No description available.

No description available.

Partial hepatectomy (PH) is a treatment of choice for patients suffering from early stage hepatocellular carcinoma (HCC). Ablation of large proportion of the liver is rendered possible because of the ability of the liver to regenerate. Yet, a significant number of patients will experience recursion of the disease. Such relapses are unfortunately rather frequent and constitute a bad prognosis. The development of new strategies aiming at reducing the risk of recursion of HCC is thus a paramount element of the surgery-based treatment. Some previous studies have proposed that the regenerative process as well as the fate of the immune cells during the liver regeneration process is linked to this recurrence phenomenon.In this study, we investigated the impact of PH on HCC development in a pre-clinical murine model. We implanted Hepa1-6 hepatocarcinoma cells (a murine hepatocarcinoma cell line) directly in the liver of mice and compared a non-resected group with a group undergoing 40% PH one week following tumor implantation. Analysis were relying on bioluminescence imaging and flow cytometry. We demonstrated that liver regeneration increases tumoral proliferation. This proliferation was associated with a reduction in the number of liver resident macrophages, i.e. Kupffer cells (KC). KC anti-tumoral activity was also proved using conditional ablation model. We further studied the mechanisms leading to this disappearance and demonstrated that, under normal regeneration conditions, PH-induced KC number reduction was dependent on tumor necrosis factor-α (TNF-α), receptor interacting protein kinase (RIPK) 3 and caspase-8 activation whereas interleukin (IL)-6 acted as a KC pro- survival signal. In mice with previous Hepa 1-6 encounter, the KC reduction changed toward a TNF-α-RIPK3-caspase-1 activation. This data suggest a switch from apoptosis to pyroptosis induction in KC following PH. Moreover, KC disappearance associated with caspase-1 activity induced the recruitment of monocyte derived cells that are beneficial for tumor growth while caspase-8 dependent reduction did not, underlying the importance of macrophages activated death-pathway in regulating the anti-tumoral immune response. Our results show the necessity for comprehensive multidisciplinary treatment approach following PH and propose new targets in order to reduce the relapse of the disease occurring after surgery. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20240号 / 医博第4199号 / 新制||医||1020(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 安達 泰治, 教授 小西 靖彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

No description available.

A perda do parênquima hepático, induzida por tratamento agudo, cirúrgico ou químico, desencadeia um processo regenerativo até que a massa hepática seja completamente restaurada. A regeneração hepática, após a hepatectomia parcial de 70%, é um dos modelos mais adequados de regeneração de células, órgãos e tecidos mais estudados. No fígado, ainda que sejam atribuídas propriedades regenerativas, muitas das lesões são tão prejudiciais que este mecanismo de reparação é insuficiente, tornando o transplante a única opção. As células derivadas do broto hepático de ratos apresentam uma boa alternativa para tratamento de doenças hepáticas devido ao seu alto índice proliferativo e da expressão de marcadores de pluripotência, sendo sua aplicabilidade viável em modelos experimentais. O objetivo deste trabalho foi analisar as diferentes vias de administração das células derivadas do broto hepático de ratos com 12,5 dias de gestação visando a melhor regeneração do órgão. Foram realizados experimentos de hepatectomia parcial de 70% (N=50 animais), PET Scan MSFX PRO In-Vivo RX e fluorescência, índice hepatossomático, análise de marcadores solúveis (GH, AFP, CEA, IGF-1), análises hematológicas, microscopia de luz (coloração HE, Tricômio de Masson), análise de marcadores por citometria de fluxo (CD90, STRO-1, Nanog, Oct3/4, Ki-67, Caspase 3) e ciclo celular por citometria de fluxo. Nossos dados demonstraram que as células do broto hepático administradas na via endotraqueal apresentaram melhor equilíbrio entre proliferação e morte celular, com maior expressão dos marcadores de pluripotência, melhor organização celular e regeneração tecidual, em contraste com outras vias, incluindo endovenosa, intraperitoneal e oroenteral. Isto a torna mais segura e de maior viabilidade na regeneração celular em relação às demais vias, sendo mais eficiente nos modelos de hepatectomia parcial / The restoration of liver parenchyma after partial hepatectomy or chemical treatments represents appropriate models to study regeneration mechanisms. The most appropriate model for liver regeneration is partial hepatectomy of 70%, however, organ repair properties are insufficient, suggesting the transplantation the best alternative to treat liver diseases. Cells derived from liver buds of rats show a high proliferative index and the expression of pluripotency markers; thus their significance for regeneration purposes can be tested experimentally. We here investigated different routes to administer cells derived