Οι πρωτεογλυκάνες, μόρια της εξωκυττάριας ουσίας, αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με άλλα μορφορυθμιστικά μόρια (γλυκοπρωτεΐνες, ιντεγκρίνες) καθώς επίσης και με αυξητικούς παράγοντες (FGF, TGF-β, Wnt, hedgehog). Οι πρωτεογλυκάνες ενεργοποιούν ποικίλα μονοπάτια μεταγωγής σήματος και επάγουν πλειοτροπικές αποκρίσεις από τα κύτταρα καθώς συμμετέχουν στον έλεγχο της κυτταρικής προσκόλλησης, μετανάστευσης και πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και επιβίωσης κυττάρων και της μορφογένεσης ιστών και οργάνων. Η agrin, πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης, έχει ανιχνευτεί στις βασικές μεμβράνες των εγκεφάλου, νευρομυϊκής σύναψης, πνεύμονα και νεφρού. Έκφραση της agrin δεν έχει μελετηθεί στο πρώιμο έμβρυο. Στην παρούσα εργασία μας, με τη μέθοδο της RT-PCR και του ανοσοφθορισμού, μελετήσαμε πότε αρχίζει να εκφράζεται και πού εκφράζεται η agrin κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του πρώιμου εμβρύου όρνιθας από το στάδιο Χ (μορίδιο) μέχρι το ΗΗ17 (29 σωμίτες/οργανογένεση). Το mRNA της agrin πρωτοανιχνεύτηκε, σε χαμηλά επίπεδα, στο στάδιο ΗΗ1-ΗΗ2 (προχωρημένο βλαστίδιο) και η έκφρασή του ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Η έκφραση του mRNA της agrin ήταν υψηλή στο στάδιο ΗΗ3 (μέσα σταδίου γαστριδίου), χαμηλότερη στο στάδιο ΗΗ4-5 (πρώιμο νευρίδιο), υψηλή στο στάδιο ΗΗ8-9 (5-6 σωμίτες) και χαμηλότερη στο στάδιο ΗΗ10 (10 σωμίτες). Ένταση φθορισμού της πρωτεΐνης agrin ανιχνεύτηκε και στις τρεις βλαστικές στιβάδες στο στάδιο ΗΗ4 (γαστρίδιο), καθώς και στο νευροεπιθήλιο στο στάδιο ΗΗ8 (4 σωμίτες). Στο στάδιο ΗΗ11 (13 σωμίτες) ο φθορισμός της agrin ήταν ισχυρός στο νευρικό σωλήνα και στους σωμίτες, ενώ ανιχνεύτηκε αξιοσημείωτη ένταση στο άνω τοίχωμα του εντέρου και στα προκαρδιακά κύτταρα. Στο στάδιο ΗΗ17, ο φθορισμός της agrin ήταν έντονος στο νευροεπιθήλιο του νευρικού σωλήνα, ενώ ανιχνεύτηκε και στις βασικές μεμβράνες του διεγκεφάλου και μυελεγκεφάλου. Ένταση έκφρασης της agrin εντοπίστηκε στο φακό και στον αμφιβληστροειδή του οφθαλμού και στο μυοτόμο, αλλά όχι στο δερμοτόμο και σκληροτόμο των σωμιτών. Έντονη ήταν η έκφραση της agrin στο ενδοκάρδιο και στο μυοκάρδιο στην καρδία και στα τοιχώματα του εντέρου. Επίσης, μελετήσαμε το ρόλο της agrin, μέσω αναστολής της λειτουργίας της, με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτής. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η απουσία της πρωτεΐνης agrin προκαλεί ανωμαλίες στην επιθηλιοποίηση κυρίως των σωμιτών, του καρδιακού σωλήνα και του εντέρου. Επίσης, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η agrin φαίνεται να συμμετέχει στα σηματοδοτικά μονοπάτια που καθοδηγούν τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων κατά τη μετανάστευσή τους. Η agrin αρχίζει να εκφράζεται με την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης, ρυθμίζεται αναπτυξιακά και είναι σημαντικός ο ρόλος της στη διαφοροποίηση κυττάρων και στη μορφογένεση ιστών και οργάνων στο πρώιμο έμβρυο. / Agrin is a heparan sulfate proteoglycan and has been studied extensively in the late embryonic and postnatal nervous system and muscle. Agrin seems to play a critical role in the mediation of axonal growth and path finding. We studied the expression of agrin by RT-PCR and immunofluorescence in the chick embryo from stages X (morula) to HH17 (29 somites). Agrin mRNA was first detectable at low levels at stage HH1-HH2 (late blastula) and its expression was developmentally regulated. Expression of agrin mRNA was high at stage HH3 (intermediate streak), lower at stage HH4-5 (head process), high at stage HH8-9 (5-6 somites) and lower at stage HH10 (10 somites). Agrin protein fluorescence was strong in the three germ layers at stage HH4 (definitive streak) and was strong in the neuroepithelium at stage HH8 (4 somites). At stage HH11 (13 somites), agrin fluorescence was strong in the neural tube and somites and was intense in the gut roof plate and in the heart primordia. By stage HH17, agrin fluorescence was strong in the neuroepithelium of neural tube and was detected in the laminal surface of the diencephalon and myelencephalon. Agrin expression was strong in the lens and retina in the eye, was strong in the myotome but was not expressed in the dermotome and sclerotome in the somites, was strong in myocardium and endocardium in the heart and in the gut walls. Immunodetection of agrin was intense in neuroepithelium and mesenchymal tissues as they epithelialize. Inhibition of function of agrin by blocking antibodies showed that agrin is crucial for maintaining basement membrane integrity which mediates the epithelialization especially in somites, heart tube and gut. It is also possible that agrin participates in the signaling pathways that guide neural crest cell migration.

