Η ανάπτυξη του εμβρύου καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ύλης. Στην εξωκυττάρια ύλη περιέχονται πρωτεογλυκάνες, εκ των οποίων οι perlecan και aggrecan είναι από τις πρώτες που εκφράζονται στο πρώιμο έμβρυο. Μελετήσαμε τη χωρο-χρονική κατανομή των perlecan και aggrecan με RT-PCR, ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση από το στάδιο Χ (μορίδιο) έως το στάδιο ΗΗ17 (29-32 σωμίτες) στο πρώιμο έμβρυο όρνιθας. Επιπρόσθετα, μελετήσαμε το ρόλο των perlecan και aggrecan με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αυτών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου.Η perlecan πρωτο-ανιχνεύτηκε στο στάδιο του μοριδίου (στάδιο Χ) μόλις πριν τη συναρμολόγηση της πρώτης βασικής μεμβράνης που σχηματίζεται στο πρώιμο έμβρυο. Το πρότυπο κατανομής των μορίων αυτών σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς ρυθμίζεται αναπτυξιακά. Η perlecan πρωτο-ανιχνεύτηκε στο στάδιο του μοριδίου (στάδιο Χ) μόλις πριν τη συναρμολόγηση της πρώτης βασικής μεμβράνης που σχηματίζεται στο πρώιμο έμβρυο. Εξαιρετικά μεγάλη ένταση φθορισμού για την perlecan επέδειξαν οι βασικές μεμβράνες/ εξωκυττάρια ύλη του νευροεπιθηλίου και μεσεγχυματικών ιστών κατά την επιθηλιοποιησή τους και επίσης τα κύτταρα κατά τη γαστριδίωση και τα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων. Όταν αναστείλαμε τη δράσης της με ειδικά αντισώματα έναντι αυτής παρατηρήσαμε φθορά των βασικών μεμβρανών.Ο ρόλος της perlecan φαίνεται να είναι σημαντικός στη δόμηση βασικών μεμβρανών, στην επιθηλιοποίηση ιστών και στη διαθεσιμότητα αυξητικών παραγόντων. Ανιχνεύσαμε την aggrecan για πρώτη φορά στο στάδιο του βλαστιδίου (στάδιο ΧΙΙΙ) και η παρουσία της φαίνεται να είναι καθοριστικής σημασίας στη δημιουργία του βλαστόκοιλου, της πρώτης εμβρυϊκής κοιλότητας στο στάδιο αυτό. Ένταση φθορισμού για την aggrecan στην αναπτυσσόμενης καρδιάς καθώς και στα κύτταρα των νευρικών κρηπίδων που μεταaναστεύουν. Η αναστολή της δράσης της aggrecan προκάλεσε ανωμαλίες στην αρχιτεκτονική των ιστών και τη φυσιολογική μορφογένεση του εγκεφάλου, της καρδιάς, της ραχιαίας αορτής και της νωτοχορδής. Ο ρόλος της aggrecan σε συνεργισμό με την συνδετική πρωτεΐνη και το υαλουρονικό οξύ φαίνεται να είναι σημαντικός στη δημιουργία και τη διατήρηση της αρχιτεκτονικής των εμβρυϊκών κοιλοτήτων και στη δημιουργία διόδων για την μετανάστευση κυττάρων και την οργανογένεση. / The development of the embryo is determined by specific interactions between cells and components of the extracellular matrix. The extracellular matrix of the embryo is exuberantly rich in proteoglycans, the primary and earliest expressed ones being perlecan and aggrecan. We studied the spatio-temporal distribution of perlecan and aggrecan by RT-PCR, immunofluore-scence and immunoprecipitation in the early chick embryo from the blastoderm at stage X (morula) to stage HH17 (29-32 somites). In addition, we studied the functional importance of perlecan and aggrecan in the early chick embryo by using blocking antibodies. The distribution pattern of these molecules in different cell populations was developmentally regurated. Perlecan was first detectable at the morula stage just before the assembly of the first basement membrane. Perlecan fluorescence was intense in the basement membranes/ extracellular matrix of the neuroepithelium and mesenchematic tissues during their epithelialization and also in migrating cells at gastrula stage and in the neural crest cells. Lack of functional perlecan caused damaged basement membranes. The role of perlecan seemw to be important in the formation of basement membrane, in the epithelialization of tissues and in availability of growth factors.Aggrecan was first detectable at the blastula stage (stage XIII) and its presence may be important for the formation of blastocoel, the first embryonic cavity at this stage. In the developing heart, aggrecan fluorescence was intense and also in the migrating neural crest cells.Lack of functional aggrecan interfered with tissue architecture during normal morphogenesis of the brain, notochord, heart tube and dorsal aorta. The role of aggrecan in concert with link protein and hyaluronic acid is fundamental for the formation and maintenance of embryonic cavities and for determination of passages during migration of cells and organogenesis.