from rat live buds of 12.5 days of gestation to adult individuals (N=50 animals) suffering from partial hepatectomy (70%). Applied methods included PET Scan MSFX PRO In-Vivo RX, fluorescence hepatossomatic index, analysis of soluble markers (GH, AFP, CEA, IGF-1), hematological analysis, light microscopy (staining HE, and Masson trichrome) as well as flow cytometry for cell cycle analysis and CD90, STRO-1, Nanog, OCT3/4, Ki-67, Caspase 3 expression. Our data showed that administration via the tracheal route resulted as favorite in regard to the balance between proliferation and cell deaths, of pluripotency marker expression, cellular organization and tissue regeneration, in contrast to other routes including: intravenous, intraperitoneal and oroenteral. Consequently, the tracheal route showed safer and more efficient treatment to enhance cell regeneration after partial hepatectomy

ΣΚΟΠΟΣ: Σήμερα είναι πλέον γνωστό ότι το χολοστατικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία από το φυσιολογικό ήπαρ. Η ηπατική αναγέννηση μετά μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ) ρυθμίζεται από διάφορους παράγοντες οι οποίοι ενεργοποιούν ή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων. Ένα από τα κυτταρικά στοιχεία που συμβάλλει στην αναγέννηση του ήπατος είναι το ηπατοκύτταρο με χολαγγειακή μορφολογία (DΗ). Από την άλλη μεριά, η απόπτωση φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ηπατική αναγέννηση. Στην παρούσα μελέτη, μετά από Ρηχ σε φυσιολογικούς ποντικούς και σε άλλους με ίκτερο, με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία, ερευνήσαμε: α) τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ισχαιμικής ηπατικής βλάβης και αναγέννησης, β) το δυνητικό ρόλο των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία κατά τη διάρκεια της ηπατικής αναγέννησης και γ)την έκφραση των γονιδίων bcl-2 και bax, τα οποία σχετίζονται με την απόπτωση, καθώς και την παρουσία της απόπτωσης. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Η μελέτη συμπεριέλαβε 140 ποντικούς Wistar οι οποίοι χωρίστηκαν σε 14 ομάδες: Ι –control, II - εγχείρηση sham. III-IV-V-παροδικός αγγειακός αποκλεισμός ηπατικής αρτηρίας και πυλαίας φλέβας (ολική ηπατική ισχαιμία) (TLI) για 15-30-60 λεπτά αντίστοιχα. VI - απολίνωση του κοινού χοληδόχου πόρου (BDL) για 10 ημέρες, VII-VIII-ΙΧ-BDL-ΤLI-ΡΗχ. Χ-μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ 68%}, XI- ΡΗχ + TLI (30 min), XII-BDL+ΡΗχ, XIII-BDL+ ΡΗχ+TLI (30 min) και XIV- BDL+TLI (30 min) + ΡΗχ. Τα ζώα θυσιάστηκαν 24 και 48 ώρες μετά από Ρηχ, με εξαίρεση τις περιπτώσεις όπου η κατάσταση υγείας ήταν κρίσιμη. Η μελέτη του ηπατικού ιστού περιελάμβανε: (α) Η&Α stain, (β) υβριδισμό in situ (ανίχνευση mRΝΑ των bcl-2 και bax σε παραφίνη, (γ) ανάλυση Western Blot για τη μελέτη των πρυτεϊνικών επιπέδων των bcl-2 και bax, (δ) in situ υβριδισμός (TUNEL) για την ανίχνευση παραγόντων απόπτωσης, (ε) ανοσοϊστοχημικά stains σε παραφίνη (μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης) με σκοπό να μελετηθεί η έκφραση των ακόλουθων αντιγόνων: κυτοκερατίνη 7 και 19 (χολικός φαινότυπος), ηπατοκυτταρίκή και α1-σντιθρυψίνη (ηπατοκυτταρικός φαινότυπος), βιμεντίνη, CD34, α-φετοπρωτείνη, GST-π(γλουταθειονιν-S-τρανσφεράση-π). Κι67 (κυτταρικός πολλαπλασιασμός), bcl-2 και bax (γονίδια απόπτωσης). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ήπαρ από ποντικούς α)με TLI ανέπτυξε βλάβες ηπατικής ισχαιμίας, β)με BDL βλάβες ηπατικής απόφραξης, γ)με BDL+TLI ανέπτυξαν βλάβες ηπατικής ισχαιμίας μαζί με αλλαγές λόγω απόφραξης των χοληφόρων. Το ποσοστό του επηρεασμένου ηπατικού παρεγχύματος (%ηπατικής νέκρωσης) ήταν υψηλότερο στις ομάδες με TLI+BDL. Σε αυτές τις ομάδες, ο ηπατοκυτταρικός δείκτης (δείκτης πολλαπλασιασμού) του Κi67 ήταν μικρότερος από τον αντίστοιχο της ομάδας χωρίς TLI. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το χολοστστικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία κι εκδηλώνει μειωμένη αναγεννητική ικανότητα, συγκρινόμενο με μη χολοστατικό ήπαρ. Βιοψίες ήπατος έδειξαν χαρακτήρες ηπατικής αναγέννησης προερχόμενης από τη ζώνη 2, η οποία επεκτεινόταν στη ζώνη 1 και κάποιες φορές στη ζώνη 3. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ανέδειξαν κύτταρα θετικά στο ΑΕ1 και κύτταρα θετικά στο ΗΕΡΡΑΡ. Σε όλες τις ομάδες με TLI τα ηπατοκύτταρα χολαγγειακής μορφολογίας εμφανίζονταν κυρίως σε περιοχές περι-πυλαίες. Εξέφραζαν κυτοκερατίνες 19 και 7, ηπατοκυτταρίκή και α1-αντιθρυψίνη ενώ εμφάνιζαν και συνδυασμένη έκφραση CΚ7/CΚ19 και ηπατοκυτταρική ή ΑΕ1/CΚ19 και α1-αντιθρυψϊνη. Το ποσοστό των κυττάρων αυτών ήταν ευθέως ανάλογο με το χρόνο επιβίωσης των ζώων (r=0,354, ρ<0,05). Όσον αφορά την απόπτωση, προ ηπατεκτομής, τα επίπεδα του bcl-2 ( πρωτεΐνη ή mRΝΑ) ήταν υψηλότερα σε ποντικούς με ίκτερο απ' ό,τι στους ποντικούς controls. Επιπλέον τα επίπεδα του bax (πρωτεΐνη ή mRΝΑ) και ο σωματικός δείκτης απόπτωσης (ΑΒΙ) ήταν υψηλότερα σε χολοστατικό ήπαρ. Μετά ηπατεκτομή, παρατηρήθηκε πρώιμη ελάττωση των επιπέδων πρωτεϊνών και mRΝΑ του γονιδίου bcl-2 και μια ύστερη αύξηση του προ-αποπτωτικού γονιδίου bax και του ΑΒΙ, σε σύγκριση με τα controls. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Σε περιπτώσεις αποφρακτικού ίκτερου (χολαγγειοπάθεια), η ηπατική ισχαιμία καθιστά το όργανο πιο ευαίσθητο σε ενδεχόμενη βλάβη, καθώς προκαλεί ευρύτερη νέκρωση παρεγχύματος και ελαττώνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων, Η διεργασία αναγέννησης του ήπατος επιτελείται κυρίως μέσω του πολλαπλασιασμού μη νεκρωτικών κυττάρων τα οποία εκφράζουν ηπατοκυτταρικά ή χολαγγειακά επιθηλιακά χαρακτηριστικά. Σε τέτοιες περιπτώσεις, το κύριο στοιχείο της ηπατικής αναγέννησης αποτελεί η παρουσία των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία (κύτταρα που εκδηλώνουν φαινότυπο ενδιάμεσο μεταξύ κυττάρων χολαγγειακής και ηπατικής προέλευσης) και η διαφοροποίηση τους σε ώριμα ηπατοκύτταρα. Τέλος, η απόπτωση έχει ρόλο στο χολοστατικό ήπαρ με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία και πιστεύεται ότι μπορεί να συμβάλλει στην παρουσία κατεσταλμένης αναγεννητικής απόκρισης που παρατηρήθηκε σε ήπαρ ποντικών με ίκτερο μετά από μερική ηπατεκτομή. / AIM: Today, it is known that cholestatic liver is more susceptible to ischemia than normal liver. Liver regeneration after partial hepatectomy (PHx) is regulated by several factors that activate or inhibit hepatocyte proliferation. One of the cellular elements that contributes to liver regeneration is ductular hepatocyte (DH). On the other hand, apoptosis seems to play an important role in cellular proliferation and liver regeneration. In this study and. after PHx. in normal and jaundiced rats with or without superimposed ischemia, we assessed a) the histopathologic features of hepatic Ischemic damage and liver regeneration, b) the potential role of ductular hepatocytes during liver regeneration and c) the expression apoptosis-asscciated genes bcl-2 and bax. and the presence of apoptosis, MATERIALS £ METHODS: The study comprised 140 male Wistar rats, assigned randomly in 14-groups: l-controls. ll-sham. Ill-IV-V-cIamping of hepatic artery and portal vein (total liver Ischemia-TLI) for 15-30-60 min respectively. Vl-common bile duct ligation (BDL) for lOdays. VII-VIII-IX-BDL-TLI-X-partial hepatectomy(PHx-68%). XI-PHx+TLI(30min). XU-BDL+PHx. XIII-BDL+PHx+TLI(30min) and XIV-BDL+TLI (30min)+PHx. Animals were sacrificed 24 and 48hrs after PHx unless their condition was critical. Liver tissue evaluation Included: (a) H&E stain, (b) in situ hybridization (detection of bcl-2 and bax mRNA) in paraffin sections, (c) Western blot analysis for the evaluation of bcl-2 and bax protein levels, (d) in situ hybridization (TUNEL) for the detection of apoptotic bodies, and (e) immunohistochemical stains (streptavidin-biotin method) in paraffin sections, in order to evaluate the expression of the following antigens: cytokeratins 7 and 16 (biliary phenotype), Hepatocyte and a 1-antitrypsin (hepatocytic phenotype), vimentin, CD34, alpha-fetoprotein, GST-pi (glutahione-S-trarsferase-pi), Ki67 cell proliferation), bcl-2 and bax (apoptotlc genes). RESULTS: Sections from rats a) with TLI developed changes of liver ischemia, b) with BDL changes of liver obstruction and c) with BDL+TLI developed changes of ischemia together with changes of biliary obstruction. The total liver parenchymal area affected (% liver necrosis} was higher in groups with TLI+BDL. In these groups the Ki67 hepatocytic index (proliferation index) was lower compared to the groups without TLI. This finding implies that cholestatic livers are more vulnerable to ischemia and also display impaired generative capabilities, compared to non-cholestatic ones. Liver biopsies exhibited features of liver regeneration that originated from zone 2, extended to zone 1 and occasionally to zone 3. Immunonistochemical stains revealed cells positive to AE1 and cells positive to HEPPAR. In all groups with TLI, DHs appeared mainly in periportal areas. They expressed cytokeratirs-19 and 7. hepatocyte and al-antrtrypsm and co-expressed CK7/CK1S and Hepatocyte or AE1/CK1S and a 1-antitrypsin The percentage of DHs was directly correlated with the time that animals survived (r=0,354, p<0,05). Regarding apoptosis, before hepatectomy, bcl-2 (protein or mRNA} levels were higher in jaundiced rats vs controls. Furthermore, bax (protein or mRNA) levels and apoptotic body index (ABl) were higher in cholestatic livers. After hepatectomy, there was an early decease in the protein and mRNA levels of antiapoptotic gene bcl-2 and a late increase of proapoptotic gene bax and the A8I. compared to controls. CONCLUSIONS: In cases with obstructive jaundice (cholangiopathy), liver ischemia makes the organ more vulnerable to damage because it causes greater parenchymal necrosis and decreases the degree of hepatocyles proliferation. Liver regenerative process is mediated mainly by proliferation of non-necrotic cells that express hepatocellular or ductular epithelial features. In such cases a main element of liver regeneration is the presence of DHs, cells that display a phenotype intermediate between ductular and hepatocytic origin} and their differentiation to mature hepatocytes. Finally, apoptosis takes place in cholestatic livers with or without superimposed ischemia and may contribute in the impaired regenerative response observed in livers of jaundiced rats after partial hepatectomy.