- / -

- / -

H neurocan και η phosphacan είναι πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης. Η neurocan θεωρείτο οτι είναι μια πρωτεογλυκάνη αποκλειστικά του εγκεφάλου. Η phosphacan έχει μελετηθεί σε προχωρημένα στάδια ανάπτυξης εμβρύων ποντικού και αρουραίου. Δεν ήταν γνωστό πότε αρχίζουν να εκφράζονται και πως κατανέμονται χωρο-χρονικά οι neurocan και phosphacan καθώς το έμβρυο αρχίζει την ανάπτυξή του. Μελετήσαμε την έκφραση της neurocan και της phosphacan με RΤ-PCR και ανοσοφθορισμό στο έμβρυο όρνιθας από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο HH17 (29 σωμίτες/πρώιμη οργανογένεση). Επίσης μελετήσαμε το ρόλο της neurocan και phosphacan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Το mRNA της neurocan πρωτοανιχνεύτηκε στο στάδιο του προχωρημένου γαστριδίου (HH4) και η έκφραση του ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Τα πειράματα μας του ανοσοφθορισμού επίσης έδειξαν ότι η neurocan άρχισε να ανιχνεύεται στη νευρική πλάκα και στην εξωκυττάρια ουσία στο στάδιο του προχωρημένου γαστριδίου (HH4). Στα έμβρυα στο στάδιο των 19 σωμιτών (ΗΗ13), ο φθορισμός ήταν έντονος στον μυελεγκέφαλο, τη νωτοχορδή, στα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων, στο κάτω τοίχωμα του φάρυγγα, στο ραχιαίο μεσοκάρδιο και μυοκάρδιο και λιγότερο στο ενδοκάρδιο και στα φαρυγγικά τόξα όπου έχουν μεταναστεύσει κύτταρα των νευρικών κρηπίδων. Στο στάδιο των 29 σωμιτών (HH17), η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον τελεγκέφαλο, μυελεγκέφαλο και στο νευρικό σωλήνα. Η έκφραση της neurocan ήταν ισχυρή στον αμφιβληστροειδή, λιγότερη στο φακό και έδειχνε μεγάλη ένταση στον κερατοειδή χιτώνα στον οφθαλμό, έντονη στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στο μυοκάρδιο και αχνή στο ενδοκάρδιο στην καρδιά και έντονη στους σωμίτες, στο μεσονέφρο και στις νησίδες αίματος. Σε μια σειρά λειτουργικών πειραμάτων με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της neurocan προκάλεσε τα νευροεξωδερμικά κύτταρα να επιδεικνύουν μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά και ο εγκέφαλος να μην έχει αναπτυχθεί φυσιολογικά. Επίσης ανεστάλη η μορφογένεση της καρδιάς και των σωμιτών στα έμβρυα αυτά. / Neurocan, a chondroitin sulfate proteoglycan, interacts with other molecules of the extracellular matrix and the cell surface and participates in signalling pathways. Phosphacan is a chondroitin/ keratan sulfate proteoglycan that has been studied extensively in the late embryonic and postnatal brain and in the spinal cord. Relatively little is known about the neurocan tissue-specific distribution or function during the development of the embryo. We studied the neurocan and phosphacan spatio-temporal expression pattern by RT-PCR and immunofluorescene in the early chick embryo from the morula stage (stage XI) to early organogenesis (stage HH17, 29 somites). We also studied the role of neurocan and phosphacan by using blocking antibodies directed against neurocan or phosphacan in a set of functional studies. Neurocan mRNA was first detectable at the late gastrula stage (HH4) and its expression was developmentally regulated. Neurocan protein was first detectable in cells of the inchoate neural plate and in the extracellular matrix in embryos at stage HH4. At stage HH13 (19 somites), neurocan fluorescence was intense in the myelencephalon, notochord, neural crest cells, the foregut lower wall, pharyngeal arches, dorsal mesocardium, myocardium and in the endocardium. At stage HH17 (29 somites), neurocan expression was intense in the telencephalon, myelecenphalon, diencephalon and in the neural tube. Expression of neurocan was strong in the retina, lens and intense in the cornea in the eye, intense in the myocardium and lower in endocardium in the heart. In a set of functional studies using monoclonal antibodies directed against neurocan, the inhibition of neurocan function resulted in neural plate duplications, the neurepithelial cells exhibited mesenchymal characteristics and the somite, heart and gut formation were inhibited. The observed neural plate duplications point to an important role of neurocan to modulate the activity and availability of growth factor(s) during the induction of neurectoderm. Phosphacan mRNA was first detectable at the morula stage (XI) and it continued to be expressed during development. At the blastula stage (XIII)phosphacan immunofluorescence was strong in the epiblast and hypoblast. At the gastrula stage (HH3-ΗΗ4), immunofluorescence was strong in the cells around and also ingressing through the streak and in mesenchymal cells. At stage HH8 (4 somites), immunofluorescence was intense in the elevated neural plate, especially in its dorsal surface. This implies a role for phosphacan in the fusion of neural folds medially during the formation of the neural tube. At stage HH11 (13 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the neural tube, somites, gut lower wall and in the myocardium, endocardium and dorsal mesocardium in the heart and intense in the blood islands. By stage HH17 (29 somites), phosphacan immunofluorescence was strong in the myelencephalon and diencephalon, in the lens and retina in the eye, the neural crest cells, the myotome but not the dermatome and sclerotome in somites, the myocardium and endocardium in the heart and the dorsal aorta. Inhibition of function of phosphacan by blocking antibodies showed that phosphacan participates in the fusion of neural folds to form the neural tube, in the opticoele determination to form the retina and in somite, heart and gut morphogenesis.

