Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα πανταχού παρόν ένζυμο, το οποίο θραύει ενδονουκλεολυτικά τα πρόδρομα μετάγραφα των tRNA, παράγοντας τα ώριμα 5΄ άκρα τους. Πρόσφατα, βρέθηκε πως η RNase P συμμετέχει στην μεταγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν tRNA, rRNA και άλλα μικρά μη κωδικοποιούντα RNA. Η RNase P έχει ανιχνευθεί σε αντιπροσώπους και των τριών περιοχών της ζωής (βακτήρια, αρχαία, ευκαρυώτες), καθώς επίσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, με μοναδική εξαίρεση το αρχαίο Nanoarchaeum equitans. Σε σχεδόν όλους τους οργανισμούς, η RNase P είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από μία απαραίτητη RNA υπομονάδα και ποικίλο αριθμό πρωτεϊνών. Υπάρχουν μόνο δύο, πρόσφατα, αναφερόμενες εξαιρέσεις, αυτές των ανθρώπινων μιτοχονδρίων και των πλαστιδίων του φυτού A. thaliana, των οποίων η RNase P είναι αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η RNA υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την καταλυτική λειτουργία του ολοενζύμου της RNase P από τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες. Οι πρωτεϊνικές υπομονάδες είναι απαραίτητες για την κατάλυση in vivo και παίζουν πολλούς ρόλους στη δομή και λειτουργία του ολοενζύμου. Η πυρηνική RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι το πιο πλούσιο, σε πρωτεϊνική σύσταση, ολοένζυμο ανάμεσα στα ευκαρυωτικά ένζυμα RNase P που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο αποτελείται από μια RNA υπομονάδα και οχτώ πρωτεΐνες (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν ομοιότητες με τις ομόλογές τους από ανώτερα ευκαρυωτικά ένζυμα, όπως του ανθρώπου, ενώ παράλληλα διατηρούν ιδιοσυγκρασιακά χαρακτηριστικά. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφουμε την κλωνοποίηση και τις ιδιότητες αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης DRpp29 με την RNA υπομονάδα της RNase P του D. discoideum. Πειράματα ηλεκτροφορητικής κινητικότητας έδειξαν, πως η DRpp29 δεσμεύεται ειδικά με την RNA υπομονάδα, ένα χαρακτηριστικό που επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τον σχεδιασμό του μοντέλου της δομής της DRpp29. Επιπλέον, κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα απολοιφής της DRpp29, για να μελετηθούν οι περιοχές της DRpp29 που συνεισφέρουν ή/και είναι υπεύθυνες για την άμεση αλληλεπίδρασή της με την RNA υπομονάδα. Εντοπίστηκε μια περιοχή, μεταξύ των ευκαρυωτικών ομολόγων, πλούσια σε λυσίνες και αργινίνες, η οποία φαίνεται να διευκολύνει την αλληλεπίδραση των δύο αυτών υπομονάδων. Προσδιορίσαμε, επίσης, με τη διεξαγωγή ανάλυσης αποτυπώματος και τη χρήση δεδομένων βιοπληροφορικής, τη δευτεροταγή δομή της RNA υπομονάδας της RNase P του D. discoideum. Με ανάλυση αποτυπώματος αποκαλύφθηκε, πως η DRpp29 αλληλεπιδρά με την περιοχή εξειδίκευσης (“S-domain”) της RNA υπομονάδας, δείχνοντας, ότι η DRpp29 επηρεάζει την ικανότητα δέσμευσης του υποστρώματος από το ένζυμο. Στη συνέχεια, ελέγχθη η ικανότητα της DRpp29 και των μεταλλαγμάτων της να σχηματίζουν, μαζί με την RNA υπομονάδα του E. coli, ενεργά ενζυμικά σύμπλοκα με δραστικότητα RNase P. Τέλος, ελέγχθη ο σχηματισμός ενός ελάχιστα καταλυτικού πυρήνα της RNase P του D. discoideum, με την πραγματοποίηση πειραμάτων ομόλογης ανασύστασης με την DRpp29, τον πρωτεϊνικό της συνεργάτη DRpp21 και την RNA υπομονάδα / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous enzyme, which endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. Recently, RNase P has been found to participate in the transcription of tRNA, rRNA and other small non-coding RNA genes. RNase P occurs in representatives of all domains of life (bacteria, archaea, eukarya), as well as in mitochondria and chloroplasts, apart from the archeon Nanoarchaeum equitans. In almost every organism, RNase P is a ribonucleoprotein complex, with one essential RNA and a multiple number of protein subunits. There are only two exceptional cases, that of the human mitochondria and the plastids from A. thaliana, whose RNase P lacks an RNA subunit. The RNA