Οι εντεροϊοί έχουν ιδιαίτερη σημασία για τη δημόσια υγεία, δεδομένου ότι σχετίζονται με επιδημίες γαστρεντερίτιδας (μη βακτηριογενούς προέλευσης) από την κατανάλωση μολυσμένου νερού. Οι ιοί αυτοί μπορούν να απομονωθούν σε μεγάλες ποσόστητες από κόπρανα και ούρα ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και από λύματα και μολυσμένα νερά. Επιπλέον, οι Αδενοϊοί είναι παθογόνοι για τον άνθρωπο και η παρουσία τους σε περιβαλλοντικά δείγματα δύναται να προκαλέσει σημαντικές μολύνσεις. Οι Αδενοϊοί είναι ιοί ανθρώπινης εντερικής προέλευσης που περιέχουν DNA και ορισμένοι ορότυποι τους είτε δεν καλλιεργούνται, είτε καλλιεργούνται δύσκολα στις συνήθεις κυτταρικές σειρές. Γι’ αυτόν το λόγο, η ανίχνευσή τους σε μολυσμένο νερό και ο ρόλος τους ως παραγόντων πρόκλησης γαστρεντερίτιδας έχουν υποτιμηθεί. Οι Ρότα ιοί είναι υπεύθυνοι για οξεία περιστατικά γαστρεντερίτιδας στον άνθρωπο και τα ζώα. Κατόπιν του διπλασιασμού του γενετικού τους υλικού στον γαστρεντερικό σωλήνα οι ιοί αυτοί εκκρίνονται και δύνανται να διασπαρούν στο περιβάλλον και το νερό. Γενικά, οι Ρότα ιοί έχουν εμπλακεί σε περιστατικά γαστρεντερίτιδας σε πολλές χώρες. Η σταθερότητα των ανθρωπίνων Ρότα ιών στο νερό και η ανθεκτικότητά τους σε φυσικοχημικές διαδικασίες εξυγίανσης κατά την επεξεργασία των λυμάτων συντείνουν στην εξάπλωσή τους. Στην παρούσα διατριβή ανιχνεύθηκαν και απομονώθηκαν εντεροϊοί, αδενοϊοί και ρότα ιοί από ακατέργαστα λύματα, τα οποία ελήφθησαν από την είσοδο τεσσάρων σταθμών βιολογικού καθαρισμού (δύο στην Αττική και δύο στην Αχαΐα). Συνολικά ελήφθησαν 118 δείγματα ακατέργαστων λυμάτων κατά την περίοδο Σεπτέμβριο 2000 – Σεπτέμβριο 2003. Η μεθοδολογία αφορούσε στην συμπύκνωση των ιών ακολουθούμενη από RT-nested PCR, προκειμένου να επιτευχθεί αύξηση της ευαισθησίας απομόνωσης των ιών. Μετά την απομόνωση γενετικού υλικού των ιών πραγματοποιήθηκε τυποποίησή τους εφαρμόζοντας nucleotide sequencing analysis. Οι Ρότα ιοί ανιχνεύθηκαν σε 17 δείγματα (14.2%). Τα αποτελέσματα της τυποποίησής τους ήταν rotavirus τύπος G1 (88.2%) και τύπος G2 (11.8%). Οι Αδενοϊοί βρέθηκαν σε 55 δείγματα (45.8%). Η Sequencing ανάλυση είχε ως αποτέλεσμα την παρουσία στα δείγματα αδενοϊών της ομάδας F [τύποι 40 (34.6%) και 41 (63.6%)] και της ομάδας C [τύπος 2 (1.8%)]. Οι Εντεροϊοί ανιχνεύθηκαν σε 30 δείγματα (40%) και η sequencing ανάλυση είχε ως αποτέλεσμα την παρουσία αρκετών τύπων όπως (α) coxsackievirus (τύποι A6 - 3.3%, A9 - 3.3%, A16 - 3.3%, B4 - 16.7%, B5 - 3.3%), (β) echovirus (τύποι 2 -6.7%, 6 - 13.3%, 30 -10%), (γ) εντεροϊοί τύποι 68 - 3.3%, 71 - 13.3% καθώς και porcine εντεροϊός (6.7%), poliovirus 1 (6.7%) και poliovirus 2 (10%). Η μικροβιολογική ποιότητα του νερού επομένως και η ανθρώπινη υγεία επηρεάζονται σημαντικά από την παρουσία μικροοργανισμών εντερικής προέλευσης, οι οποίοι προέρχονται από λύματα που καταλήγουν στο υδάτινο περιβάλλον. Πολλές επιδημίες από ιούς εντερικής προέλευσης έχουν κατά καιρούς συνδυαστεί με το νερό. Οι υδατογενείς επιδημίες γενικά εξαπλώνονται στον πληθυσμό από κατανάλωση μολυσμένου νερού, κολύμβηση σε ακατάλληλα νερά αναψυχής καθώς επίσης μεταδίδονται απο τη σωματική επαφή και την εισπνοή. Τα μη επεξεργασμένα λύματα της μελέτης περιέχουν πολλούς και διαφορετικούς τύπους ιών εντερικής προέλευσης οι οποίοι κατά κύριο λόγο προκαλούν γαστρεντερίτιδα. Επομένως καθίσταται αναγκαία η επξεργασία των λυμάτων στο μέγιστο δυνατό βαθμό στους σταθμούς βιολογικού καθαρισμού. Η Sequencing ανάλυση έδειξε την παρουσία ανθρώπινων Ρότα ιών A (τύποι G1 και G2), οι