- / -

- / -

- / -

- / -

- / -

Οι πρωτεογλυκάνες και οι αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών τους αλληλεπιδρούν με αυξητικούς παράγοντες, διαμεμβρανικούς υποδοχείς όπως οι ιντεγκρίνες, ένζυμα, αναστολείς πρωτεασών και με άλλα μόρια της εξωκυττάριας ύλης όπως η ινονεκτίνη, η λαμινίνη και η tenascin. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε τη χωροχρονική κατανομή των πρωτεογλυκανών versican και CD44 με τη μέθοδο της RT-PCR και του ανοσοφθορισμού από το στάδιο ΧΙ-ΧΙΙ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ16+ (28-29 ζεύγη σωμιτών) και τον ρόλο της versican και της CD44 με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. Η versican είναι πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης και αλληλεπιδρά με αυξητικούς παράγοντες, με διάφορες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης και με διαμεμβρανικούς υποδοχείς όπως η CD44. Τα αποτελέσματα της RT-PCR έδειξαν ότι το mRNA της versican εκφράζεται σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια που μελετήσαμε. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα προϊόντα εναλλακτικής ωρίμανσης της versican που ανιχνεύσαμε ακόμα και στο στάδιο του μοριδίου και που η έκφρασή τους ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Η παρουσία του mRNA της versican σε υψηλά επίπεδα στο στάδιο του μοριδίου (ΧΙ-ΧΙΙ) υποδεικνύει ότι το mRNA της versican είναι ωογενετικής προέλευσης στο στάδιο αυτό. Τα πειράματα μας του ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η versican πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο στάδιο του μοριδίου και εκφράζεται έντονα στην επιβλάστη και στην υποβλάστη στο στάδιο του προχωρημένου βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ). Στο στάδιο ΗΗ3+ (ενδιάμεσο γαστρίδιο / intermediate streak) παρατηρήσαμε μεγάλη ένταση φθορισμού στα κύτταρα που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα και στα μεσεγχυματικά κύτταρα που θα σχηματίσουν το μεσόδερμα και το ενδόδερμα. Στο στάδιο ΗΗ4 (προχωρημένο γαστρίδιο / definitive streak) ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύθηκε κύτταρα που μεταναστεύουν μέσα από την πρωτογενή αύλακα καθώς και στα κύτταρα που έχουν αρχίσει να σχηματίζουν το μεσόδερμα και το ενδόδερμα. Στο στάδιο που το έμβρυο έχει σχηματίσει 4 ζεύγη σωμιτών (στάδιο ΗΗ8), ανιχνεύσαμε υψηλή ένταση φθορισμού της versican στη νευρική πλάκα και στις νευρικές πτυχές καθώς ανασηκώνονται να σχηματίσουν το νευρικό σωλήνα. Στο στάδιο ΗΗ12 (16 ζεύγη σωμιτών), ισχυρή ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύσαμε στο νευρικό σωλήνα, στο γειτονικό του εξώδερμα, στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας (neural crest), στα κύτταρα του σωμίτη, στο μεσονέφρο και στο γειτονικό του πλάγιο μεσόδερμα που θα σχηματίσει τους μεσονεφρικούς σωληνίσκους. Αργότερα στην ανάπτυξη, ισχυρή ένταση φθορισμού της versican ανιχνεύσαμε επίσης στο διεγκέφαλο, στον οπτικό μίσχο, στο μεσεγκέφαλο, στο μυελεγκέφαλο, στα τοιχώματα του φάρυγγα και της ραχιαίας αορτής, στο ραχιαίο μεσοκάρδιο, στο μυοκάρδιο και στο ενδοκάρδιο, στο μυοτόμο και σκληροτόμο στους σωμίτες, στα τοιχώματα του εντέρου, καθώς και στην εξωκυττάρια ύλη των εμβρυϊκών κοιλοτήτων. Πειράματα σε έμβρυα που εκτέθηκαν στο αντίσωμα έναντι της versican σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης από το μορίδιο ως το προχωρημένο γαστρίδιο έδειξαν ότι η versican πιθανόν να συμμετέχει στα μονοπάτια σηματοδότησης