subunit is responsible for the main catalytic function of the RNase P holoenzyme in bacteria, archaea and eukarya. Protein subunits are essential for catalysis in vivo and they play multiple roles in structure and function of the holoenzyme. Dictyostelium discoideum nuclear RNase P is the most proteinaceous holoenzyme among the eukaryal RNase P studied so far. It’s a ribonucleoprotein complex, which consists of one RNA and eight protein subunits (DRpp40, DRpp30, DRpp29, DRpp25, DRpp21, DRpp20, DPop1, DPop5). These proteins display similarities with its counterparts from higher eukaryotes, such as the human enzyme, but at the same time they retain distinctive characteristics. In the present study, we report the molecular cloning and interaction details of DRpp29 and RNase P RNA. Electromobility shift assays exhibited that DRpp29 binds specifically to the RNase P RNA subunit, a feature that was further confirmed by the molecular modeling of the DRpp29 structure. Moreover, deletion mutants of DRpp29 were constructed in order to investigate the domains of DRpp29 that contribute to and/or are responsible for the direct interaction with the D. discoideum RNase P RNA. A eukaryotic specific, lysine and arginine rich region was revealed, which seems to facilitate the interaction between these two subunits. We determined the D. discoideum RNase P RNA secondary structure based on footprinting analysis and bioinformatic data. Furthermore, footprinting analysis revealed that DRpp29 interact with the specificity domain (“S-domain”) of the RNA subunit, suggesting that DRpp29 influence the enzyme’s substrate binding ability. Furthermore, we tested the ability of wild type and mutant DRpp29 to form active RNase P enzymatic particles with the E. coli’s RNase P RNA. Finally, we tested the formation of a minimal catalytic core of the D. discoideum RNase P, by performing homologous reconstitution experiments with DRpp29, its protein partner DRpp21 and the RNA subunit

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης των υπομονάδων του GABAΑ υποδοχέα σε τομές από τον διαφραγματικό και τον κροταφικό ιππόκαμπο αμέσως μετά την θανάτωση του ζώου και κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων που έχουν παρατηρηθεί μόνο σε τομές του κροταφικού ιππόκαμπου. Επιπλέον, μελετήθηκε η ποσοτική και τοπογραφική κατανομή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης με την χρήση του ραδιενεργού ιχνηθέτη [3H]-CHA (αγωνιστής των Α1 υποδοχέων) στον κροταφικό και τον διαφραγματικό ιππόκαμπο αμέσως μετά την θανάτωση του επίμυος. Η μελέτη της κατανομής των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης έδειξε ότι η δέσμευση της [3H]-CHA ήταν μικρότερη στον κροταφικό σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο με την μεγαλύτερη διαφορά να εντοπίζεται στην CA1 περιοχή. Το παραπάνω αποτέλεσμα έρχεται σε συμφωνία με την υπόθεση, ότι οι συνάψεις του κροταφικού ιππόκαμπου εμφανίζουν μεγαλύτερη πιθανότητα απελευθέρωσης γλουταμινικού οξέος σε σύγκριση με αυτές του διαφραγματικού ιππόκαμπου, καθώς οι Α1 υποδοχέων αδενοσίνης εντοπίζονται στην CA1 περιοχή κυρίως προσυναπτικά όπου ελέγχουν την απελευθέρωση γλουταμινικού οξέος. Στη συνέχεια της παρούσας μελέτης δείξαμε ότι η έκφραση του mRNA και των πρωτεϊνών για τις κυριότερες υπομονάδες του GABAA υποδοχέα είναι διαφορετική μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού ιπποκάμπου. Ειδικά, στην CA1 περιοχή του ιπποκάμπου η έκφραση των α1, β2 και γ2 υπομονάδων ήταν μικρότερη, ενώ αντίθετα η έκφραση των α2 και β1 υπομονάδων ήταν μεγαλύτερη στον κροταφικό ιπποκάμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που αφορούν την συνέκφραση των υπομονάδων στο σύμπλοκο του GABAA υποδοχέα τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο α1β2 υποτύπος του GABAA υποδοχέα επικρατεί στον διαφραγματικό ιππόκαμπο, ενώ ο α2β1 υπότυπος κυριαρχεί στον κροταφικό ιππόκαμπο. Η διαφορετική κατανομή των υποτύπων στους δυο πόλους του ιπποκάμπου που είναι εντονότερη στην CA1 περιοχή, μπορεί να επηρεάζει τις ιδιότητες