Η πλειοτροπίνη είναι αυξητικός παράγοντας 18kDa ο οποίος παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη και εμφανίζει μεγάλη ομολογία με τη midkine, με την οποία σχηματίζουν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν υψηλή χημική συγγένεια με την ηπαρίνη. Η πλειοτροπίνη εκφράζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου έχοντας είτε επαγωγικό είτε ανασταλτικό ρόλο, με τα διάφορα τμήματα της να εμφανίζουν διακριτές δράσεις σε σχέση με το μητρικό μόριο. Στην παρούσα εργασία υποκλωνοποιήθηκε η κωδική περιοχή της πλειοτροπίνης αλλά και τμημάτων της σε φορείς έκφρασης. Έγινε μετασχηματισμός βακτηρίων με τους φορείς που κατασκευάστηκαν και βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες έκφρασης των πεπτιδίων. Έγινε απομόνωση των τμημάτων που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 9-59 (ΡΤΝ9-59) και 60-110 (ΡΤΝ60-110) με δυο διαφορετικά συστήματα και έγινε αξιολόγηση αυτών των συστημάτων ως προς την απόδοση και την καθαρότητα του προϊόντος. Η καθαρότητα των προϊόντων που προέκυψαν ήταν πολύ καλή, η απόδοση όμως ήταν χαμηλή σε όλες τις περιπτώσεις μικρότερη από 1 mg/ml. Λόγω της χαμηλής απόδοσης, οι ποσότητες των προϊόντων που προέκυψαν δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν σε μελέτες διαμόρφωσης, xρησιμοποιήθηκαν όμως σε βιολογικές μελέτες. Από τη μελέτη των τμημάτων ΡΤΝ9-59 και ΡΤΝ60-110 που απομονώθηκαν, καθώς και ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα της πλειοτροπίνης (ΡΤΝ111-136) προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: 1) Για την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην ανβ3 αλλά και στον RPTPβ/ζ δεν ευθύνονται οι δυο κεντρικές περιοχές της πλειοτροπίνης ΡΤΝ9-59 και ΡΤΝ60-110, 2) το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 έχει την ικανότητα να επάγει τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 της ιντεγκρίνης ανβ3 στη θέση Υ773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της κινάσης c-Src, δράση που χάνεται παρουσία ΡΡ1 ή μετά από αποσιώπηση της έκφρασης του RPTPβ/ζ, 3) το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί τις ERΚ1/2, επίσης μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της κινάσης c-Src. Το γεγονός ότι το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 ενεργοποιεί μόρια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται και από την πλειοτροπίνη, ενώ είναι γνωστό ότι αναστέλλει την επαγωγική της δράση στην αγγειογένεση in vivo και την κυτταρική μετανάστευση in vitro, καταδεικνύει ότι οι δράσεις της πλειοτροπίνης περιλαμβάνουν περισσότερους του ενός υποδοχείς ή/και συνυποδοχείς, η λεπτή ρύθμιση των οποίων οδηγεί στην τελική βιολογική της δράση, γεγονός που συνάδει με τις διαφορετικές δράσεις της πλειοτροπίνης που παρατηρούνται σε διαφορετικά συστήματα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την άποψη ότι το C-τελικό άκρο της πλειοτροπίνης παίζει σημαντικό ρόλο στις βιολογικές της δράσεις που σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη, ενώ παραμένει άγνωστος ο ρόλος των κεντρικών της περιοχών. / Pleiotrophin is 18kDa growth factor that shows high affinity to heparin. PTN is highly homologous to midkine (MK), forming together a family of growth factors. There has been found that pleiotrophin is expressed in different types of cancer. It is considered a tumour-promoting and angiogenic growth factor, although there are reports that show a negative effect of PTN on tumour growth and angiogenesis. Several data suggest that different regions of PTN may exert distinct, or even opposite effects on tumour growth and angiogenesis. In this study the coding area of pleiotrophin and regions of it