Η αναγέννηση, με τον τρόπο που αυτή επιτελείται στο ήπαρ, δηλαδή με πολλαπλασιασμό των ώριμων κυττάρων όλων των κυτταρικών ομάδων του οργάνου, είναι μία μοναδική ιδιότητα. Πιθανώς η ιδιότητα αυτή να είναι γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων, όπως συμβολίζεται στον μύθο του Προμηθέα. Απόλυτα δικαιολογημένο, εκ τούτου, είναι το μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον απέναντι στη μοναδική αυτή διεργασία. Το συνηθέστερο μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της αναγέννησης είναι η χειρουργική ηπατεκτομή σε μικρά τρωκτικά (κατά κύριο λόγο στον επίμυ). Μετά τη διενέργεια της επέμβασης παρατηρείται συγχρονισμένη είσοδος των ηπατοκυττάρων –αρχικά- και των λοιπών κυτταρικών ομάδων -στη συνέχεια- στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και σε προετοιμασία πολλαπλασιασμού. Στην πρώτη αυτή φάση τα ηπατοκύτταρα γίνονται δεκτικά στη δράση μίας πλειάδας αυξητικών παραγόντων. Αυτή είναι η εναρκτήρια φάση της αναγέννησης (priming phase). Ακολουθεί η φάση πολλαπλασιασμού ή μεταβολική φάση, όπου λόγω των μεγάλων ενεργειακών αναγκών των διαιρούμενων κυττάρων, επισυμβαίνουν χαρακτηριστικά μεταβολικά γεγονότα (παροδική υπογλυκαιμία, συστηματική λιπόλυση και παροδική ηπατοκυτταρική στεάτωση), για να καλύψουν τις ανάγκες αυτές. Στο διάστημα του πολλαπλασιασμού εμφανίζονται τα παρακρινικά και τα αυτοκρινικά σήματα μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών ομάδων του ήπατος. Στα τρωκτικά η φάση αυτή ολοκληρώνεται 4 ημέρες μετά την ηπατεκτομή και ακολουθεί η τρίτη και τελευταία φάση του τερματισμού της αναγέννησης. Τότε συμβαίνει η πολυπαραγοντική ρύθμιση της λήξης του πολλαπλασιασμού. Με εκπληκτική ακρίβεια ρυθμίζεται το βάρος του ήπατος σε συνάρτηση με τη συνολικό βάρος του ζώου, με χρήση και ενός κύματος απόπτωσης, ενώ ακολουθεί αποκατάσταση της φυσιολογικής σύστασης της εξωκυττάριας ουσίας και της ιστολογικής δομής του ηπατικού ιστού. Σε ένα αντικείμενο τόσο διεξοδικά μελετημένο, εντοπίστηκε ένα νέο πεδίο έρευνας που υιοθετήθηκε στην παρούσα διατριβή: ο πιθανός ρυθμιστικός ρόλος των microRNAs στην αναγέννηση του ήπατος. Τα microRNAs είναι μικρά μόρια μη κωδικοποιητικού RNA (μήκους 22 περίπου νουκλεοτιδίων), που ανακαλύφθηκαν σχετικά πρόσφατα. Ωστόσο, με γοργούς ρυθμούς αποκαλύπτεται ο μείζονος σημασίας ρυθμιστικός ρόλος τους στην έκφραση των γονιδίων και άρα στη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών λειτουργιών. Κατά την έναρξη της παρούσας διατριβής υπήρχαν στοιχεία που ενέπλεκαν τα microRNAs στην αναγέννηση των πτερυγίων του είδους ψαριών zebrafish, τη αναγέννηση των σκωλήκων Planaria spp. και στην επούλωση του τραύματος. Διατυπώθηκε η υπόθεση ότι μπορεί να έχουν ρυθμιστικό ρόλο και στην ηπατική αναγέννηση και μεγάλο μέρος της μελέτης αφιερώθηκε στη διαλεύκανση του ρόλου αυτού. Πρώτο μέλημα των ερευνητών ήταν η βελτιστοποίηση και τυποποίηση της αναισθησιολογικής και εγχειρητικής διεργασίας, που για τον μυ δεν ήταν τόσο διαδεδομένες όσο ήταν για τον επίμυ, λόγω της δυσκολίας που παρουσιάζει η διενέργεια χειρουργικής επέμβασης σε ένα ζώο βάρους 20 γραμμαρίων. Έγιναν πολλαπλές τροποποιήσεις στις παλαιότερες τεχνικές, με αποτέλεσμα την τυποποίηση μίας διαδικασίας που εγγυάται την ταχύτατη διενέργεια της επέμβασης (12-15 λεπτά) με άριστη (95-100%) επιβίωση των πειραματόζωων. Με χρήση της προαναφερθείσας χειρουργικής μεθόδου διενεργήθηκε η πρώτη εγχειρητική πειραματική διαδικασία: Χρησιμοποιήθηκαν 56 πειραματόζωα, τα μισά εκ των οποίων υποβλήθηκαν σε 2/3 μερική ηπατεκτομή και τα υπόλοιπα μισά σε επέμβαση Sham. Λήφθηκαν τα δείγματα ηπατικού ιστού, στον χρόνο 0 και για τα χρονικά σημεία μετά αναγέννηση 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 ωρών, από 4 πειραματόζωα για κάθε χρονικό σημείο. Η πρώτη χρήση των δειγμάτων ιστού από το πρώτο πείραμα έγινε η επιβεβαίωση της συγκρισιμότητας των αποτελεσμάτων του νέου χειρουργικού μοντέλου με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας. Έγινε ανοσοϊστοχημική χρώση για ανάδειξη της πρωτεΐνης Ki-67 και άρα της χρονικής αλληλουχίας του ρυθμού πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων. Αναδείχθηκε, όπως αναμενόταν, η 36η ώρα μετά την ηπατεκτομή ως το χρονικό σημείο που ο μέγιστος αριθμός ηπατοκυττάρων βρίσκεται σε φάση πολλαπλασιασμού στον μυ. Για περαιτέρω επιβεβαίωση του χειρουργικού μοντέλου, στη συνέχεια έγινε ημιποσοτική εκτίμηση της χρονικής εξέλιξης της παροδικής ηπατοκυτταρικής στεάτωσης μετά από χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων προκύπτει ότι η μέγιστη συσσώρευση λίπους ανευρίσκεται, όπως αναμενόταν, στα χρονικά σημεία 12 και 24 ωρών (+++). Η μελέτη, στη συνέχεια, στράφηκε στην κατεύθυνση αξιολόγησης του ρόλου των microRNAs. Για τον σκοπό αυτό ακολούθησε η δεύτερη εγχειρητική πειραματική διαδικασία. Χρησιμοποιήθηκαν 20 πειραματόζωα εκ των οποίων τα μισά υποβλήθηκαν σε 2/3 μερική ηπατεκτομή ενώ τα υπόλοιπα σε επέμβαση Sham. Μετά από αναγέννηση 12 ωρών λήφθηκαν οι ηπατικοί ιστοί για μελέτη του προφίλ έκφρασης των microRNAs. Η επιλογή των 12 ωρών έγινε ως ένα χρονικό σημείο κατά τη φάση έναρξης της αναγέννησης, αλλά όχι στα πολύ αρχικά της στάδια, με γνώμονα την αναζήτηση του τυχόν ρυθμιστικού ρόλου των microRNAs. Το προφίλ έκφρασης των microRNAs μελετήθηκε με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών. Ελέγχθηκαν τα 598 microRNAs που ήταν γνωστά κατά τον καιρό της μελέτης. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι εμφανίζεται διαφορική έκφραση σε 8 microRNAs κατά την αναγέννηση. Αναλυτικότερα, τα mmu-miR-21 και mmu-miR-30b εμφάνισαν μεγαλύτερη έκφραση, ενώ τα υπόλοιπα 6 miRNAs (mmu-miR-34c, mmu-miR-144, mmu-miR-207, mmu-miR-451, mmu-miR-582-3p, mmu-miR-290-5p) εμφάνισαν μικρότερη έκφραση κατά την αναγέννηση. Τα δείγματα ιστών του δεύτερου πειράματος χρησιμοποιήθηκαν εκ νέου για επιβεβαίωση των ανωτέρω αποτελεσμάτων με τη μέθοδο RT-qPCR. Η qPCR επιβεβαίωσε το προφίλ έκφρασης των διαφορικά εκφρασμένων miRs, όπως είχαν δείξει τα δεδομένα από τα microarrays. Προέκυψε επίσης ότι το πιο σημαντικά διαφοροποιημένο mmu-miR μεταξύ αυτών που μελετήθηκαν, ήταν το mmu-miR-21. Για να συνδεθούν τα διαφοροποιημένα microRNAs με τις κυτταρικές λειτουργίες στις οποίες εμπλέκονται και πιθανώς ρυθμίζουν, εκτελέστηκε Gene Ontology ανάλυση με τη βοήθεια του TergetScan. Προέκυψε πλειάδα δυνητικών στόχων για τα εν λόγω microRNAs, με σαφή σχέση των γονιδίων-στόχων με τη διεργασία του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Από τα ως τότε αποτελέσματα, τράβηξε την προσοχή η μεγάλη μεταβολή στην έκφραση του mmu-miR-21. Αυτό, σε συνδυασμό με την γνωστή από άλλες μελέτες, εμπλοκή του mmu-miR-21 στο αναπαραγωγικό δυναμικό καρκινικών κυττάρων, αποφασίστηκε να αναζητηθεί η χρονική αλληλουχία έκφρασής του, με χρήση των δειγμάτων ηπατικού ιστού από το πρώτο πείραμα. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της RT-qPCR, που ανέδειξε σαφή υπεροχή της έκφρασης του mmu-miR-21 στις 12 ώρες μετά από τη μερική ηπατεκτομή με διατήρηση σχετικά υψηλής συγκέντρωσης ως και τις 24 ώρες. Ακολούθησε επιτυχής επιβεβαίωση του ανωτέρω αποτελέσματος με τη χρήση της μεθόδου του in situ υβριδισμού. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη πέτυχε να υποδείξει μία πολύ αποτελεσματική μέθοδο 2/3 ηπατεκτομής στον μυ. Το χειρουργικό αυτό μοντέλο αποδείχθηκε ότι έχει πλήρως συγκρίσιμα αποτελέσματα με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε η υπόθεση διαφορικής έκφρασης των microRNAs κατά τη διαδικασία της αναγέννησης. Το γεγονός αυτό, υπονοεί ότι ίσως να εμπλέκονται με κάποιο ρυθμιστικό ρόλο στη διαδικασία αυτή. Το mmu-miR-21 αναδεικνύεται ως το μάλλον σημαντικότερο από αυτά. Τα δεδομένα από την παρούσα μελέτη συμπληρώνουν τις έως τώρα γνώσεις για το φαινόμενο της ηπατικής αναγέννησης, αλλά και ανοίγουν δρόμους για νέο προσανατολισμό στην έρευνα, όπως την παραπέρα διαλεύκανση του τρόπου δράσης αυτών των microRNAs που εντοπίστηκαν ή τον τυχόν ρόλο τους και στις φάσεις πολλαπλασιασμού ή τερματισμού της αναγέννησης. / Liver regeneration is a unique ability, because of the way it proceeds, i.e. the proliferation of all categories of all mature liver cell types. It is highly possible that this ability is known to human kind since the ancient times, as pictured in Prometheus’ myth. The great scientific interest towards deciphering this complex process is, of course, highly justified. The most common model for the study of the process of regeneration is the surgical model of the 2/3 partial hepatectomy (PHx) in small rodents, predominantly the rat. 2/3 partial hepatectomy leads to a highly synchronized hepatocyte cell-cycle entry and progres¬sion. The first phase, known as the ‘priming phase’, occurs in the first hours after PH and poises the hepatocytes to enter the G1 phase and to become receptive to growth factors. The second phase corresponds to an increased metabolic demand imposed on the remnant liver. During this phase, among other metabolic changes, transient hypoglycemia is suggested to induce systemic lipolysis followed by a lipid droplets accumulation in the hepa¬tocytes. During this phase, am major role is played by the autocrine intercellular network. In rodents, this phase is completed in 4 days post-PHx and is followed by the termination phase. Ending the regenerative process is an equally complex, multiparameter process. The weight of the liver is regulated proportionally to the animal’s body weight with remarkable accuracy, sometimes employing an apoptotic wave. The termination phase of the regenerative process ends with normal hepatic histological structure restoration and matrix remodeling. Liver regeneration is a phenomenon that has been thoroughly studied in the past. Nevertheless, a point of emerging research interest has been adopted in the present study: the possible regulatory role of microRNAs in liver regeneration. MicroRNAs are small non-coding RNA molecules (approx. 