του διαύλου (αγωγιμότητα, πλάτος και διάρκεια των IPSCs), δείχνοντας ότι οι υπότυποι του GABAA υποδοχέα που εντοπίζονται στον κροταφικό ιππόκαμπο έχουν μικρότερη ανασταλτική αποτελεσματικότητα, η οποία συμφωνεί με την μικρότερη GABAA-προερχόμενη αναστολή που έχει δειχθεί στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιππόκαμπου. Επιπλέον θα μπορούσε να εξηγήσει την μεγαλύτερη επιρρέπεια του κροταφικού ιππόκαμπου στην επιληψία. Η χαμηλότερη έκφραση του mRNA για τις α4, β3 και δ υπομονάδες του GABAA υποδοχέα στην περιοχή της οδοντωτής έλικας του κροταφικού ιπποκάμπο υποδεικνύει ότι η έκφραση του α4β3δ υποτύπου είναι μικρότερη στον κροταφικό σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Καθώς έχει δειχθεί ότι ο α4β3δ υπότυπος παίζει σημαντικό ρόλο στην τονική αναστολή στα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας, τα παραπάνω αποτέλεσμα μας πιθανώς σημαίνει ότι η τονική αναστολή είναι διαφορετική στους δυο πόλους του ιππόκαμπου. Η αύξηση της έκφρασης του mRNA της α5 υπομονάδας στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιπποκάμπου μπορεί να επηρεάζει την ικανότητα για συναπτική βραχυ- και μακρο-χρόνια πλαστικότητα η οποία έχει βρεθεί να είναι διαφορετική μεταξύ του κροταφικού και του διαφραγματικού ιπποκάμπου καθώς έχει δειχθεί ότι οι α5-υπότυποι παίζουν ρόλο σε διαδικασίες μνήμης και μάθησης. Επίσης, οι α5-υπότυποι του GABAA υποδοχέα στην CA1 περιοχή του ιππόκαμπου συμμετέχουν στην τονική αναστολή. Τα υψηλότερα επίπεδα στην έκφραση του mRNA για την α5 υπομονάδα στον κροταφικό ιππόκαμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο πιθανώς υποδεικνύουν ότι η τονική αναστολή είναι διαφορετική στην CA1 περιοχή των δυο πόλων του ιππόκαμπου. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής μελετήσαμε την πιθανή συσχέτιση του GABAεργικού συστήματος με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων η οποία έχει παρατηρηθεί, σε κανονικές "in vitro" συνθήκες, μόνο σε τομές του κροταφικού ιππόκαμπου. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε αναλυτική μελέτη της έκφρασης του mRNA των υπομονάδων (α1, α2, α5, β1, β2, β3, γ2) του GABAΑ υποδοχέα σε διάφορα χρονικά διαστήματα κατά την κανονική "in vitro" διατήρηση των τομών (15min, 1, 3, 5 και 8h). Αρχικά μελετήσαμε την έκφραση των πρώιμων γονιδίων (c-fos, zif-268), που είναι δείκτες της νευρωνικής ενεργότητας, μετά από 5 ώρες κανονικής "in vitro" διατήρησης των τομών με σκοπό τη πιθανή συχέτιση της έκφρασης τους με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν και στους δυο πόλους του ιπποκάμπου παρόμοια αύξηση της έκφρασης του mRNA τόσο για το c-fos όσο και για zif-268 γεγονός που υποδηλώνει ότι γονιδιακή ενεργότητα είναι παρόμοια και όσο αφορά τα συγκεκριμένα πρώιμα γονίδια ανεξάρτητη της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων. Στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιππόκαμπου παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της έκφρασης του mRNA των α1, β2 και γ2 υπομονάδων του GABAΑ υποδοχέα η οποία ξεκινάει την 1η ώρα, δηλαδή πριν την οργανωμένη εμφάνιση της αυθόρμητης δραστηριότητας, γίνεται μέγιστη στις 4 ώρες παραμονής των τομών σε Τεχνητό Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΤΕΝΥ) και συμβαδίζει χρονικά με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές σε τομές που προέρχονται από τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Έχει δειχθεί ότι οι α1-υπότυποι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανασταλτική ικανότητα του υποδοχέα. Επίσης η παρουσία της β2 υπομονάδας στον δίαυλο χαρακτηρίζει μεγαλύτερα σε πλάτος και διάρκεια ανασταλτικά ρεύματα συγκρινόμενη με τις β1 υπομονάδες. Φαίνεται λοιπόν ότι ο υπότυπος α1β2γ2, του οποίου η έκφραση αυξάνει πριν την έναρξη της οργανωμένης ρυθμικής δραστηριότητας, λόγω της συγκρότησης του από τις συγκεκριμένες υπομονάδες, έχει μεγάλη ανασταλτική αποτελεσματικότητα η οποία μπορεί να συμμετέχει στην ανάπτυξη των "in vitro" οξέων κυμάτων. Η δέσμευση της [3H]–muscimol αυξάνει σε τομές που προέρχονται μόνο από τον κροταφικό ιππόκαμπο και έχουν παραμείνει σε κανονικές "in vitro" συνθήκες για 8 ώρες σε σύγκριση με αντίστοιχες τομές που προέρχονται αμέσως μετά την θανάτωση του ζώου. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην δέσμευση της [3H]–muscimol σε τομές που προέρχονται από τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Η αύξηση της δέσμευσης της [3H]–muscimol μόνο στις τομές που προέρχονται από τον κροταφικό ιππόκαμπο είναι σε συμφωνία με την αύξηση της έκφρασης του α1β2γ2-υποτύπου καθώς έχει δειχθεί ότι η θέση δέσμευσης της muscimol στο δίαυλο του GABAA υποδοχέα είναι μεταξύ των α1 και β2 υπομονάδων. Συμπερασματικά, η εκλεκτική αύξηση της έκφρασης του α1β2γ2-υπότυπου μόνο στην CA1 περιοχή του κροταφικού δηλώνει μεγαλύτερη ανασταλτική αποτελεσματικότητα των GABAA υποδοχέων, δεδομένου ότι ο α1β2γ2-υπότυπος προκαλεί μεγαλύτερα ανασταλτικά μετασυναπτικά ρεύματα. Το παραπάνω μπορεί να σχετίζεται με την "in vitro" εμφάνιση των οξέων κυμάτων καθώς η αυθόρμητη δραστηριότητα προέρχεται από GABAA-επαγόμενες υπερπολώσεις των πυραμιδικών κυττάρων, ενώ και η αύξηση στην έκφραση του α1β2γ2-υποτύπου συμπίπτει χρονικά με την εμφάνιση των "in vitro" οξέων κυμάτων. / The hippocampus in the rat appears grossly as an elongated structure with its long axis bending in a C-shaped manner from the septal nuclei rostrodorsally to the incipient temporal lobe caudoventrally. The long axis of the hippocampal formation is referred as the dorsoventral axis. Although hippocampus has been traditionally thought as a homogeneous structure, several studies have been demonstrated differences at several organization levels (from the behavioural to the cellular) between its dorsal (DH) and ventral (VH) pole. In the present study, we examined whether the recently reported differences in the GABA-mediated somatic inhibition between the DH and VH could be related to variations in the GABAA receptors. We therefore studied the quantitative distribution, the kinetic parameters and the subunit composition of the GABAA receptors in the two parts of hippocampus. We also studied the A1 adenosine receptors in order to examine the involvement of the adenosinergic system in the glutamate release between the two hippocampal poles. The study of [3H]-CHA binding on A1 adenosine receptors by using "in vitro" quantitative autoradiography, revealed a weaker A1 receptor binding in VH compared to DH in all regions we examined. Taken into consideration that the A1 adenosine receptors are localized in the CA1 glutamatergic terminals, these results may to some extend explain our hypothesis that synapses in the VH have greater probability of glutamate release compared to those in the DH counterpart. Recent data have demonstrated a weaker somatic GABAergic inhibition in CA1 region of VH compared to DH. We therefore examined possible differences in the GABAA receptor subunit composition and receptor binding parameters between DH and VH by using "in situ" hybridization, western blotting and the specific binding of the GABAA receptor agonist [3H]-muscimol using quantitative autoradiography and saturation experiments. The experiments demonstrated that the VH compared to DH displayed: 1) lower levels of mRNA expression for α1, β2, γ2 but higher levels for α2 and β1 subunits in CA1, CA2 and CA3, with the differences being more pronounced in CA1 region. Western blot analysis confirmed the mRNA expression data, showing lower levels for α1, β2 and higher levels for α2 subunits’ protein. Only in the CA1 region the mRNA levels of α5 were higher, while those of α4 subunit were slightly lower; in dentate gyrus, the mRNA levels of α4, β3 and δ subunits were significantly lower in VH compared to DH presumably suggesting a lower expression of the α4/β3/δ receptor subtype; 2) lower levels of [3H]-muscimol binding in the VH, with the lowest value observed in CA1, apparently resulting from weaker affinity for GABA and not from a decreased receptor density, since the KD values were higher in VH, while the Bmax values were similar