Οι πρωτεογλυκάνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με άλλα μορφορυθμιστικά μόρια όπως γλυκοπρωτεΐνες και ιντεγκρίνες, καθώς επίσης και με αυξητικούς παράγοντες. Μεγάλο μέρος των ποικίλων λειτουργιών των πρωτεογλυκανών συνδέεται με τις γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAGs) τους. Για να μελετήσουμε τη λειτουργία των πρωτεογλυκανών κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου όρνιθας χρησιμοποιήσαμε το β-D-xyloside, έναν εξειδικευμένο αναστολέα της βιοσύνθεσης των πρωτεογλυκανών και ειδικότερα της πρόσδεσης των αλυσίδων γλυκοζαμινογλυκανών στον πρωτεϊνικό κορμό των πρωτεογλυκανών. Χαμηλές συγκεντρώσεις β-xyloside που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την προσθήκη θειϊκής χονδροϊτίνης αλλά όχι της θειϊκής ηπαράνης στον πρωτεϊνικό κορμό, αποτελούν ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των πρωτεογλυκανών. Τα πρότυπα των πρωτεϊνών στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside έδειξαν μετατόπιση των ραδιενεργών κορυφών σε μικρότερη μοριακή μάζα που φαίνεται να οφείλεται στη μείωση του μεγέθους πρωτεογλυκανών. Ήταν αξιοσημείωτο στα αποτελέσματά μας ότι το β-xyloside μετέβαλλε τη μορφή της πρωτεογλυκάνης θειϊκής χονδροϊτίνης decorin προς χαμηλότερα μοριακά βάρη ενώ δε φάνηκε να επηρεάζει το μέγεθος της πρωτεογλυκάνης θειϊκής ηπαράνης perlecan. Στα έμβρυα που μεταχειρίστηκαν με β-xyloside περισσότερη πρωτεϊνη συντέθηκε στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ (μορίδιο), σε σχέση με αυτά του σταδίου ΗΗ2 (αρχή πρωτογενούς αύλακας/πρώιμο γαστρίδιο), συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα έμβρυα μάρτυρες. Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά μια επιταχυνόμενη κινητοποίηση και/ή μια μετάφραση των ωογενετικών μεταγράφων στα έμβρυα του σταδίου ΧΙΙ, όταν διαταράχτηκε ο μεταβολισμός των πρωτεογλυκανών. Η απορρύθμιση πρωτεογλυκανών, τροποποιώντας τη λειτουργικότητα και επηρεάζοντας το επίπεδο έκφρασής τους, είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία του πρώιμου εμβρύου να δομήσει την εξωκυττάρια ύλη φυσιολογικά. Το αποτέλεσμα ήταν η κατάρρευση της τυπικής αρχιτεκτονικής του πρώιμου εμβρύου στα πειράματά μας. Πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης φαίνεται να χρειάζονται για την οργάνωση του σταδίου του βλαστιδίου της όρνιθας. Για την επαγωγή του νευρικού συστήματος φάνηκε να χρειάζονται πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης/δερματάνης που έχουν συγκεντρωθεί από το στάδιο πριν την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης και η συνεχής βιοσύνθεση των πρωτεογλυκανών είναι απαραίτητη για τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα. Μελετήσαμε επίσης το πρότυπο κατανομής της συνδετικής πρωτεϊνης πρωτεογλυκανών με ανοσοφθορισμό και ανοσοκατακρήμνιση και το ρόλο αυτής της γλυκοπρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής. Η συνδετική πρωτεΐνη μεσολαβεί στην πρόσδεση στο υαλουρονικό οξύ πρωτεογλυκανών όπως οι aggrecan, neurocan, versican και brevican δημιουργώντας σταθερά σύμπλοκα στην εξωκυττάρια ύλη. Η αναγνώριση των μορφών της συνδετικής πρωτεΐνης 1 (LP1, 48kDa) και συνδετικής πρωτεΐνης 2 (LP2, 44kDa) στο πρώιμο έμβρυο ήταν επίσης ένα ενδιαφέρον εύρημα των πειραμάτων μας. Είναι γνωστό ότι συνδυασμοί των LP1 και LP2 δημιουργούν πιο σταθερά σύμπλοκα απ’ ότι μόνο του το καθένα από τα δύο μόρια αυτά. Αυτό φαίνεται και από τα πειράματά μας που δείχνουν ότι η aggrecan (180kDa) φαίνεται να συν-κατακρημνίζεται με τις συνδετικές πρωτεΐνες LP1 και LP2. Τα πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η συνδετική πρωτεΐνη αρχίζει να εκφράζεται στο στάδιο του βλαστιδίου και επιδεικνύει μια διαφορική έκφραση χωρο-χρονικά κατά την ανάπτυξη του πρώιμου εμβρύου υποδεικνύοντας ότι είναι σημαντική στην κυτταρική μετανάστευση και διαφοροποίηση κυττάρων και στη μορφογένεση ιστών και οργάνων. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από τη μελέτη του ρόλου της, στην επόμενη σειρά πειραμάτων μας με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος έναντι αυτής. Η αναστολή της λειτουργίας της συνδετικής πρωτεϊνης με τη χρήση αντισωμάτων έναντι αυτής έδειξε ότι αυτή η πρωτεϊνη φαίνεται να είναι σημαντική στην οργάνωση της νευρικής πλάκας και τη μορφογένεση του νευρικού σωλήνα, στη μορφογένεση του καρδιακού σωλήνα, του εντέρου, στο σχηματισμό της ραχιαίας αορτής και στην επιθηλιοποίηση των σωμιτών. / Proteoglycans participate in cellular interactions via modulating the effects of growth factors or with other mechanisms in early embryo. The majority of the functions of proteoglycans are associated with the glycosaminoglycan (GAG) chains. We used β-D-xyloside, an inhibitor of proteoglycan synthesis and specifically of GAG attachment to proteoglycan core proteins, to study proteoglycan functions in early chick embryo development. Low concentrations of β-xyloside which are known to affect differentially chondroitin but not heparan sulfate proteoglycan biosynthesis have provided a convenient tool for altering proteoglycan production. The protein patterns of xyloside-treated embryos showed a shift of radioactive peaks to lower molecular mass which could be attributed to the reduction of proteoglycan size as was demonstrated by chondroitinase ABC/AC II treatments. It was notable in our data that β-xyloside altered the chondroitin sulfate proteoglycan decorin to lower molecular mass while it did not seem to affect the size of the heparin sulfate proteoglycan perlecan. More protein was synthesized from xyloside-treated embryos at stage XII (morula) than from embryos at stage HH2 (initial primitive streak/early gastrula) when compared to the controls. This could have reflected an accelerated translation and/or mobilization of oogenetic transcripts in embryos at stage XII when proteoglycan metabolism was disrupted. Misregulation of proteoglycans by modulating the functionality of the protein and by influencing their expression level resulted in an inability of the early embryo to assemble a stable extracellular matrix that would have been normally produced. These changes were associated with the collapse of the typical blastula architecture and inhibition of the induction of mesoderm in the chick embryo. Induction of neuroectoderm required proteoglycans assembled before the initiation of gastrulation movements. However, sustained proteoglycan biosynthesis was required for the morphogenetic movements to form the neural tube and the rest of the embryonic axis. We also studied the spatiotemporal distribution pattern of link protein by immunofluorescence and immunoprecipitation and the role of this glycoprotein by blocking antibodies in the early chick embryo. The recognition of the link protein 1 (LP1, 48 kDa) and link protein 2 (LP2, 44 kDa) types was an important finding of our study. Link protein links several proteoglycans, such as aggrecan to hyaluronan, creating stable aggregates in the extracellular matrix and has a general function in the organization of the extracellular matrix. It is known that combinations of LP1 and LP2 create more stable complexes than the individual link protein molecule. This was also shown in our experiments, in that aggrecan (180kDa) co-precipitated with LP1 and LP2. Our immunofluorescent experiments showed that link protein expression was first detectable at the blastula stage (st. XIII) and its presence may be fundamental as the first extracellular matrix starts to assemble before the initiation of the first major cellular migrations during the gastrula stage. Link protein influorescence was strong in the cells ingressing through the primitive streak and in the migrating cells in embryos at stage HH3 (intermediate streak/mid-gastrula). At stage HH4 (definitive streak/late gastrula), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural plate. At stage HH4-5 (head process), link protein fluorescence was strong at the apical surface of the neural folds, notochord and endoderm. At stage HH13 (19 somites), link protein fluorescence was intense in the encephalic vesicles, in the extracellular matrix, in the lumen of encephalic vesicles, intense in migrating neural crest cells, neural tube and in notochord, strong in gut lower wall, hard tube and dorsal aorta wall, intense in dermomyotome and strong in sclerotome in somites. By stage HH17 (29 somites), link protein fluorescence was strong in neuroepithelium and extracellular matrix in the lumen of the diencephalon, strong in neural crest cells, in the intraretinal space in the eye, in myocardium and endocardium, in dorsal aorta, in dermomyotome, the outer surface of pharyngeal arches wall of aortic arches and intense in thyroid rudiment. Inhibition of function of link protein by blocking antibodies showed that link protein was important in neuroepithelial tissue organization and neural tube closure, in normal differentiation of the neural tube to form the brain, in the morphogenesis of the heart tube, the dorsal aorta and gut and in somite epithelialization.