οποίοι προκαλούν παγκοσμίως διάρροια σε παιδιά καθώς επίσης και την παρουσία αδενοϊών τύπου 40 και 41, οι οποίοι είναι σημαντικοί αιτιολογικοί παράγοντες γαστρεντερίτιδας, κυρίως σε θερμά κλίματα. Από την άλλη πλευρά η ποικιλία των εντεροϊών που ανιχνεύθηκε στα ακατέργαστα λύματα ήταν μεγαλύτερη συγκρινόμενη με την αντίστοιχη των υπολοίπων ιών της μελέτης. Η παρούσα διατριβή αναδεικνύει την αποτελεσματικότητα της μεθόδου «nucleotide sequencing analysis», ως μέσου επιδημιολογικής μελέτης και ανάλυσης της συσχέτισης ιών που εμπλέκονται σε ανθρώπινες ασθένειες κι εκέινων που ανιχνεύονται σε ακατέργαστα λύματα. / Enteroviruses have been associated with outbreaks of waterborne non-bacterial gastroenteritis and are of important concern for public health. Significant numbers of viruses can be isolated from faeces and urine of humans as well as from sewage and polluted waters. Adenoviruses are also pathogenic to humans and their presence in environmental samples (polluted waters) may cause infections. Like rotaviruses, adenoviruses are causative agents of gastroenteritis, are the only human enteric viruses to contain DNA and many serotypes are difficult to culture in regular cell lines For this reason, and because adenoviruses are slow growing, their presence in polluted water and their role as originators of gastroenteritis have probably been underestimated. Rota viruses are responsible for severe gastroenteritis in humans and animals. After replicating in the gastrointestinal tract, these viruses are excreted and may be dispersed in environmental waters. Rota viruses have been implicated in waterborne gastroenteritis outbreaks in many countries. The stability of human rotaviruses in environmental water and their resistance to physicochemical treatment processes in sewage treatment plants may facilitate their transmission. In the present study, enteroviruses, adenoviruses and rota viruses were detected in raw sewage samples from inlets of four biological treatment plants in Greece (two in Athens, two in Patras}. Raw sewage samples (118) were analyzed for the presence of these viruses during the period September 2000 to September 2003. Our approach consisted of a simple concentration of viruses from raw sewage followed by RT-nested PCR in order to increase the sensitivity of virus detection. The viral sequences detected were then characterized by nucleotide sequencing analysis. Rota viruses were detected in 17 samples (14.2%). Sequencing analysis of the positive sewage samples revealed the presence of rotavirus type G1 (88.2%) and type G2 (11.8%). Adenoviruses were found in 55 samples (45.8%). Sequencing analysis of the positive sewage samples revealed the presence of adenovirus group F type 40 (34.6%), type 41 (63.6%) and group C type 2 (1.8%). Enteroviruses were detected in 30 samples (40%) and sequencing analysis of the positive sewage samples revealed the presence of several types such as (a) coxsackievirus types (A6 - 3.3%, A9 - 3.3%, A16 - 3.3%, B4 - 16.7%, B5 - 3.3%), (b) echovirus types (2 -6.7%, 6 - 13.3%, 30 -10%), (c) enterovirus types (68 - 3.3%, 71 - 13.3%) as well as porcine enterovirus (6.7%). poliovirus 1 (6.7%) and poliovirus 2 (10%). Water quality and, therefore human health, may be significantly affected by the presence of pathogenic enteric microorganisms derived from sewage discharged to the aquatic environment. Outbreaks of enteric virus disease have been linked to water at various times and to different causes. Waterborne