage and liver regeneration, b) the potential role of ductular hepatocytes during liver regeneration and c) the expression apoptosis-asscciated genes bcl-2 and bax. and the presence of apoptosis, MATERIALS £ METHODS: The study comprised 140 male Wistar rats, assigned randomly in 14-groups: l-controls. ll-sham. Ill-IV-V-cIamping of hepatic artery and portal vein (total liver Ischemia-TLI) for 15-30-60 min respectively. Vl-common bile duct ligation (BDL) for lOdays. VII-VIII-IX-BDL-TLI-X-partial hepatectomy(PHx-68%). XI-PHx+TLI(30min). XU-BDL+PHx. XIII-BDL+PHx+TLI(30min) and XIV-BDL+TLI (30min)+PHx. Animals were sacrificed 24 and 48hrs after PHx unless their condition was critical. Liver tissue evaluation Included: (a) H&E stain, (b) in situ hybridization (detection of bcl-2 and bax mRNA) in paraffin sections, (c) Western blot analysis for the evaluation of bcl-2 and bax protein levels, (d) in situ hybridization (TUNEL) for the detection of apoptotic bodies, and (e) immunohistochemical stains (streptavidin-biotin method) in paraffin sections, in order to evaluate the expression of the following antigens: cytokeratins 7 and 16 (biliary phenotype), Hepatocyte and a 1-antitrypsin (hepatocytic phenotype), vimentin, CD34, alpha-fetoprotein, GST-pi (glutahione-S-trarsferase-pi), Ki67 cell proliferation), bcl-2 and bax (apoptotlc genes). RESULTS: Sections from rats a) with TLI developed changes of liver ischemia, b) with BDL changes of liver obstruction and c) with BDL+TLI developed changes of ischemia together with changes of biliary obstruction. The total liver parenchymal area affected (% liver necrosis} was higher in groups with TLI+BDL. In these groups the Ki67 hepatocytic index (proliferation index) was lower compared to the groups without TLI. This finding implies that cholestatic livers are more vulnerable to ischemia and also display impaired generative capabilities, compared to non-cholestatic ones. Liver biopsies exhibited features of liver regeneration that originated from zone 2, extended to zone 1 and occasionally to zone 3. Immunonistochemical stains revealed cells positive to AE1 and cells positive to HEPPAR. In all groups with TLI, DHs appeared mainly in periportal areas. They expressed cytokeratirs-19 and 7. hepatocyte and al-antrtrypsm and co-expressed CK7/CK1S and Hepatocyte or AE1/CK1S and a 1-antitrypsin The percentage of DHs was directly correlated with the time that animals survived (r=0,354, p<0,05). Regarding apoptosis, before hepatectomy, bcl-2 (protein or mRNA} levels were higher in jaundiced rats vs controls. Furthermore, bax (protein or mRNA) levels and apoptotic body index (ABl) were higher in cholestatic livers. After hepatectomy, there was an early decease in the protein and mRNA levels of antiapoptotic gene bcl-2 and a late increase of proapoptotic gene bax and the A8I. compared to controls. CONCLUSIONS: In cases with obstructive jaundice (cholangiopathy), liver ischemia makes the organ more vulnerable to damage because it causes greater parenchymal necrosis and decreases the degree of hepatocyles proliferation. Liver regenerative process is mediated mainly by proliferation of non-necrotic cells that express hepatocellular or ductular epithelial features. In such cases a main element of liver regeneration is the presence of DHs, cells that display a phenotype intermediate between ductular and hepatocytic origin} and their differentiation to mature hepatocytes. Finally, apoptosis takes place in cholestatic livers with or without superimposed ischemia and may contribute in the impaired regenerative response observed in livers of jaundiced rats after partial hepatectomy.