were subcloned in expression vectors. Bacteria were transformed with the vectors and the conditions, where the maximum of the expression of the proteins was observed, were established. Regions of the native protein corresponding to aminoacids 9-59 (PTN9-59) and 60-110 (PTN 60-110) were isolated with two different ways and the results were compared for the quantity and the quality of the peptides. Because of the low quantity, the peptides could not be used for structural studies but they were used for biological studies. From the study of the peptides PTN9-59, PTN 60-110, and a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of pleiotrophin (PTN111-136) there have been emerged the following observations: 1) the two central regions of pleiotrophin seem not to have involvement to the binding of pleiotrophin to ανβ3 and to RPTPβ/ζ, 2) PTN111-136 induces the phosphorylation of β3 subunit at Y773 of the integrin via the activation of RPTPβ/ζ and c-Src kinase, something that is not observed in the presence of PP1 and siRPTPβ/ζ, 3) the peptide activates ERK1/2 via RPTPβ/ζ and c-Src kinase. The fact that the peptide PTN111-136 activates molecules of the signaling pathway of pleiotrophin and at the same time it is known that pauses the positive effect of the native protein to angiogenesis in vivo and the migration in vitro shows that reactions of pleiotrophin involve more than one of receptors or co-receptors and that the different regulation of which results in the different actions. Also the results strengthen the option that the C-terminal region of pleiotrophin has an important role in the biological activity which correlates with angiogenesis in cancer and the development of cancer although the role of the central regions of PTN is not known.

Τo Gene Expression Programming - GEP (Προγραμματισμός Γονιδιακής Έκφρασης - ΠΓΕ) είναι μια μέθοδος αυτόματης παραγωγής προγραμμάτων η οποία ανήκει στη γενική κατηγορία των Εξελικτικών Αλγορίθμων, εκείνων των τεχνικών δηλαδή που εμπνέονται από τις φυσικές διεργασίες της βιολογικής εξέλιξης. Συγκεκριμένα ο ΠΓΕ χρησιμοποιεί πληθυσμούς από άτομα, επιλέγει τα άτομα σύμφωνα με την καταλληλότητά τους (fitness) και εισάγει νέα σημεία (άτομα, πιθανές λύσεις) στον πληθυσμό χρησιμοποιώντας έναν ή περισσότερους γενετικούς τελεστές. Στόχος αυτής της Μεταπτυχιακής Διπλωματικής Εργασίας ήταν ο σχεδιασμός και η υλοποίηση ενός Ολοκληρωμένου Γραφικού Περιβάλλοντος για τον Προγραμματισμό Γονιδιακής Έκφρασης καθώς και η υλοποίηση ορισμένων καινοτομιών. Στα πλαίσια της διπλωματικής εργασίας, σχεδιάσθηκε και αναπτύχθηκε ένας καινοτόμος τελεστής για την μέθοδο του ΠΓΕ. Ο συγκεκριμένος τελεστής πραγματοποιεί μια τοπική αναζήτηση στις μεταβλητές που χρησιμοποιούνται στη μοντελοποίηση του εκάστοτε προβλήματος και επιλέγει εκείνες τις μεταβλητές για τις οποίες η απόδοση του αλγορίθμου βελτιστοποιείται. Η απόδοση του καινούργιου τελεστή ελέγχθηκε και πειραματικά. Μια επιπλέον καινοτομία που εφαρμόστηκε είναι η αυξομείωση του αριθμού των μεταλλάξεων. Συγκεκριμένα, επιλέγουμε να μειώνουμε τον αριθμό των μεταλλάξεων καθώς ο πληθυσμός εξελίσσεται, ενώ τον αυξάνουμε όταν έχουμε μικρή διαφορά ανάμεσα στη βέλτιστη και τη μέση απόδοση του πληθυσμού. Ο μεταβλητός αριθμός μεταλλάξεων σε συνδυασμό με την ικανότητα της μεθοδολογίας του ΠΓΕ να αποφεύγει τα τοπικά ακρότατα βελτιώνει σημαντικά την προσαρμοστικότητα του αλγορίθμου. Επιπλέον, για την αντιμετώπιση της αυξημένης υπολογιστικής πολυπλοκότητας που παρουσιάζει η μέθοδος, εισήχθη η έννοια του παραλληλισμού. Τέλος, η τροποποιημένη μέθοδος του ΠΓΕ εφαρμόστηκε σε πληθώρα προβλημάτων όπως η μοντελοποίηση συμπεριφοράς μιας χρονοσειράς