disease may be transmitted by consumption of polluted drinking water, by immersion in recreational water or by contact with skin or inhalation. Raw sewage was found to be contaminated by different types of enteric viruses that mainly cause gastroenteritis; therefore, it is necessary to use the most efficient water treatment measures in sewage treatment plants. Sequencing analysis showed the presence of human rotavirus A type G1 and G2 which cause childhood diarrhea worldwide and enteric adenoviruses (types 40 and 41) which are important etiological agents of pediatric gastroenteritis, principally in temperate climates. On the other hand, the variety of enteroviruses identified in the raw sewage samples was more extensive compared to the other viruses of the study. The present study demonstrated the efficiency of the nucleotide sequencing analysis for studying epidemiological relationships between strains involved in human infections and those found in raw sewage.

Η διατήρηση της μικροβιολογικής ποιότητας του υδάτινου περιβάλλοντος είναι υψίστης σημασίας δεδομένων των κινδύνων που ενέχονται για τη δημόσια υγεία. Η αξιολόγηση της μικροβιολογικής ποιότητας των υδάτων πραγματοποιείται με την ανίχνευση της κοπρανώδους μόλυνσης και με τον έλεγχο της παρουσίας και συγκέντρωσης συγκεκριμένων μικροοργανισμών – δεικτών, όπως είναι η Escherichia coli. Ωστόσο, η απλή ανίχνευση κοπρανώδους μόλυνσης δεν επαρκεί για την υπόδειξη τρόπων εξυγίανσης και αντιμετώπισης του εκάστοτε προβλήματος. Οι δύο κύριες ομάδες στις οποίες διακρίνεται η κοπρανώδης μόλυνση είναι η ανθρώπινη και η ζωική, οι οποίες υποδηλώνουν πιθανή παρουσία διαφορετικών κάθε φορά παθογόνων μικροοργανισμών για τον άνθρωπο. Έτσι, προκειμένου να οριοθετηθεί ο κίνδυνος για τη δημόσια υγεία και να καθοριστούν μέτρα αντιμετώπισης της μόλυνσης ενδείκνυται ο προσδιορισμός της ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης της κοπρανώδους μόλυνσης. Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκαν, εφαρμόστηκαν και αξιολογήθηκαν οι μέθοδοι: α)Έλεγχος πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (Multiple Antibiotic Resistance – MAR – φαινοτυπική μέθοδος) και β) PCR με τυχαία ενισχυμένα τμήματα πολυμορφικού DNA - Random Amplified Polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR – γονοτυπική μέθοδος), ως τεχνικές προσδιορισμού και διάκρισης προέλευσης μικροοργανισμών. Κατά το πρώτο στάδιο καθορίστηκαν οι παράμετροι των μεθόδων για το διαχωρισμό στελεχών E. coli γνωστής προέλευσης (60 στελέχη απομονωμένα από ζωικά κόπρανα και 68 στελέχη από ανθρώπινα). Για το διαχωρισμό και κατηγοριοποίηση των στελεχών εφαρμόστηκαν η Ιεραρχική Ανάλυση Κατά Συστάδες και η Διαχωριστική Ανάλυση. Με τη MAR ανάλυση τα στελέχη E. coli εμφάνισαν διαφορετικούς συνδυασμούς ανθεκτικότητας και διαχωρίστηκαν βάσει της προέλευσής τους με μέσο ποσοστό σωστής ταξινόμησης (ARCC) 99,2%. Με την RAPD-PCR χρησιμοποιήθηκαν δύο εκκινητές ξεχωριστά (1254 & 1290) και τα 128 στελέχη E. coli γνωστής προέλευσης διαχωρίστηκαν σε ανθρώπινης και ζωικής πηγής με ARCC 98,4% και με τους δύο εκκινητές. Η διακριτική ικανότητα της RAPD-PCR με τους δύο εκκινητές ήταν D1254=0,97 & D1290=0,90. Επιπλέον, η αξιολόγηση της επαναληψιμότητας της RAPD-PCR και με τους δύο εκκινητές έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα με την εμφάνιση ίδιων ηλεκτροφορητικών εικόνων για τα ίδια βακτηριακά στελέχη. Στη συνέχεια οι επιλεγμένες τεχνικές εφαρμόστηκαν για την ταξινόμηση και κατηγοριοποίηση στελεχών E. coli άγνωστης