Η αναγέννηση, με τον τρόπο που αυτή επιτελείται στο ήπαρ, δηλαδή με πολλαπλασιασμό των ώριμων κυττάρων όλων των κυτταρικών ομάδων του οργάνου, είναι μία μοναδική ιδιότητα. Πιθανώς η ιδιότητα αυτή να είναι γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων, όπως συμβολίζεται στον μύθο του Προμηθέα. Απόλυτα δικαιολογημένο, εκ τούτου, είναι το μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον απέναντι στη μοναδική αυτή διεργασία. Το συνηθέστερο μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της αναγέννησης είναι η χειρουργική ηπατεκτομή σε μικρά τρωκτικά (κατά κύριο λόγο στον επίμυ). Μετά τη διενέργεια της επέμβασης παρατηρείται συγχρονισμένη είσοδος των ηπατοκυττάρων –αρχικά- και των λοιπών κυτταρικών ομάδων -στη συνέχεια- στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και σε προετοιμασία πολλαπλασιασμού. Στην πρώτη αυτή φάση τα ηπατοκύτταρα γίνονται δεκτικά στη δράση μίας πλειάδας αυξητικών παραγόντων. Αυτή είναι η εναρκτήρια φάση της αναγέννησης (priming phase). Ακολουθεί η φάση πολλαπλασιασμού ή μεταβολική φάση, όπου λόγω των μεγάλων ενεργειακών αναγκών των διαιρούμενων κυττάρων, επισυμβαίνουν χαρακτηριστικά μεταβολικά γεγονότα (παροδική υπογλυκαιμία, συστηματική λιπόλυση και παροδική ηπατοκυτταρική στεάτωση), για να καλύψουν τις ανάγκες αυτές. Στο διάστημα του πολλαπλασιασμού εμφανίζονται τα παρακρινικά και τα αυτοκρινικά σήματα μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών ομάδων του ήπατος. Στα τρωκτικά η φάση αυτή ολοκληρώνεται 4 ημέρες μετά την ηπατεκτομή και ακολουθεί η τρίτη και τελευταία φάση του τερματισμού της αναγέννησης. Τότε συμβαίνει η πολυπαραγοντική ρύθμιση της λήξης του πολλαπλασιασμού. Με εκπληκτική ακρίβεια ρυθμίζεται το βάρος του ήπατος σε συνάρτηση με τη συνολικό βάρος του ζώου, με χρήση και ενός κύματος απόπτωσης, ενώ ακολουθεί αποκατάσταση της φυσιολογικής σύστασης της εξωκυττάριας ουσίας και της ιστολογικής δομής του ηπατικού ιστού. Σε ένα αντικείμενο τόσο διεξοδικά μελετημένο, εντοπίστηκε ένα νέο πεδίο έρευνας που υιοθετήθηκε στην παρούσα διατριβή: ο πιθανός ρυθμιστικός ρόλος των microRNAs στην αναγέννηση του ήπατος. Τα microRNAs είναι μικρά μόρια μη κωδικοποιητικού RNA (μήκους 22 περίπου νουκλεοτιδίων), που ανακαλύφθηκαν σχετικά πρόσφατα. Ωστόσο, με γοργούς ρυθμούς αποκαλύπτεται ο μείζονος σημασίας ρυθμιστικός ρόλος τους στην έκφραση των γονιδίων και άρα στη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών λειτουργιών. Κατά την έναρξη της παρούσας διατριβής υπήρχαν στοιχεία που ενέπλεκαν τα microRNAs στην αναγέννηση των πτερυγίων του είδους ψαριών zebrafish, τη αναγέννηση των σκωλήκων Planaria spp. και στην επούλωση του τραύματος. Διατυπώθηκε η υπόθεση ότι μπορεί να έχουν ρυθμιστικό ρόλο και στην ηπατική αναγέννηση και μεγάλο μέρος της μελέτης αφιερώθηκε στη διαλεύκανση του ρόλου αυτού. Πρώτο μέλημα των ερευνητών ήταν η βελτιστοποίηση και τυποποίηση της αναισθησιολογικής και εγχειρητικής διεργασίας, που για τον μυ δεν ήταν τόσο διαδεδομένες όσο ήταν για τον επίμυ, λόγω της δυσκολίας που παρουσιάζει η διενέργεια χειρουργικής επέμβασης σε ένα ζώο βάρους 20 γραμμαρίων. Έγιναν πολλαπλές τροποποιήσεις στις παλαιότερες τεχνικές, με αποτέλεσμα την τυποποίηση μίας διαδικασίας που εγγυάται την ταχύτατη διενέργεια της επέμβασης (12-15 λεπτά) με άριστη (95-100%) επιβίωση των πειραματόζωων. Με χρήση της προαναφερθείσας χειρουργικής μεθόδου διενεργήθηκε η πρώτη εγχειρητική πειραματική διαδικασία: Χρησιμοποιήθηκαν 56 πειραματόζωα, τα μισά εκ των οποίων υποβλήθηκαν σε 2/3 μερική ηπατεκτομή και τα υπόλοιπα μισά σε επέμβαση Sham. Λήφθηκαν τα δείγματα ηπατικού ιστού, στον χρόνο 0 και για τα χρονικά σημεία μετά αναγέννηση 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 ωρών, από 4 πειραματόζωα για κάθε χρονικό σημείο. Η πρώτη χρήση των δειγμάτων ιστού από