μαγνητοεγκεφαλογραφήματος, η μοντελοποίηση της συμπεριφοράς κόπωσης υλικών, η πρόβλεψη ισοτιμίας δολαρίου – ευρώ, η πρόβλεψη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων και η πρόβλεψη του βαθμού υδατοκορεσμού ελαιοκαλλιεργειών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά. / Gene Expression Programming (GEP) is one method of automatic generation of programs that belongs to a wider class of Evolutionary Algorithms. Evolutionary Algorithms are inspired by biological mechanisms of evolution. Specifically, GEP uses populations of individuals, select the individuals according to their fitness, and introduce genetic variation using one or more genetic operators. The purpose of this Master's Thesis was to design and implement an Integrated Graphical Environment for Gene Expression Programming and the implementation of certain innovations. Ιn the context of this thesis an innovative operator was designed and developed for the GEP method. This particular operator is conducting a local search on the variables used in modeling of a problem and chooses those variables for which the performance of the algorithm is optimized. The performance of the new operator was experimentally tested. Another innovation implemented was the fluctuation in the number of mutations. Specifically, we choose to reduce the number of mutations as the population evolves, while we increase it when the performance of the best individual found is very close to the average performance of the population. The variable number of mutations in combination with the ability of the methodology of GEP to avoid local extrema significantly improves the adaptability of the algorithm. Moreover, in order to face the increased computational complexity of the method, we introduce parallelism. Finally, the modified method of GEP was applied to many problems such as modeling behavior of a MEG’s time series, modeling of fatigue behavior of materials, forecasting Euro - United States Dollar exchange rate, predicting protein interactions and predicting the degree of saturation of olive crops. The results are very encouraging.

H λοίμωξη που προκαλείται απο τον ιό της ηπατίτιδας C HCV είναι μείζον πρόβλημα για την δημόσια υγεία όπως επίσης και η κύρια αιτία της χρόνιας ηπατικής νόσου και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, με περίπου 180 εκατομμύρια μολυσμένα άτομα σε όλο τον κόσμο. Ο HCV είναι ένας RNA ιός θετικής πολικότητας που ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας των Flaviviridae. Έξι γονότυποι ( 1-6 ) είναι γνωστοί, καθένας από τους οποίους μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε αρκετές υποτύπους. Το γονιδίωμα του HCV αποτελείται από ένα μεγάλο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF), πλαισιωμένο από ιδιαίτερα δομημένες 5 'και 3' αμετάφραστες περιοχές (UTRs). Και οι δύο περιοχές UTRs είναι συντηρημένες και έχουν τον έλεγχο της ιογενούς μετάφρασης και αναπαραγωγής. Το 5' UTR του HCV περιέχει μια περιοχή IRES απο την οποία γινεται η έναρξη της cap ανεξάρτητης μετάφρασης του ιικού RNA. Η HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση του ORF παράγει μια ενιαία πρόδρομη πολυπρωτεΐνη που μεσω μετα-μεταφραστικής τροποποίησης από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες, οδηγεί στην ωρίμανση δομικών και μη δομικών πρωτεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικές κυτταρικές ή ιικές πρωτεΐνες μπορούν να ρυθμίσουν την ενεργότητα του HCV IRES. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η κατανόηση της ρύθμισης της HCV IRES εξαρτώμενης μετάφρασης. Πρώτον, προσπαθήσαμε να ορίσουμε το ρόλο των ιικών πρωτεϊνών στην HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση που παραμένει αμφιλεγόμενος. Σαφώς, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η HCV NS5A ρυθμίζει αρνητικά την ενεργότητα του IRES με κύτταρο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπρόσθετα, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η ενεργοποιημένη PKR ρυθμίζει θετικά την ενεργότητα του IRES ενώ η καταστολή της έκφρασης της ενδογενούς PKR έχει το αντίθετο αποτέλεσμα. Επιπλέον, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η NS5A μεσολαβεί ανασταλτικά στην IRES-εξαρτώμενη μετάφραση και συνδέεται με την αδρανοποίηση της PKR. Τέλος στην παρούσα εργασία ερευνήσαμε τη ρύθμιση της ενεργότητας του HCV IRES σε συνθήκες χαμηλού οξυγόνου, δεδομένου ότι υποξικές περιοχές εντοπίζονται στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο (HCC) και συνδέονται με την ύπαρξη ενός εναλλακτικού προφίλ κυτταρικής μετάφρασης Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η HCV IRES-εξαρτώμενη μετάφραση ρυθμίζεται αρνητικά σε υποξικές συνθήκες και μάλιστα με κύτταρο-εξαρτώμενο τρόπο. / HCV infection is a major public health problem and a leading cause of chronic liver disease and hepatocellular carcinoma, with approximately 180 million infected individuals worldwide. HCV is a positive sense RNA virus that belongs to the genus hepacivirus of the Flaviviridae family. Six major HCV genotypes (1–6) are known, each of which can be further subdivided into several subtypes (1a, 1b, 2a, etc). The HCV genome consists of a large open reading frame (ORF), flanked by highly structured 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs). Both UTRs are conserved and control viral translation and replication. The HCV 5'-UTR contains an IRES that initiates cap-independent translation of the viral RNA. IRES-mediated translation of the HCV ORF yields a single polyprotein precursor that is co- and post-translationally processed by cellular and viral proteases, giving rise to mature structural and non structural proteins. Several studies have suggested that different cellular non canonical proteins or viral proteins can regulate the HCV IRES activity. The aim of this study was to understand the regulation of the HCV IRES dependent translation. Firstly, we tried to delineate the role of the viral proteins on HCV IRES dependent translation that still remains controversial. Clearly our studies demonstrated that HCV NS5A down-regulates IRES activity in a cell-type dependent manner. Additionally, we provide strong evidence that activated PKR up-regulates the IRES activity while silencing of endogenous PKR had the opposite effect. In addition, we concluded that the NS5A-mediated inhibitory effect on IRES-dependent translation was linked with the PKR inactivation. Moreover, as it is already reported that localised hypoxic areas are continuously present in HCC due to its high proliferation rate leading to an altered translation pattern, we investigated modulation of HCV IRES activity under low oxygen settings. Our results provided preliminary evidence that HCV-IRES-dependent translation is negatively regulated by low oxygen levels or under hypoxia-mimicking conditions in cell-specific manner.