προέλευσης εκτιμώντας την ανθρώπινη ή ζωική πηγή τους βάσει του μοντέλου διαχωρισμού των E. coli γνωστής προέλευσης. Οι E. coli άγνωστης προέλευσης (234 στελέχη) απομονώθηκαν από δείγματα πόσιμου νερού δικτύου από 11 περιοχές και δείγματα μη επεξεργασμένων λυμάτων από τις εισόδους τεσσάρων σταθμών βιολογικού καθαρισμού (ΚΕΡΕΦΥΤ – Νομός Αττικής, ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ – Νομός Αττικής, ΡΙΟ – Νομός Αχαΐας και ΠΑΤΡΑ - Νομός Αχαΐας). Τα 234 στελέχη με τη MAR ανάλυση ταξινομήθηκαν ως ανθρώπινα και ζωικά σε ποσοστά 46,6% και 53,4% αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα ταξινόμησης ήταν διαφορετικά με τη μέθοδο RAPD-PCR. Με τον εκκινητή 1254 τα άγνωστα στελέχη προσδιορίστηκαν ως ανθρώπινα κατά το 64,9% και ως ζωικά κατά το 35,1%. Αντίστοιχα, με τον εκκινητή 1290 τα ποσοστά ήταν 60,3% ανθρώπινα και 39,7% ζωικά. Τα στελέχη του πόσιμου νερού που προέρχονταν από τους σταθμούς δειγματοληψίας που ήταν αστικά κέντρα χαρακτηρίστηκαν εξ ολοκλήρου ως ανθρώπινης προέλευσης. Αντίθετα, στις περιοχές δειγματοληψίας με ανεπτυγμένη κτηνοτροφία βρέθηκαν και στελέχη ζωικής προέλευσης, γεγονός που υποδηλώνει την είσοδο στο δίκτυο κοπρανώδους υλικού προερχόμενου από ζώα των συγκεκριμένων περιοχών, τα οποία ενδεχομένως να έχουν άμεση πρόσβαση στις πηγές και γεωτρήσεις. Όσον αφορά στο χαρακτηρισμό των E. coli που καταλήγουν στους αναφερόμενους βιολογικούς καθαρισμούς, η πλειοψηφία ανίχνευσης ανθρωπίνων στελεχών δηλώνει την πιθανή παρουσία στα ακατέργαστα λύματα πολλών ανθρωπίνων εντερικών παθογόνων σημαντικών για τη δημόσια υγεία. Δεδομένου ότι τα τελευταία χρόνια οι ερευνητές έχουν αποδυθεί σε μια προσπάθεια επαναχρησιμοποίησης επεξεργασμένων λυμάτων επισημαίνεται η ανάγκη επεξεργασίας τους σε διάφορα στάδια για τη διασφάλιση της δημόσιας υγείας. Παρατηρήθηκε συμφωνία αποτελεσμάτων με τη χρήση των δύο εκκινητών καθώς η διαφορά στα ποσοστά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (P>0,05). Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τις δύο μεθόδους, τη φαινοτυπική (MAR ανάλυση) και τη γονοτυπική (RAPD-PCR), υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά (P<0,05), με συνέπεια να τίθεται θέμα επιλογής της πιο ενδεδειγμένης μεθόδου τυποποίησης και διάκρισης περιβαλλοντικών μικροοργανισμών. H παρούσα μελέτη αναδεικνύει την RAPD-PCR ως μια γονοτυπική μέθοδο με ικανοποιητική διακριτική ικανότητα, ευαισθησία, επαναληψιμότητα υπό αυστηρά καθορισμένες συνθήκες και χαμηλού κόστους. Η ευκολία εφαρμογής για την τυποποίηση μεγάλου αριθμού βακτηριακών στελεχών, χωρίς την απαίτηση γνώσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του γενετικού υλικού την καθιστούν ιδιαίτερα προσιτή σε εργαστήρια μοριακής μικροβιολογίας, ως τεχνική διάκρισης προέλευσης της κοπρανώδους μόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον. / Maintenance of the microbiological quality and safety of water systems is imperative, as their faecal contamination may exact high risks to human health as well as result in significant economic losses. The microbiological quality of water systems is evaluated by detecting their faecal pollution and especially specific faecal indicators such as Escherichia coli. Simple detection of faecal pollution is not sufficient in order to apply appropriate management plans to remedy the problem and to prevent any further contamination. Human faecal material is generally perceived as constituting a grater human health risk than animal faecal material, considering that it is more likely to