το πρώτο πείραμα έγινε η επιβεβαίωση της συγκρισιμότητας των αποτελεσμάτων του νέου χειρουργικού μοντέλου με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας. Έγινε ανοσοϊστοχημική χρώση για ανάδειξη της πρωτεΐνης Ki-67 και άρα της χρονικής αλληλουχίας του ρυθμού πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων. Αναδείχθηκε, όπως αναμενόταν, η 36η ώρα μετά την ηπατεκτομή ως το χρονικό σημείο που ο μέγιστος αριθμός ηπατοκυττάρων βρίσκεται σε φάση πολλαπλασιασμού στον μυ. Για περαιτέρω επιβεβαίωση του χειρουργικού μοντέλου, στη συνέχεια έγινε ημιποσοτική εκτίμηση της χρονικής εξέλιξης της παροδικής ηπατοκυτταρικής στεάτωσης μετά από χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων προκύπτει ότι η μέγιστη συσσώρευση λίπους ανευρίσκεται, όπως αναμενόταν, στα χρονικά σημεία 12 και 24 ωρών (+++). Η μελέτη, στη συνέχεια, στράφηκε στην κατεύθυνση αξιολόγησης του ρόλου των microRNAs. Για τον σκοπό αυτό ακολούθησε η δεύτερη εγχειρητική πειραματική διαδικασία. Χρησιμοποιήθηκαν 20 πειραματόζωα εκ των οποίων τα μισά υποβλήθηκαν σε 2/3 μερική ηπατεκτομή ενώ τα υπόλοιπα σε επέμβαση Sham. Μετά από αναγέννηση 12 ωρών λήφθηκαν οι ηπατικοί ιστοί για μελέτη του προφίλ έκφρασης των microRNAs. Η επιλογή των 12 ωρών έγινε ως ένα χρονικό σημείο κατά τη φάση έναρξης της αναγέννησης, αλλά όχι στα πολύ αρχικά της στάδια, με γνώμονα την αναζήτηση του τυχόν ρυθμιστικού ρόλου των microRNAs. Το προφίλ έκφρασης των microRNAs μελετήθηκε με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών. Ελέγχθηκαν τα 598 microRNAs που ήταν γνωστά κατά τον καιρό της μελέτης. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι εμφανίζεται διαφορική έκφραση σε 8 microRNAs κατά την αναγέννηση. Αναλυτικότερα, τα mmu-miR-21 και mmu-miR-30b εμφάνισαν μεγαλύτερη έκφραση, ενώ τα υπόλοιπα 6 miRNAs (mmu-miR-34c, mmu-miR-144, mmu-miR-207, mmu-miR-451, mmu-miR-582-3p, mmu-miR-290-5p) εμφάνισαν μικρότερη έκφραση κατά την αναγέννηση. Τα δείγματα ιστών του δεύτερου πειράματος χρησιμοποιήθηκαν εκ νέου για επιβεβαίωση των ανωτέρω αποτελεσμάτων με τη μέθοδο RT-qPCR. Η qPCR επιβεβαίωσε το προφίλ έκφρασης των διαφορικά εκφρασμένων miRs, όπως είχαν δείξει τα δεδομένα από τα microarrays. Προέκυψε επίσης ότι το πιο σημαντικά διαφοροποιημένο mmu-miR μεταξύ αυτών που μελετήθηκαν, ήταν το mmu-miR-21. Για να συνδεθούν τα διαφοροποιημένα microRNAs με τις κυτταρικές λειτουργίες στις οποίες εμπλέκονται και πιθανώς ρυθμίζουν, εκτελέστηκε Gene Ontology ανάλυση με τη βοήθεια του TergetScan. Προέκυψε πλειάδα δυνητικών στόχων για τα εν λόγω microRNAs, με σαφή σχέση των γονιδίων-στόχων με τη διεργασία του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Από τα ως τότε αποτελέσματα, τράβηξε την προσοχή η μεγάλη μεταβολή στην έκφραση του mmu-miR-21. Αυτό, σε συνδυασμό με την γνωστή από άλλες μελέτες, εμπλοκή του mmu-miR-21 στο αναπαραγωγικό δυναμικό καρκινικών κυττάρων, αποφασίστηκε να αναζητηθεί η χρονική αλληλουχία έκφρασής του, με χρήση των δειγμάτων ηπατικού ιστού από το πρώτο πείραμα. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της RT-qPCR, που ανέδειξε σαφή υπεροχή της έκφρασης του mmu-miR-21 στις 12 ώρες μετά από τη μερική ηπατεκτομή με διατήρηση σχετικά υψηλής συγκέντρωσης ως και τις 24 ώρες. Ακολούθησε επιτυχής επιβεβαίωση του ανωτέρω αποτελέσματος με τη χρήση της μεθόδου του in situ υβριδισμού. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη πέτυχε να υποδείξει μία πολύ αποτελεσματική μέθοδο 2/3 ηπατεκτομής στον μυ. Το χειρουργικό αυτό μοντέλο αποδείχθηκε ότι έχει πλήρως συγκρίσιμα αποτελέσματα με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε η υπόθεση διαφορικής έκφρασης των microRNAs κατά τη διαδικασία της αναγέννησης. Το γεγονός αυτό, υπονοεί ότι ίσως να εμπλέκονται με κάποιο ρυθμιστικό ρόλο στη διαδικασία αυτή. Το mmu-miR-21 αναδεικνύεται ως το μάλλον σημαντικότερο από αυτά. Τα δεδομένα από την παρούσα μελέτη συμπληρώνουν τις έως τώρα γνώσεις για το φαινόμενο της ηπατικής αναγέννησης, αλλά και ανοίγουν δρόμους για νέο προσανατολισμό στην έρευνα, όπως την παραπέρα διαλεύκανση του τρόπου δράσης αυτών των microRNAs που εντοπίστηκαν ή τον τυχόν ρόλο τους και στις φάσεις πολλαπλασιασμού ή τερματισμού της αναγέννησης. / Liver regeneration is a unique ability, because of the way it proceeds, i.e. the proliferation of all categories of all mature liver cell types. It is highly possible that this ability is known to human kind since the ancient times, as pictured in Prometheus’ myth. The great scientific interest towards deciphering this complex process is, of course, highly justified. The most common model for the study of the process of regeneration is the surgical model of the 2/3 partial hepatectomy (PHx) in small rodents, predominantly the rat. 2/3 partial hepatectomy leads to a highly synchronized hepatocyte cell-cycle entry and progres¬sion. The first phase, known as the ‘priming phase’, occurs in the first hours after PH and poises the hepatocytes to enter the G1 phase and to become receptive to growth factors. The second phase corresponds to an increased metabolic demand imposed on the remnant liver. During this phase, among other metabolic changes, transient hypoglycemia is suggested to induce systemic lipolysis followed by a lipid droplets accumulation in the hepa¬tocytes. During this phase, am major role is played by the autocrine intercellular network. In rodents, this phase is completed in 4 days post-PHx and is followed by the termination phase. Ending the regenerative process is an equally complex, multiparameter process. The weight of the liver is regulated proportionally to the animal’s body weight with remarkable accuracy, sometimes employing an apoptotic wave. The termination phase of the regenerative process ends with normal hepatic histological structure restoration and matrix remodeling. Liver regeneration is a phenomenon that has been thoroughly studied in the past. Nevertheless, a point of emerging research interest has been adopted in the present study: the possible regulatory role of microRNAs in liver regeneration. MicroRNAs are small non-coding RNA molecules (approx. 22 nts long), which have been discovered quite recently but through research they are quickly emerging as cornerstone regulatory means in a large number of cellular functions. In the beginning of this study, data existed implicating microRNAs in the regeneration of zebrafish fins, regeneration in planarian worms and wound healing. The hypothesis that they may have a role in liver regeneration was made and a large part of this study is concerned with investigating the existence of such a role. The researchers began with revising and standardizing the method for anesthesia and surgical procedure, which, at the time (2007), were not satisfactory enough in the case of mice (as opposed to the widely used rats), possibly because of the difficulty of operating on a 20 gram animal. Many alterations were made upon the previous techniques. As a result, a procedure was standardized, as described herein, that guarantees a fast procedure (12-15 minutes) accompanied by excellent animal survival (95-100%). Using the above described technique, the first surgical experiment in this study was conducted: 56 animals (wild-type mice) were used, half of which were subjected to 2/3 PHx and the other half were sham operated. Liver samples were collected at time 0 and at several time points during regeneration (1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 