Η RNase P είναι το ένζυμο που ωριμάζει το 5΄ άκρο των πρόδρομων μορίων tRNA, ενώ έχει βρεθεί και στις τρεις φυλογενετικές περιοχές, καθώς και σε υποκυτταρικά οργανίδια. Είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικής φύσεως στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ έχουν βρεθεί και ένζυμα RNase P αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η υπομονάδα RNA των βακτηριακών ολοενζύμων είναι καταλυτικά ενεργή απουσία πρωτεϊνικών παραγόντων in vitro, καθιστώντας την ένα πραγματικό ριβοένζυμο. Η ικανότητα της RNase P να αναγνωρίζει συγκεκριμένες δομές στα μόρια των υποστρωμάτων της και όχι αλληλουχίες, δημιούργησε τη δυνατότητα χρήσης αυτού του ενζύμου ως ενός μοριακού εργαλείου για τη στόχευση πολλών ιικών και παθολογικών μορίων RNA in vitro και in vivo, καταστέλλοντας την έκφραση των μορίων αυτών, μέσω της τεχνολογίας των μορίων EGS (external guide sequence) και των ριβοενζύμων M1GS. Η RNase P, σύμφωνα με πολλές μελέτες, έχει δειχθεί ότι αποτελεί στόχο πολλών φαρμακευτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων πολλών γνωστών αντιβιοτικών, οι οποίοι κατά κύριο λόγο αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Πρόσφατα δείχτηκε, μέσω αναλυτικής κινητικής μελέτης, ότι ένα μακρολίδιο, η σπιραμυκίνη, ενεργοποιεί σημαντικά τη δραστικότητα της βακτηριακής RNase P και του M1 RNA κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, λειτουργώντας έτσι ως μη-ειδικός ενεργοποιητής μικτού τύπου. Μέχρι σήμερα, στη διεθνή βιβλιογραφία, δεν έχει αναφερθεί άλλη ουσία η οποία προκαλεί θετική επίδραση στη δραστικότητα της RNase P. Στην παρούσα μελέτη, αρχικά μελετήθηκε η ενεργοποίηση της δραστικότητας της βακτηριακής RNase P και αποκαλύφθηκε ότι η σπιραμυκίνη δεν αλληλεπιδρά με ιοντικούς δεσμούς με το μόριο Μ1 RNA, αλλά προκαλεί αλλαγή διαμόρφωσης στο δομικό στοιχείο P10/11 του ριβοενζύμου. Το δομικό αυτό στοιχείο εμπλέκεται στην αναγνώριση του υποστρώματος, αποτέλεσμα το οποίο έρχεται σε συμφωνία με τις τιμές KD που προσδιορίστηκαν για το σύμπλοκο ριβοενζύμου–υποστρώματος, απουσία και παρουσία σπιραμυκίνης. Με δεδομένο ότι η σπιραμυκίνη δεν επηρεάζει την πρωτεϊνοσύνθεση ή τη δραστικότητα της RNase P των ευκαρυωτικών κυττάρων, κατασκευάστηκε ένα ριβοένζυμο M1GS, ώστε να ελεγχθεί η επίδραση του αντιβιοτικού στη δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, σε καλλιεργούμενα ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293. Ως στόχος του συγκεκριμένου M1GS, επιλέχτηκε ο μεταγραφικός παράγοντας Ets2 λόγω της μεγάλης κλινικής σημασίας του, εφόσον έχει συσχετιστεί με αρκετούς τύπους καρκίνου και παθολογικές καταστάσεις, καθώς και με διαδικασίες διαφοροποίησης. Ο σπουδαίος ρόλος του Ets2, σε συνδυασμό με τα ελλιπή δεδομένα σχετικά με την έκφρασή του, είχαν αποτρέψει μέχρι σήμερα την αποτελεσματική στόχευσή του με τη χρήση των υπαρχουσών μεθοδολογιών που βασίζονται στο RNA, όπως το RNAi. Μετά από ανάλυση της δευτεροταγούς δομής του Ets2 mRNA, σχεδιάστηκαν δύο οδηγοί αλληλουχίες. Οι αλληλουχίες αυτές, αρχικά, δοκιμάστηκαν ως εξωτερικές οδηγοί αλληλουχίες (EGS) σε συνδυασμό με το βακτηριακό ολοένζυμο της RNase P. Η EGS303 (το νούμερο υποδεικνύει το νουκλεοτιδικό κατάλοιπο του στόχου που δρα η RNase P), εμφάνισε τη μεγαλύτερη ικανότητα να επάγει τη δράση της RNase P in vitro. Η οδηγός αυτή αλληλουχία, στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στο 3΄ άκρο του M1 RNA, παράγοντας το ριβοένζυμο M1GS303, το οποίο είναι δραστικό έναντι του μορίου–στόχου του in vitro. Η δραστικότητα του συγκεκριμένου ριβοενζύμου ενεργοποιείται εντυπωσιακά κατά 160% παρουσία σπιραμυκίνης. Προκειμένου να ελεγχθεί η δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, το μόριο–στόχος και το ριβοένζυμο εκφράστηκαν ελεγχόμενα σε κύτταρα E. coli, προκαλώντας μείωση της έκφρασης του μορίου–στόχου από το M1GS303 κατά 95% μετά από 12 ώρες έκφρασης των μορίων. Μείωση στα ίδια επίπεδα ανιχνεύτηκε μόλις μετά από 4 ώρες έκφρασης εφόσον στα κύτταρα είχε προστεθεί σπιραμυκίνη, γεγονός που υποστηρίζει την εντυπωσιακά θετική επίδραση της σπιραμυκίνης επί της δραστικότητας του ριβοενζύμου. Η ίδια σειρά πειραμάτων επαναλήφθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα, με έκφραση του ριβοενζύμου σε HEK293 κύτταρα. Η δραστικότητα του ριβοενζύμου προσδιορίστηκε ποιοτικά και ποσοτικά, από την έκφραση της χιμαιρικής φθορίζουσας πρωτεΐνης Ets2–EGFP (μόριο–στόχος), σε διαφορετικούς χρόνους έκφρασης. Παρατηρήθηκε ότι το M1GS δρα αποτελεσματικά έναντι του μορίου–στόχου του και σε ευκαρυωτικά κύτταρα in vivo, προκαλώντας μείωση στην έκφραση του Ets2, η οποία αυξάνεται επιπλέον παρουσία σπιραμυκίνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν τη σημαντική ενεργοποίηση της δραστικότητας του M1GS σε ανθρώπινα κύτταρα και καθιστούν τη σπιραμυκίνη ένα σημαντικό ενεργοποιητή στη χρήση των ριβοενζύμων M1GS ως εργαλεία γονιδιακής αποσιώπησης. Ο συνδυασμός βελτιωμένων ριβοενζύμων M1GS με την παρουσία σπιραμυκίνης αυξάνει ακόμα περισσότερο την πρακτική χρήση της συγκεκριμένης τεχνολογίας τόσο in vitro όσο και in vivo, επιτυγχάνοντας ακόμα πιο αποτελεσματική αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης. / RNase P is the enzyme that endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. It has been found in all three phylogenetic domains of life, as well as in subcellular organelles. In most cases, it has been described as a ribonucleoprotein complex. However, few RNase P enzymes that are exclusively proteinaceous have been also reported recentrly. The RNA subunit of bacterial holoenzyme is catalytically active in the absence of protein factors in vitro, making it a true ribozyme. The ability of RNase P to recognize specific structures in its substrate molecules instead of specific sequences, allowed the use of this enzyme as a molecular tool for targeting pathological and viral RNA molecules in vitro and in vivo, by suppressing gene expression through the technology of EGS (external guide sequence) and M1GS ribozymes. RNase P, according to numerous studies, has been the target of several pharmaceutical agents, including most of the mainstream antibiotics. It has been shown recently, through analytical kinetic studies that the macrolide spiramycin significantly enhances the activity of bacterial RNase P and M1 in a dose dependent manner, acting as a non-specific mixed-type activator. Until now, no other compound has been reported to induce a positive effect on RNase P activity. In the present study, the enhancement of bacterial RNase P activity by spiramycin was tested initially, and it was revealed that spiramycin does not interact with the M1 RNA molecule through ionic bonds. On the contrary, it induces a conformational change of the P10/11 structural element of M1 RNA, which is mainly responsible for substrate recognition. The above results are in agreement with the KD values determined for the ribozyme-substrate complex, in the absence or in the presence of spiramycin. Since spiramycin does not affect eucaryotic protein synthesis or eucaryotic RNase P activity, an M1GS ribozyme was constructed, in order to examine the effect of spiramycin on the ribozyme activity in vivo, using human HEK293 cells. The target of this M1GS was the transcription factor Ets2, a factor with great clinical importance, since it has been associated with several types of cancer and disease, as well as essential processes during differentiation. The important role of Ets2 in combination with the lack of data on Ets2 expression, had hitherto prevented its effective targeting by using the existing methodologies based on RNA, such as RNAi. After analysis of the secondary structure of Ets2 mRNA, two guide sequences were designed. These sequences were originally tested in trans as external guide sequences (EGS), in combination with the bacterial