contain human-specific enteric pathogens. Thus, it would be desirable to determine the source of the faecal material, especially for the assessment of risk for public health and for the development of monitoring plans. In the present study the development and assessment of Multiple Antibiotic Resistance Analysis (MAR – phenotypic method) and Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR Analysis (RAPD-PCR – genotypic method) were established as microbial source tracking methods. Firstly, parameters of the two selected methods were determined for the discrimination of E. coli isolates of known source (60 isolates from animal faecal material & 68 isolates from human faecal material). Hierarchical Cluster Analysis and Discriminant Analysis were applied for the classification of the isolates. With MAR analysis E. coli isolates developed different resistance profiles and were discriminated according to their source with an average rate of correct classification (ARCC) of 85.2%. With RAPD-PCR analysis two different 10-nt primers of arbitrary sequence were used (1254 & 1290) and the 128 E. coli isolates of known origin were classified as human and animal with the following ARCC: ARCC1254= 87.5% & ARCC1290= 81.3%. The discriminatory power of RAPD-PCR with the two selected primers was D1254=0.97 & D1290=0.90. Furthermore, the assessment of reproducibility of RAPD-PCR analysis provided satisfactory results with both primers, as RAPD profiles were identical for the same bacterial isolates. The assessment of specificity of the method resulted in the discrimination among RAPD profiles of E. coli isolates and other reference bacteria. The selected methods were applied for the classification and the source tracking of E. coli isolates, derived from tap water and raw sewage samples. In total 234 E. coli strains were isolated from tap water from 11 areas and raw sewage samples from four treatment plants (KEREFYT – prefecture of Attiki, PSITALIA - prefecture of Attiki, RIO - prefecture of Achaia and PATRA - prefecture of Achaia). With MAR analysis the 234 isolates were classified as human and animal in percentages of 46.6% & 53.4%, respectively. Classification results were different with RAPD-PCR analysis. With primer 1254 the classification was: 64.9% of human origin and 35.1% of animal origin and with primer 1290 the classification was: 60.3% of human origin and 39.7% of animal origin. Isolates derived from tap water of urban areas were classified in total as of human origin. On the contrary, in areas with many farm breeders many isolates were classified as of animal origin, indicating presence of faecal material in the water systems derived animal activities. As far as E. coli isolates from raw sewage samples are concerned, the majority of them were classified as of human source, indicating the possible presence of other human enteric pathogens as well. Taking into account the fact that there has been an effort in order to reuse treated sewage, it seems necessary a multi-stage process to renovate wastewater before it re-enters a body of water. There was an agreement of results of classification obtained form the use of the two different primers as the percentages did vary statistically (P>0.05). Comparing results obtained from the two selected methods, the difference was statistically significant (P<0.05), raising a question of the appropriate method for the typing and discrimination of environmental microorganisms. The present study demonstrates RAPD analysis as a simple, cost effective genotypic method with satisfactory discriminatory power, sensitivity and reproducibility. It can be applied for the analysis of a large number of bacterial isolates without the prior knowledge of nucleotide sequence of DNA to be necessary. Finally, it may fulfil environmental for the determination of origin of faecal pollution protecting water resources and public health.

Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων και κυρίως των λοιμώξεων από MRSA, τόσο στο ενδονοσοκομειακό περιβάλλον, όσο και στην κοινότητα, το διάστημα 2001-2006. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, συλλέχθηκαν συνολικά 1922 στελέχη Staphylococcus aureus από όλες τις κλινικές και από διαφορετικούς ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών (ΠΓΝΠ). Στη συνέχεια τα στελέχη ελέγχθηκαν για την παραγωγή της πρωτεΐνης PBP2α και την ύπαρξη του γονιδίου mecA για τον προσδιορισμό των ανθεκτικών στη methicillin στελεχών S. aureus (Methicillin-Resistant S. aureus, MRSA). Από το σύνολο των 1922 S. aureus, τα 757 (39.4%) χαρακτηρίσθηκαν ως MRSA. Γενικά, παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού των λοιμώξεων από S. aureus, με παράλληλη αύξηση του ποσοστού των MRSA λοιμώξεων, από 23% το 2001 στο 49% το 2006. Οι MRSA αποτελούν σοβαρό πρόβλημα για τα νοσοκομεία, αλλά και γενικότερα σε όλο το πληθυσμό, καθώς απομονώνονται με αυξανόμενη συχνότητα από την κοινότητα. Στο διάστημα που καλύπτει η παρούσα μελέτη, 2001-2006, το ποσοστό των στελεχών που απομονώθηκαν από την κοινότητα (Community-acquired MRSA, CA-MRSA) αυξήθηκε από 3% το 2001, σε 37% το 2006, ενώ εκείνο των ενδονοσοκομειακών στελεχών (Hospital-acquired MRSA, HA-MRSA), είναι ενθαρρυντικό ότι μειώθηκε από 20% το 2001, στο 12% το 2006. Για την επιδημιολογική μελέτη των λοιμώξεων που οφείλονται σε MRSA στελέχη, μέθοδος αναφοράς είναι η PFGE, κυρίως σε συνδυασμό και με υβριδισμό του χρωμοσωμικού DNA με ειδικούς ανιχνευτές. Oι μέθοδοι αυτές παρουσιάζουν δυσκολία στη σύγκριση των κλώνων μεταξύ των χωρών και έτσι αναπτύχθηκε η MLST, που βασίζεται στη εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας επτά συντηρημένων γονιδίων και επιτρέπει τον προσδιορισμό των κλωνικών συμπλεγμάτων (Clonal Complex, CC) με δυνατότητα άμεσης ταυτοποίησής τους. Τα MRSA που απομονώθηκαν κατατάχθηκαν σε επτά ST/SCCmec κλώνους, τους ST80/IV, ST5/IV, ST377/V, ST30/IVvar, ST239/III, ST225/NT και ST217/NT και πέντε κλωνικά συμπλέγματα (Πίνακας 46). Στα CA-MRSA επικρατεί ο ST80/IV, με μικρό ποσοστό να ανήκει και στον πρόσφατο τύπο ST377/V, ενώ στα HA-MRSA απαντώνται κυρίως οι ST239/III και ST30/IVvar. Η PVL είναι μια τοξίνη που καταστρέφει τα λευκοκύτταρα ανοίγοντας πόρους στην κυτταρική τους μεμβράνη, προκαλεί νέκρωση ιστών και νεκρωτική πνευμονία, κυρίως σε μικρά παιδιά, και κωδικοποιείται από τα γονίδια lukS-PV και lukF-PV. Το 74% των MRSA που μελετήθηκαν το διάστημα 2001-2006, έφεραν τα γονίδια αυτά, καταγράφοντας αύξηση από 33% το 2001, σε 88% το 2006. Τα PVL-θετικά MRSA ανήκουν στους κλώνους ST80/IV και ST377/V. Τα περισσότερα PVL-θετικά CA-MRSA της μελέτης μας απομονώθηκαν από λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ενώ τα PVL-θετικά HA-MRSA προέρχονταν από χειρουργικά τραύματα, κυρίως σε περιπτώσεις χρήσης προσθετικών υλικών. Ένα PVL-θετικό στέλεχος, που απομονώθηκε από αιματοκαλλιέργεια, προερχόταν από οστεομυελίτιδα. Πρόκειται για πρώτη αναφορά περιστατικών οξείας οστεομυελίτιδας, με αίτιο στελέχη CA-MRSA και MSSA που παράγουν