hours), with a number of 4 animals per time point. These samples were used in order to confirm the comparability of the new surgical technique to bibliography models. An immunohistochemical dye for the protein Ki-67 was performed, thus revealing the number of hepatic cells undergoing proliferation at each time point. The 36th hour post-PHx emerged as the point of climax of the proliferative process in the mouse, as expected by previous studies. For further confirmation, the same samples were used to produce simple histological H-E slides, in order to evaluate the evolvement of lipid droplet accumulation in hepatic cells associated with liver regeneration. A semi-quantitative evaluation was conducted, that revealed that maximum lipid accumulation occurs at the time points of 12 and 24 hours (+++) in mouse, again as expected by previous studies. Then the study proceeded with investigating the potential role of microRNAs in liver regeneration. For this, a second surgical experiment was conducted: This time 20 animals (wild-type mice) were used, half of which were subjected to 2/3 PHx and the other half were sham operated. After regenerating for 12 hours, liver samples were harvested from all animals. The choice of the 12-hour interval was made as a time point at the beginning phase of liver regeneration, but not at the very early beginning, with a view to reveal the possible regulatory role of microRNAs at the first stage of the regenerative process. MicroRNA profiling was conducted using specific microarrays, examining the presence of the 598 microRNAs known at the time of this procedure. The results pointed out 8 differentially expressed microRNAs during regeneration: 2 that were up-regulated (-miR-21 and mmu-miR-30b) and 6 that were down-regulated (mmu-miR-34c, mmu-miR-144, mmu-miR-207, mmu-miR-451, mmu-miR-582-3p, mmu-miR-290-5p). Tissue samples from the second experiment were used again in order to confirm the aforementioned results utilizing the RT-qPCR method. This indeed confirmed the microarrays’ results and highlighted mmu-miR-21 as the most differentially expressed miR, indicating a possibly major regulatory role in liver regeneration. In order to link these differentially expressed microRNAs to their cellular and molecular functions, Gene Ontology Analysis was conducted, using TargetScan. Many putative gene-targets for each microRNA emerged, many of which are involved in the process of cellular proliferation. Following the emergence of the major differentiation of mmu-miR-21 within the results of qPCR evaluation and with previous research linking it with cancer cell proliferation regulation, it was decided to further assess the time kinetics of the expression of mmu-miR-21, utilizing tissue samples from the first experiment. Through an RT-qPCR evaluation, it was shown that up-regulation of mmu-miR-21 reaches its zenith at 12 hours post-PHx and remains quite highly expressed until 24 hours. This was further confirmed by in situ hybridization. In conclusion, we were able to standardize a very successful version of the 2/3 hepatectomy procedure adapted for mice. Using this model, the hypothesis of the altered expression of microRNAs during liver regeneration is confirmed, setting suspicion about some kind of regulatory role. Mmu-miR-21 emerges as the most differentially expressed one and possibly having the most important role. The data from the present study supplement preexisting knowledge on the phenomenon of liver regeneration, but also show the way for future research in further clarifying the paths leading to microRNAs’ regulatory role or investigating their potential role in the phases of proliferation or termination of liver regeneration.