που καθοδηγούν τη μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας, στο μοριακό δίκτυο για το σχηματισμό του νευρικού σωλήνα, στον καθορισμό ή / και στη διαμερισματοποίηση των προκαρδιακών κυττάρων κατά το σχηματισμό της καρδιάς και στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκών κοιλοτήτων. Η CD44 είναι πρωτεογλυκάνη της κυτταρικής επιφάνειας και είναι ο κύριος υποδοχέας του υαλουρονικού. Ανιχνεύσαμε τη CD44 πρωτεΐνη ακόμα και στο στάδιο του μοριδίου. Η παρουσία του mRNA της CD44 σε υψηλά επίπεδα στο στάδιο του μοριδίου μπορεί να δείχνει ότι το mRNA είναι ωογενετικής προέλευσης. Με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού ανιχνεύσαμε έντονο φθορισμό της CD44 στα κύτταρα της επιβλάστης και ειδικότερα σε αυτά που γειτονεύουν με το βλαστόκοιλο και στην υποβλάστη στο στάδιο του προχωρημένου βλαστίδιου (ΧΙΙΙ), ενώ στο στάδιο ΗΗ3+ καθώς συνεχίζονται οι μορφογενετικές κινήσεις της γαστριδίωσης, η CD44 παρουσιάζει ισχυρή ένταση φθορισμού στα κύτταρα της επιβλάστης ,στα μεσεγχυματικά κύτταρα και στα κύτταρα του ενδοδέρματος. Στο στάδιο ΗΗ8 (4 ζεύγη σωμίτες), ανιχνεύσαμε ένταση φθορισμού της CD44 στη νευρική πλάκα και στις νευρικές πτυχές με πρότυπο έκφρασης παρόμοιο με αυτό της έκφρασης της versican. Αργότερα στην ανάπτυξη, στο στάδιο ΗΗ16+ (28-29 ζεύγη σωμιτών) ανιχνεύσαμε ισχυρή ένταση φθορισμού της CD44 ανιχνεύθηκε στα τοιχώματα του διεγκεφάλου, του μεσεγκεφάλου και του νευρικού σωλήνα, στα τοιχώματα του φάρυγγα, στις ραχιαίες και κοιλιακές αορτές, στα αορτικά τόξα, στη νωτοχορδή, στην εξωκυττάρια ύλη στην κοιλότητα του μεσεγκεφάλου και στην κοιλότητα του φάρυγγα, στο ακουστικό κυστίδιο και στην κοιλότητα του ακουστικού κυστιδίου και στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας που μεταναστεύουν προς το ακουστικό κυστίδιο. Υψηλή ένταση φθορισμού της CD44 ανιχνεύσαμε επίσης στο σκληροτόμο και στο μυοτόμο στους σωμίτες, στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, στο ήπαρ, στο μυοκάρδιο, στο ενδοκάρδιο, στον αγωγό φλέβας και στο μεσονέφρο. Έμβρυα που εκτέθηκαν στο αντίσωμα έναντι της CD44 σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης από το μορίδιο ως το πρώιμο νευρίδιο έδειξαν το σημαντικό ρόλο της CD44 στην μορφογένεση του εγκεφάλου, στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής της κοιλότητας του εγκεφάλου και των άλλων εμβρυϊκών κοιλοτήτων, στην μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας, στον σχηματισμό της καρδιάς και του αγγειακού συστήματος και στη μορφογένεση των σωμιτών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν τη συνεργιστική δράση των CD44 και versican κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου. / Proteoglycans and their associated glycosaminoglycans can bind growth factors, integrin and non-integrin cell surface molecules, enzymes, protease inhibitors and other extracellular matrix components including fibronectin, laminin and tenascin. We studied the expression and spatiotemporal distribution of versican and CD44 by RT-PCR and immunofluorescence in the chick embryo from the morula stage (stage XI-XII) to early organogenesis (stage HH16+, 28-29 somites). We also studied the versican and CD44 role by using blocking antibodies in the early chick embryo. Versican is a chondroitin sulfate proteoglycan that binds growth factors and interacts with various extracellular matrix proteins and cell surface molecules including the CD44. Combined RT-PCR and