22 nts long), which have been discovered quite recently but through research they are quickly emerging as cornerstone regulatory means in a large number of cellular functions. In the beginning of this study, data existed implicating microRNAs in the regeneration of zebrafish fins, regeneration in planarian worms and wound healing. The hypothesis that they may have a role in liver regeneration was made and a large part of this study is concerned with investigating the existence of such a role. The researchers began with revising and standardizing the method for anesthesia and surgical procedure, which, at the time (2007), were not satisfactory enough in the case of mice (as opposed to the widely used rats), possibly because of the difficulty of operating on a 20 gram animal. Many alterations were made upon the previous techniques. As a result, a procedure was standardized, as described herein, that guarantees a fast procedure (12-15 minutes) accompanied by excellent animal survival (95-100%). Using the above described technique, the first surgical experiment in this study was conducted: 56 animals (wild-type mice) were used, half of which were subjected to 2/3 PHx and the other half were sham operated. Liver samples were collected at time 0 and at several time points during regeneration (1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 hours), with a number of 4 animals per time point. These samples were used in order to confirm the comparability of the new surgical technique to bibliography models. An immunohistochemical dye for the protein Ki-67 was performed, thus revealing the number of hepatic cells undergoing proliferation at each time point. The 36th hour post-PHx emerged as the point of climax of the proliferative process in the mouse, as expected by previous studies. For further confirmation, the same samples were used to produce simple histological H-E slides, in order to evaluate the evolvement of lipid droplet accumulation in hepatic cells associated with liver regeneration. A semi-quantitative evaluation was conducted, that revealed that maximum lipid accumulation occurs at the time points of 12 and 24 hours (+++) in mouse, again as expected by previous studies. Then the study proceeded with investigating the potential role of microRNAs in liver regeneration. For this, a second surgical experiment was conducted: This time 20 animals (wild-type mice) were used, half of which were subjected to 2/3 PHx and the other half were sham operated. After regenerating for 12 hours, liver samples were harvested from all animals. The choice of the 12-hour interval was made as a time point at the beginning phase of liver regeneration, but not at the very early beginning, with a view to reveal the possible regulatory role of microRNAs at the first stage of the regenerative process. MicroRNA profiling was conducted using specific microarrays, examining the presence of the 598 microRNAs known at the time of this procedure. The results pointed out 8 differentially expressed microRNAs during regeneration: 2 that were up-regulated (-miR-21 and mmu-miR-30b) and 6 that were down-regulated (mmu-miR-34c, mmu-miR-144, mmu-miR-207, mmu-miR-451, mmu-miR-582-3p, mmu-miR-290-5p). Tissue samples from the second experiment were used again in order to confirm the aforementioned results utilizing the RT-qPCR method. This indeed confirmed the microarrays’ results and highlighted mmu-miR-21 as the most differentially expressed miR, indicating a possibly major regulatory role in liver regeneration. In order to link these differentially expressed microRNAs to their cellular and molecular functions, Gene Ontology Analysis was conducted, using TargetScan. Many putative gene-targets for each microRNA emerged, many of which are involved in the process of cellular proliferation. Following the emergence of the major differentiation of mmu-miR-21 within the results of qPCR evaluation and with previous research linking it with cancer cell proliferation regulation, it was decided to further assess the time kinetics of the expression of mmu-miR-21, utilizing tissue samples from the first experiment. Through an RT-qPCR evaluation, it was shown that up-regulation of mmu-miR-21 reaches its zenith at 12 hours post-PHx and remains quite highly expressed until 24 hours. This was further confirmed by in situ hybridization. In conclusion, we were able to standardize a very successful version of the 2/3 hepatectomy procedure adapted for mice. Using this model, the hypothesis of the altered expression of microRNAs during liver regeneration is confirmed, setting suspicion about some kind of regulatory role. Mmu-miR-21 emerges as the most differentially expressed one and possibly having the most important role. The data from the present study supplement preexisting knowledge on the phenomenon of liver regeneration, but also show the way for future research in further clarifying the paths leading to microRNAs’ regulatory role or investigating their potential role in the phases of proliferation or termination of liver regeneration.