between DH and VH. In conclusion, the differences in the subunit mRNA and protein expression and the lower affinity of GABAA receptor observed predominantly in CA1 region of VH, suggest that the α1 subunit-containing GABAA receptors dominate in the DH, while the α2 subunit-containing receptors prevail in VH. This could underlie the lower GABAA mediated somatic inhibition observed in VH and, to some extent, explain: a) the higher liability of VH for epileptic activity and b) the differential involvement of DH and VH in cognitive and emotional processes. Recent electrophysiological experiments have been shown that slices from the VH of adult rats generate rhythmical activity during their maintenance in the recording chamber. This activity is fully organized during the first 3 hours of in vitro maintenance and resembles the in vivo recorded hippocampal "sharp waves", therefore called "in vitro sharp waves". The field manifestation of this spontaneous activity results from GABAA receptor-mediated hyperpolarizations in pyramidal cells. The aim of the second part of the present thesis focused on the possible relationship between the characteristics of GABAA receptors and the development of "in vitro sharp waves". Using the "in situ hybridisation" technique, we examined the mRNA expression of the alpha1/2/5,beta1/2/3 and gamma2 subunits of GABAA receptor and the binding of GABAA receptor agonist [3H]-muscimol in a time course including periods before and during the development of the "in vitro sharp waves". Six sets of transversely cut DH and VH slices were prepared: slices frozen immediately after killing the animal (naive slices), and slices maintained in vitro and frozen at different time points (15min, 1, 3, 5 and 8h) during the electrophysiological experiment. The results showed: A) Upregulation of alpha1, beta2 and gamma2 subunits mRNA in VH but not in DH slices at 1h of their maintenance, which became significant at 3h as compared to the respective naive slices; B) Increase in [3H]-muscimol binding only in VH slices, obtained at 8h compared to the respective naive ones. The upregulation of the α1β2γ2 GABAA receptor subtype (starting at 1h) in VH but not in DH presumably suggests an increase in GABAergic activity, which could be related with the appearance of "in vitro sharp waves" observed only in VH; C) Τhe similar mRNA expression of the early genes c-fos and zif-268 in the two hippocampal poles showing a comparable general gene activity in DH and VH. In conclusion, the α1β2γ2 subtype dominates in DH while the α2β2-subtype prevails in VH and this could be related to the weaker somatic inhibition observed in the CA1 region of VH, and also to the distinct involvement of DH and VH in cognitive and emotional processes. Moreover, the higher expression of the GABAA receptor subtype α4β4δ in the DG of DH compared to VH may imply a higher tonic inhibition in the former hippocampal pole. The upregulation of the α1β2γ2- subtype only in VH slices during their in vitro maintenance may reflect an increase in the impact of GABAA receptor-mediated transmission, which is required for the organization of "in vitro" sharp waves.

Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000]. Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40. Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα. Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40. Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA. Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο. Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000]. Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005]. Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes. Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus. In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below. DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies. RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions. Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme. Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.