immunohistochemistry demonstrated the expression of versican as early as the morula stage. Interestingly, we detected splice variants of versican at the morula stage, and their expression was developmentally regulated. The presence of versican mRNA at the morula stage may indicate that it is of oogenetic origin. Versican fluorescence was strong in the epiblast and the hypoblast at the late blastula stage (XIII). At stage HH3+ (intermediate streak), versican expression was intense in the cells ingressing through the primitive streak and the migrating mesenchymal cells which will form the mesoderm and endoderm. By the definitive streak stage (HH4), versican fluorescence was intense in the cells ingressing through the primitive streak and in the mesenchymal cells that have already started to form the mesoderm and endoderm. At stage HH8 (4 somite pairs), versican expression was strong in the neural plate, the elevated neural folds and the ectoderm neighboring the neural folds. At stage HH12 (16 somite pairs), versican fluorescence was intense in the neural tube and its adjacent ectoderm, the neural crest cells, the somite and in the mesonephros and in the adjacent lateral mesoderm that will form the mesonephric tubules. Later in development, versican fluorescence was intense in the diencephalon, the optic stalk, mesencephalon, myelencephalon. Versican fluorescence was also intense in the dorsal mesocardium, myocardium and endocardium, dorsal aorta and aortic arches, in the myotome and sclerotome in somites, gut and in the extracellular matrix of embryonic cavities. Inhibition of the function of versican by blocking antibodies showed that versican is crucial for the neural tube closure, neural crest migration, formation of the heart tube, for the architecture of embryonic cavities and consequently tissue and organ morphogenesis. CD44 is a transmembrane part-time proteoglycan and the main receptor for hyaluronan. We detected CD44 protein even at the morula stage. The presence of high levels of CD44 mRNA at the morula stage indicated that this is an oogenetic mRNA. CD44 fluorescence was strong in the epiblast cells, especially those neighboring the blastocoele, and in the hypoblast at the late blastula stage (XIII). At stage HH3+, during gastrulation, CD44 was expressed strongly in the epiblast cells, in mesenchymal cells and in endoderm cells. At stage HH8 (4 somite pairs), strong CD44 expression was detected in the neural plate and neural folds and their adjacent ectoderm and this expression pattern was similar to that of versican. Later in development, CD44 expression was intense in the diencephalon, optic stalks, mesencephalon, myelencephalon, metencephalon, auditory vesicles and the neural crest cells migrating towards the auditory vesicle and the neural tube. CD44 fluorescence was also intense in the dorsal mesocardium, myocardium, endocardium, aortae and aortic arches, sclerotome and myotome in somites, mesonephros, liver, gut and in the migrating neural crest cells that will form the sympathetic and enteric ganglia. Inhibition of CD44 function by blocking antibodies showed that CD44 is crucial for the architecture of the embryonic cavities such as the brain lumen, neural tube closure, neural crest cell migration, cardiac and cardiovascular formation and somite morphogenesis. Our results showed a synergistic role of CD44 and versican during the development of the early embryo.