A perda do parênquima hepático, induzida por tratamento agudo, cirúrgico ou químico, desencadeia um processo regenerativo até que a massa hepática seja completamente restaurada. A regeneração hepática, após a hepatectomia parcial de 70%, é um dos modelos mais adequados de regeneração de células, órgãos e tecidos mais estudados. No fígado, ainda que sejam atribuídas propriedades regenerativas, muitas das lesões são tão prejudiciais que este mecanismo de reparação é insuficiente, tornando o transplante a única opção. As células derivadas do broto hepático de ratos apresentam uma boa alternativa para tratamento de doenças hepáticas devido ao seu alto índice proliferativo e da expressão de marcadores de pluripotência, sendo sua aplicabilidade viável em modelos experimentais. O objetivo deste trabalho foi analisar as diferentes vias de administração das células derivadas do broto hepático de ratos com 12,5 dias de gestação visando a melhor regeneração do órgão. Foram realizados experimentos de hepatectomia parcial de 70% (N=50 animais), PET Scan MSFX PRO In-Vivo RX e fluorescência, índice hepatossomático, análise de marcadores solúveis (GH, AFP, CEA, IGF-1), análises hematológicas, microscopia de luz (coloração HE, Tricômio de Masson), análise de marcadores por citometria de fluxo (CD90, STRO-1, Nanog, Oct3/4, Ki-67, Caspase 3) e ciclo celular por citometria de fluxo. Nossos dados demonstraram que as células do broto hepático administradas na via endotraqueal apresentaram melhor equilíbrio entre proliferação e morte celular, com maior expressão dos marcadores de pluripotência, melhor organização celular e regeneração tecidual, em contraste com outras vias, incluindo endovenosa, intraperitoneal e oroenteral. Isto a torna mais segura e de maior viabilidade na regeneração celular em relação às demais vias, sendo mais eficiente nos modelos de hepatectomia parcial / The restoration of liver parenchyma after partial hepatectomy or chemical treatments represents appropriate models to study regeneration mechanisms. The most appropriate model for liver regeneration is partial hepatectomy of 70%, however, organ repair properties are insufficient, suggesting the transplantation the best alternative to treat liver diseases. Cells derived from liver buds of rats show a high proliferative index and the expression of pluripotency markers; thus their significance for regeneration purposes can be tested experimentally. We here investigated different routes to administer cells derived from rat live buds of 12.5 days of gestation to adult individuals (N=50 animals) suffering from partial hepatectomy (70%). Applied methods included PET Scan MSFX PRO In-Vivo RX, fluorescence hepatossomatic index, analysis of soluble markers (GH, AFP, CEA, IGF-1), hematological analysis, light microscopy (staining HE, and Masson trichrome) as well as flow cytometry for cell cycle analysis and CD90, STRO-1, Nanog, OCT3/4, Ki-67, Caspase 3 expression. Our data showed that administration via the tracheal route resulted as favorite in regard to the balance between proliferation and cell deaths, of pluripotency marker expression, cellular organization and tissue regeneration, in contrast to other routes including: intravenous, intraperitoneal and oroenteral. Consequently, the tracheal route showed safer and more efficient treatment to enhance cell regeneration after partial hepatectomy

Ce travail doctoral est centré sur la régénération du foie en conditions normales et au cours de la stéatose hépatique. Ces dernières décennies, de nombreux travaux ont utilisé des modèles d’invalidations géniques afin d’identifier les acteurs important au cours de la régénération hépatique. Dans ce contexte, il avait été observé que des animaux dont le signal de l’hormone de croissance était inhibé présentait un défaut majeur de prolifération hépatocytaire après hépatectomie. Dans un premier temps, notre laboratoire s’est donc intéressé à comprendre comment l’hormone de croissance contrôle la régénération hépatique au niveau moléculaire. Pour cela, nous avons pratiqué des hépatectomies sur des animaux dépourvus en récepteur de l’hormone de croissance (GHrKO). Nous avons ainsi montré que l’hormone de croissance jouait un rôle majeur au cours de la régénération hépatique en contrôlant l’expression d’EGFR ainsi que l’activation de Erk1/2. Dans un