PVL. Φαίνεται ότι η παρουσία των γονιδίων lukS-PV και lukF-PV συνδέεται κυρίως με λοιμώξεις που προκύπτουν δευτερογενώς σε τραύματα και επιπολής λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ενώ η απομόνωση PVL-θετικού στελέχους από οστεομυελίτιδα αποτελεί ένδειξη για την εμπλοκή της τοξίνης αυτής και στη παθογένεια εν τω βάθει λοιμώξεων. Εκτός από την PVL, σημαντικοί λοιμογόνοι παράγοντες και αίτια σοβαρών κλινικών συνδρόμων στον άνθρωπο θεωρούνται και οι τοξίνες της οικογένειας των υπεραντιγόνων, όπως η τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) και οι εντεροτοξίνες (SEs). Το γονίδιο tst κωδικοποιεί την παραγωγή της TSST-1, ενώ το οπερόνιο egc (enterotoxin gene cluster) την έκφραση πρωτεϊνών που μοιάζουν στη δομή και αλληλουχία με τις εντεροτοξίνες. Στα MRSA της συλλογής μας, τα γονίδια tst και egc2 ανιχνεύθηκαν μόνο στον κλώνο ST30/IV και δε βρέθηκαν ποτέ να συνυπάρχουν με τα γονίδια της PVL. Ανιχνεύθηκαν και συνδυασμοί των γονιδίων tst και του οπερονίου egc στους κλώνους ST80/IV και ST239/III, που σημαίνει ότι τα γονίδια αυτά διασπείρονται με οριζόντια μεταφορά, ενώ τα γονίδια lukS-PV και lukF-PV, που εντοπίστηκαν αποκλειστικά στους κλώνους ST80/IV ST377/V και χωρίς να συνυπάρχουν με γονίδια υπεραντιγόνων, φαίνεται ότι μεταφέρονται πιο ειδικά. Προϊόν της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ποσοτικοποίηση με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου, του γονιδίου tst σε στελέχη S. aureus που ήταν ανθεκτικά στη methicillin, κατατάσσονταν σε διαφορετικούς κλώνους και έφεραν ποικίλα γονίδια τοξινών. Για τη σήμανση και παρακολούθηση των προϊόντων χρησιμοποιήθηκε το SYBR Green I (SG), που είναι μη ειδικός τρόπος σήμανσης. Η χρήση του SYBR Green I κάνει τη μέθοδο εύχρηστη, αφού μπορεί η χρωστική να προστεθεί απλά στο υπόλοιπο μίγμα της αντίδρασης και φθηνή, επειδή δε χρειάζεται να σχεδιαστούν καινούριοι, ειδικοί εκκινητές. Οι αντιδράσεις απόλυτης ποσοτικοποίησης, που πραγματοποιήθηκαν με τη συγκεκριμένη μέθοδο, είχαν υψηλή απόδοση (2.04) και τα αποτελέσματα ήταν συνεχή και επαναλαμβανόμενα, γεγονός που σημαίνει ότι μπορεί να εφαρμοσθεί στη ρουτίνα του κλινικού εργαστηρίου για τη γρήγορη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του γονιδίου tst στα κλινικά στελέχη. Επί πλέον αποδείχθηκε με τη στατιστική ανάλυση, ότι στελέχη που απομονώθηκαν από λοιμώξεις μαλακών μορίων συνέθεταν υψηλότερα ποσά tst. Για τον υπολογισμό των λόγων έκφρασης του γονιδίου tst, στη σχετική ποσοτικοποίηση εφαρμόσθηκαν δυο μαθηματικά μοντέλα (2-ΔΔCt και Pfaffl). Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα από τους δυο διαφορετικούς τρόπους υπολογισμού, βρέθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης ίδιων στελεχών και καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το μαθηματικό μοντέλο του Pfaffl είναι πιο ακριβές και αξιόπιστο, καθώς συνυπολογίζει την απόδοση της αντίδρασης. / The purpose of this study was to establish the clonality and evolution of CA-MRSA (Community-acquired MRSA, CA-MRSA) and HA-MRSA (Hospital-acquired MRSA, HA-MRSA), as well as the epidemiology of MRSA (Methicillin-Resistant S. aureus, MRSA) infections, during 2001-2006. In total 1922 Staphylococcus aureus strains were collected from patients with different pathologies admitted at the University Hospital of Patras. Among them 757 (39.4%) strains were MRSA. The prevalence of MRSA infections rose from 23% in 2001 to 49% in 2006. MRSA is a major problem worldwide in the nosocomial setting and the community. During 