Abstract Although microbes are generally found as endophytes in many plant tissues, the plant shoot meristems have been considered virtually sterile. Plant tissue culture, which utilizes mostly the meristems, has nevertheless given numerous references to microbial existence in these tissues. Since the bud-derived tissue cultures of Scots pine (Pinus sylvestris L.) also become easily occupied by microbes, microbial presence was considered to be one potential cause of the low regeneration capacity of tissues from mature trees. The origin of the microbes occurring in tissue cultures of buds of Scots pine was established in this study. One of the microbes, classified as Hormonema dematioides (Ascomycota), was localized in the scale tissues of a bud. Several other microbes were detected, and were associated especially with the meristematic tissues of Scots pine buds. This group was comprised of the yeast Rhodotorula minuta, and bacteria belonging to Methylobacterium spp., the Pseudomonas fluorescens subgroup, and a Mycobacterium sp. These endophytes were located particularly in the outermost cells of meristems, in the epithelial cells of resin ducts, and in the cells of the developing stem, in the vicinity of the meristems. These endophytes were less frequently found in the vascular tissue or in the intercellular spaces of cells, which are typical locations for the previously known endophytic bacteria. The meristem-associated endophytes were discovered to affect growth of pine tissues, and some of them produced substances that are suitable as precursors for phytohormone synthesis. Additionally, pure cultures of both bacterial and fungal endophytes showed antagonism in vitro against pathogens. When the correlation between the presence endophytes and the degeneration of bud-derived tissue cultures of Scots pine was studied, it was discovered that the endophytes grew uncontrollably once a tissue culture was initiated from the bud. A high level of chitinase production was also detected in these tissue cultures, which was considered to be indicative of a defense reaction. However, the endophytes were not found to colonize excessively in every tissue, but all bud-derived tissue cultures of Scots pine eventually degenerate. Therefore, it was concluded that the endophytes may not exclusively be considered responsible for the degeneration of the cultures.

ΣΚΟΠΟΣ: Σήμερα είναι πλέον γνωστό ότι το χολοστατικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία από το φυσιολογικό ήπαρ. Η ηπατική αναγέννηση μετά μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ) ρυθμίζεται από διάφορους παράγοντες οι οποίοι ενεργοποιούν ή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων. Ένα από τα κυτταρικά στοιχεία που συμβάλλει στην αναγέννηση του ήπατος είναι το ηπατοκύτταρο με χολαγγειακή μορφολογία (DΗ). Από την άλλη μεριά, η απόπτωση φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ηπατική αναγέννηση. Στην παρούσα μελέτη, μετά από Ρηχ σε φυσιολογικούς ποντικούς και σε άλλους με ίκτερο, με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία, ερευνήσαμε: α) τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της ισχαιμικής ηπατικής βλάβης και αναγέννησης, β) το δυνητικό ρόλο των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία κατά τη διάρκεια της ηπατικής αναγέννησης και γ)την έκφραση των γονιδίων bcl-2 και bax, τα οποία σχετίζονται με την απόπτωση, καθώς και την παρουσία της απόπτωσης. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Η μελέτη συμπεριέλαβε 140 ποντικούς Wistar οι οποίοι χωρίστηκαν σε 14 ομάδες: Ι –control, II - εγχείρηση sham. III-IV-V-παροδικός αγγειακός αποκλεισμός ηπατικής αρτηρίας και πυλαίας φλέβας (ολική ηπατική ισχαιμία) (TLI) για 15-30-60 λεπτά αντίστοιχα. VI - απολίνωση του κοινού χοληδόχου πόρου (BDL) για 10 ημέρες, VII-VIII-ΙΧ-BDL-ΤLI-ΡΗχ. Χ-μερική ηπατεκτομή (ΡΗχ 68%}, XI- ΡΗχ + TLI (30 min), XII-BDL+ΡΗχ, XIII-BDL+ ΡΗχ+TLI (30 min) και XIV- BDL+TLI (30 min) + ΡΗχ. Τα ζώα θυσιάστηκαν 24 και 48 ώρες μετά από Ρηχ, με εξαίρεση τις περιπτώσεις όπου η κατάσταση υγείας ήταν κρίσιμη. Η μελέτη του ηπατικού ιστού περιελάμβανε: (α) Η&Α stain, (β) υβριδισμό in situ (ανίχνευση mRΝΑ των bcl-2 και bax σε παραφίνη, (γ) ανάλυση Western Blot για τη μελέτη των πρυτεϊνικών επιπέδων των bcl-2 και bax, (δ) in situ υβριδισμός (TUNEL) για την ανίχνευση παραγόντων απόπτωσης, (ε) ανοσοϊστοχημικά stains σε παραφίνη (μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης) με σκοπό να μελετηθεί η έκφραση των ακόλουθων αντιγόνων: κυτοκερατίνη 7 και 19 (χολικός φαινότυπος), ηπατοκυτταρίκή και α1-σντιθρυψίνη (ηπατοκυτταρικός φαινότυπος), βιμεντίνη, CD34, α-φετοπρωτείνη, GST-π(γλουταθειονιν-S-τρανσφεράση-π). Κι67 (κυτταρικός πολλαπλασιασμός), bcl-2 και bax (γονίδια απόπτωσης). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ήπαρ από ποντικούς α)με TLI ανέπτυξε βλάβες ηπατικής ισχαιμίας, β)με BDL βλάβες ηπατικής απόφραξης, γ)με BDL+TLI ανέπτυξαν βλάβες ηπατικής ισχαιμίας μαζί με αλλαγές λόγω απόφραξης των χοληφόρων. Το ποσοστό του επηρεασμένου ηπατικού παρεγχύματος (%ηπατικής νέκρωσης) ήταν υψηλότερο στις ομάδες με TLI+BDL. Σε αυτές τις ομάδες, ο ηπατοκυτταρικός δείκτης (δείκτης πολλαπλασιασμού) του Κi67 ήταν μικρότερος από τον αντίστοιχο της ομάδας χωρίς TLI. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι το χολοστστικό ήπαρ είναι πιο ευαίσθητο στην ισχαιμία κι εκδηλώνει μειωμένη αναγεννητική ικανότητα, συγκρινόμενο με μη χολοστατικό ήπαρ. Βιοψίες ήπατος έδειξαν χαρακτήρες ηπατικής αναγέννησης προερχόμενης από τη ζώνη 2, η οποία επεκτεινόταν στη ζώνη 1 και κάποιες φορές στη ζώνη 3. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις ανέδειξαν κύτταρα θετικά στο ΑΕ1 και κύτταρα θετικά στο ΗΕΡΡΑΡ. Σε όλες τις ομάδες με TLI τα ηπατοκύτταρα χολαγγειακής μορφολογίας εμφανίζονταν κυρίως σε περιοχές περι-πυλαίες. Εξέφραζαν κυτοκερατίνες 19 και 7, ηπατοκυτταρίκή και α1-αντιθρυψίνη ενώ εμφάνιζαν και συνδυασμένη έκφραση CΚ7/CΚ19 και ηπατοκυτταρική ή ΑΕ1/CΚ19 και α1-αντιθρυψϊνη. Το ποσοστό των κυττάρων αυτών ήταν ευθέως ανάλογο με το χρόνο επιβίωσης των ζώων (r=0,354, ρ<0,05). Όσον αφορά την απόπτωση, προ ηπατεκτομής, τα επίπεδα του bcl-2 ( πρωτεΐνη ή mRΝΑ) ήταν υψηλότερα σε ποντικούς με ίκτερο απ' ό,τι στους ποντικούς controls. Επιπλέον τα επίπεδα του bax (πρωτεΐνη ή mRΝΑ) και ο σωματικός δείκτης απόπτωσης (ΑΒΙ) ήταν υψηλότερα σε χολοστατικό ήπαρ. Μετά ηπατεκτομή, παρατηρήθηκε πρώιμη ελάττωση των επιπέδων πρωτεϊνών και mRΝΑ του γονιδίου bcl-2 και μια ύστερη αύξηση του προ-αποπτωτικού γονιδίου bax και του ΑΒΙ, σε σύγκριση με τα controls. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Σε περιπτώσεις αποφρακτικού ίκτερου (χολαγγειοπάθεια), η ηπατική ισχαιμία καθιστά το όργανο πιο ευαίσθητο σε ενδεχόμενη βλάβη, καθώς προκαλεί ευρύτερη νέκρωση παρεγχύματος και ελαττώνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων, Η διεργασία αναγέννησης του ήπατος επιτελείται κυρίως μέσω του πολλαπλασιασμού μη νεκρωτικών κυττάρων τα οποία εκφράζουν ηπατοκυτταρικά ή χολαγγειακά επιθηλιακά χαρακτηριστικά. Σε τέτοιες περιπτώσεις, το κύριο στοιχείο της ηπατικής αναγέννησης αποτελεί η παρουσία των ηπατοκυττάρων με χολαγγειακή μορφολογία (κύτταρα που εκδηλώνουν φαινότυπο ενδιάμεσο μεταξύ κυττάρων χολαγγειακής και ηπατικής προέλευσης) και η διαφοροποίηση τους σε ώριμα ηπατοκύτταρα. Τέλος, η απόπτωση έχει ρόλο στο χολοστατικό ήπαρ με ή χωρίς επιπλέον ισχαιμία και πιστεύεται ότι μπορεί να συμβάλλει στην παρουσία κατεσταλμένης αναγεννητικής απόκρισης που παρατηρήθηκε σε ήπαρ ποντικών με ίκτερο μετά από μερική ηπατεκτομή. / AIM: Today, it is known that cholestatic liver is more susceptible to ischemia than normal liver. Liver regeneration after partial hepatectomy (PHx) is regulated by several factors that activate or inhibit hepatocyte proliferation. One of the cellular elements that contributes to liver regeneration is ductular hepatocyte (DH). On the other hand, apoptosis seems to play an important role in cellular proliferation and liver regeneration. In this study and. after PHx. in normal and jaundiced rats with or without superimposed ischemia, we assessed a) the histopathologic features of hepatic Ischemic damage and liver regeneration, b) the potential role of ductular hepatocytes during liver regeneration and c) the expression apoptosis-asscciated genes bcl-2 and bax. and the presence of apoptosis, MATERIALS £ METHODS: The study comprised 140 male Wistar rats, assigned randomly in 14-groups: l-controls. ll-sham. Ill-IV-V-cIamping of hepatic artery and portal vein (total liver Ischemia-TLI) for 15-30-60 min respectively. Vl-common bile duct ligation (BDL) for lOdays. VII-VIII-IX-BDL-TLI-X-partial hepatectomy(PHx-68%). XI-PHx+TLI(30min). XU-BDL+PHx. XIII-BDL+PHx+TLI(30min) and XIV-BDL+TLI (30min)+PHx. Animals were sacrificed 24 and 48hrs after PHx unless their condition was critical. Liver tissue evaluation Included: (a) H&E stain, (b) in situ hybridization (detection of bcl-2 and bax mRNA) in paraffin sections, (c) Western blot analysis for the evaluation of bcl-2 and bax protein levels, (d) in situ hybridization (TUNEL) for the detection of apoptotic bodies, and (e) immunohistochemical stains (streptavidin-biotin method) in paraffin sections, in order to evaluate the expression of the following antigens: cytokeratins 7 and 16 (biliary phenotype), Hepatocyte and a 1-antitrypsin (hepatocytic phenotype), vimentin, CD34, alpha-fetoprotein, GST-pi (glutahione-S-trarsferase-pi), Ki67 cell proliferation), bcl-2 and bax (apoptotlc genes). RESULTS: Sections from rats a) with TLI developed changes of liver ischemia, b) with BDL changes of liver obstruction and c) with BDL+TLI developed changes of ischemia together with changes of biliary obstruction. The total liver parenchymal area affected (% liver necrosis} was higher in groups with TLI+BDL. In these groups the Ki67 hepatocytic index (proliferation index) was lower compared to the groups without TLI. This finding implies that cholestatic livers are more vulnerable to ischemia and also display impaired generative capabilities, compared to non-cholestatic ones. Liver biopsies exhibited features of liver regeneration that originated from zone 2, extended to zone 1 and occasionally to zone 3. Immunonistochemical stains revealed cells positive to AE1 and cells positive to HEPPAR. In all groups with TLI, DHs appeared mainly in periportal areas. They expressed cytokeratirs-19 and 7. hepatocyte and al-antrtrypsm and co-expressed CK7/CK1S and Hepatocyte or AE1/CK1S and a 1-antitrypsin The percentage of DHs was directly correlated with the time that animals survived (r=0,354, p<0,05). Regarding apoptosis, before hepatectomy, bcl-2 (protein or mRNA} levels were higher in jaundiced rats vs controls. Furthermore, bax (protein or mRNA) levels and apoptotic body index (ABl) were higher in cholestatic livers. After hepatectomy, there was an early decease in the protein and mRNA levels of antiapoptotic gene bcl-2 and a late increase of proapoptotic gene bax and the A8I. compared to controls. CONCLUSIONS: In cases with obstructive jaundice (cholangiopathy), liver ischemia makes the organ more vulnerable to damage because it causes greater parenchymal necrosis and decreases the degree of hepatocyles proliferation. Liver regenerative process is mediated mainly by proliferation of non-necrotic cells that express hepatocellular or ductular epithelial features. In such cases a main element of liver regeneration is the presence of DHs, cells that display a phenotype intermediate between ductular and hepatocytic origin} and their differentiation to mature hepatocytes. Finally, apoptosis takes place in cholestatic livers with or without superimposed ischemia and may contribute in the impaired regenerative response observed in livers of jaundiced rats after partial hepatectomy.