second temps, je me suis intéressée à une situation pathologique associée à une dérégulation de la voie de l’hormone de croissance : la stéatose hépatique. De façon intéressante, de nombreux modèles murins de stéatose hépatique présentent également une inhibition importante de la prolifération après hépatectomie partielle. Chez l’Homme, cette maladie (NAFLD pour Non alcoholic fatty liver disease) représente un facteur de risque lors de transplantations hépatiques et de résections majeures du foie. Grâce à l’analyse quantifiée de plusieurs paramètres issue de biopsies de patients obèses, nous avons montré l’existence d’une forte corrélation entre stéatose hépatique et diminution de l’expression de l’EGFR sur l’Homme. Nous avons également pratiqué des hépatectomies sur deux modèles de stéatose, l’un génétique (ob/ob) l’autre induit par un régime déficient en méthionine et choline (MCD). Les cinétiques de régénération post hépatectomie nous ont permis de confirmer un défaut de régénération hépatique chez les souris ob/ob et MCD. D’autre part, l’étude de ces modèles de stéatose nous a amenés à valider la dérégulation de la voie de l’hormone de croissance et la diminution transcriptionnelle de l’EGFR avant et après hépatectomie partielle. En parallèle, nous avons souligné l’implication de la voie inhibitrice de prolifération TGF-β, dans l’altération de la prolifération hépatocytaire des animaux ob/ob. En effet, de nombreux acteurs de cette voie sont surexprimés après l’hépatectomie partielle, participant certainement au défaut de régénération plus drastique observé sur ce modèle. Pour finir, nous avons également montré que l’injection sur une courte période d’hormone de croissance sur les animaux ob/ob restaure la prolifération hépatocytaire post hépatectomie. Ce sauvetage phénotypique est associé à une réexpression transcriptionnelle et protéique de l’EGFR. A terme, ces travaux nous amènent à proposer que la dérégulation de l’axe hormone de croissance/EGFR représente un mécanisme général associé à la stéatose hépatique et responsable du défaut de régénération du foie lié à cette maladie. / This doctoral work focused on liver regeneration in physiological conditions and during steatosis. These last decades, several studies used gene invalidation models to identify important actors during the liver regeneration. In this context, it had been observed that animals displaying a defect of growth hormone pathway had a drastic defect of liver regeneration after partial hepatectomy. Initially, we started this work by focusing on understanding how growth hormone controls liver regeneration at the molecular level. To do so, we performed partial hepatectomies on animals deleted for the growth hormone receptor gene (GHrKO). These results showed that growth hormone plays a central role in the control of liver regeneration through the expression of EGFR and the activation of Erk1/2. Secondly, we focused our attention on a pathological situation showing a defect of growth hormone signaling : hepatic steatosis. Interestingly, many mice models of hepatic steatosis also present a drastic inhibition of hepatocytes proliferation after partial hepatectomy. In Humans, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) represents an important risk factor regarding liver transplantations and resections. Through quantified analysis of several parameters from obese patient biopsies, we showed the existence of a strong correlation between hepatic steatosis and decrease in EGFR expression on humans. We also performed partial hepatectomies on two models of hepatic steatosis, one being genetic (ob/ob) and the other one being induced by a methionine choline deficient diet (MCD). Kinetics of regeneration post hepatectomy led us to confirm the defect of liver regeneration in on ob/ob and MCD mice. Moreover, the study of these steatotic models allowed us to corroborate the downregulation of the growth hormone signaling and the transcriptional decrease of EGFR expression. We also underlight the importance of TGF-β, a signaling pathway inhibiting proliferation, in the liver regeneration defect observed in ob/ob mice. Indeed, many members of this pathway have been found to be upregulated after partial hepatectomy, possibly being involved in the drastic regeneration defect observed in ob/ob mice. To finish, we also showed that growth hormone injections on a small period of time in ob/ob mice were capable of rescuing hepatocyte proliferation post hepatectomy. This phenotypic rescue was associated with a reexpression of EGFR at the transcription and protein level. This work led us to propose that the defect of the growth hormone/EGFR pathway represents a general mechanism associated with hepatic steatosis and is responsible for the liver regeneration defect linked to this disease.