2001-2006 CA-MRSA isolated with an increasing rate from 3% in 2001 to 37% in 2006, while HA-MRSA decreased from 20% in 2001 to 12% in 2006. The epidemiological study of MRSA infections was based on PFGE, the “gold standard” of typing methods and hybridization with specific DNA probes. However, for the full characterization of a strain it is recommended the application of the multilocus sequence typing (MLST), since it is a highly discriminatory method and permits to compare the results from different laboratories. MLST represents a major advance since it relates organisms on the basis of the nucleotide sequences of ~450 bp internal fragments of seven conserved housekeeping genes resulting to the determination of Sequence Types (ST) and Clonal Complexes (CC). MRSA of our collection belonged to seven ST/SCCmec clones (ST80/IV, ST5/IV, ST377/V, ST30/IVvar, ST239/III, ST225/NT and ST217/NT) and five Clonal Complexes. Most CA-MRSA isolates belonged to ST80/IV clone and a small percentage to the newly described clone, ST377/V, while HA-MRSA strains were mainly characterized as ST239/III and ST30/IVvar clones. PVL is a bicomponent toxin associated with skin and soft tissue infections, but also with necrotizing pneumonia, especially in children. In total 74% of MRSA were positive for the PVL genes rising from 33% in 2001 to 88% in 2006. PVL-positive MRSA strains belonged to ST80/IV and ST377/V clones. Most PVL-positive CA-MRSA isolated from skin and soft tissue infections, while PVL-positive HA-MRSA isolated from surgical wounds, especially when prosthetic devices were used. In one patient acute staphylococcal osteomyelitis (AO) was diagnosed, due to MRSA carrying the PVL genes. This is the first description of CA-MRSA producing PVL as causative agents of AO suggesting that PVL-positive S. aureus can be isolated from patients with invasive musculo-skeletal infections, including acute childhood osteomyelitis, as well as among patient with skin and soft-tissue infections. Staphylococcal enterotoxins, enterotoxin-like superantigens (enterotoxin gene operon, egc) and the toxic shock syndrome toxin-1 that belong to the pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs) are considered major virulence factors. The genotype tst/egc belonged only to ST30/IV clone and never coexisted with the PVL genes. Other combinations of genes were also detected belonging to clones ST80/IV and ST239/III, suggesting the horizontal transfer of those genes. On the contrary, the PVL genes were detected only in ST80/IV and ST377/V clones, meaning a more specific way of spread. A real-time PCR assay was developed for the quantification of tst gene in methicillin-resistant S. aureus using SYBR Green I (SG) chemistry, which is an easy and cost-effective approach to real-time, since it does not require the design of sequence specific probes and new primers. By the developed method of absolute quantification the results were reproducible and constant, meaning that the assay can be applied in the routine laboratory. The statistically significant difference of tst gene expression among strains associated with SSTIs, suggests that such strains may be the cause of TSS among patients. For the calculation of expression ratios in the relative quantification we applied two mathematical models (2-ΔΔCt and Pfaffl). Comparing ratios derived from the two mathematical methods we found variations, allowing us to suggest the use of the Pfaffl model as the more precise and reliable method.