RNase P. The EGS303 (the number indicates the nucleotide residue cleaved by RNase P), showed an ability to induce RNase P activity in vitro. The guide sequence was then cloned and fused into the 3' end of M1 RNA ribozyme, thus producing the M1GS303 ribozyme, which was found to be effective against the target molecule. The activity of this specific ribozyme is impressively enhanced by 160% in the presence of spiramycin. In order to examine the activity of this ribozyme in vivo, the expression of the target molecule and the ribozyme were induced in E. coli cells. After 12 hours of expression, a reduced level of the target molecule was detected, because of the M1GS303 activity (about 95%). Reduction to similar levels was observed after only 4 hours from the induction of both molecules expression, in the presence of spiramycin. This observation strongly supports spiramycin’s striking positive effect on the ribozyme activity. The same set of experiments was repeated in human HEK293 cells. The activity of the ribozyme was determined qualitatively and quantitatively, by the determination of the expression of the chimeric fluorescent protein Ets2-EGFP (target molecule) at different times of expression. The M1GS ribozyme cleaves efficiently the target molecule in human cells as well in vivo, resulting in a reduction in the expression of Ets2, which is further increased in the presence of spiramycin. This result indicates the significant activation of M1GS activity in human cells, making spiramycin an important activator in using M1GS ribozymes as tools in gene silencing. The combination of improved M1GS ribozymes in the presence of spiramycin, further increases the practical utilization of this technology both in vitro and in vivo, thus achieving an even more effective suppression in gene expression.

Τα τελευταία χρόνια κυριαρχεί στο χώρο της γενωμικής έρευνας η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών, η οποία επέτρεψε την ποσοτική μέτρηση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα. Παρόλο που τα δεδομένα έκφρασης των γονιδίων μπορεί να εμπεριέχουν θόρυβο και να μην είναι πλήρως αντικειμενικά, εντούτοις περιγράφουν την έκφραση όλου του γονιδιώματος ενός οργανισμού, κάτι το οποίο δεν ήταν εφικτό τις προηγούμενες δεκαετίες. Επίσης ένα άλλο είδος δεδομένων που συνέβαλλε δραστικά στην κατανόηση των δυναμικών διεργασιών του κυττάρου ήταν τα δεδομένα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (πρωτεΐνη-πρωτεΐνη). Μεγάλης κλίμακας τεχνικές όπως το διυβριδικό σύστημα του σακχαρομύκητα και η φασματομετρία μάζας καθαρισμένων πρωτεϊνικών συμπλόκων παρήγαγαν μεγάλη ποσότητα πληροφορίας για τις σχέσεις μεταξύ των γονιδιακών προϊόντων. Επίσης και αυτό το είδος δεδομένων χαρακτηρίζεται από πολλές αναληθείς αλληλεπιδράσεις και στην εργασία αυτή χρησιμοποιούνται οι πιο έγκυρες από αυτές. Ταυτόχρονα ξεκίνησε μια προσπάθεια να περιγραφούν οι δυναμικές διεργασίες του κυττάρου μέσα από βιολογικά δίκτυα π.χ. γονιδιακά, πρωτεϊνικά, μεταβολικά κτλ. Ακόμα μεγαλύτερη πρόκληση είναι η εύρεση υποδικτύων με βιολογικά διακριτό ρόλο, τα οποία ονομάζονται λειτουργικές υπο-δομές. Η ανίχνευση τέτοιων υπο-δομών θα συντελέσει στην κατανόηση των σχέσεων μεταξύ των γονιδίων ή των προϊόντων τους αλλά και στην επισήμανση γονιδίων ή πρωτεϊνών που δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόμα. Στην εργασία αυτή τέλος περιγράφονται τρόποι ομαδοποίησης των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης, αναλύονται διεξοδικά τα δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών και παρουσιάζονται τρόποι ομαδοποίησης αυτών. Επίσης προτείνεται ενοποίηση των παραπάνω δεδομένων στον οργανισμό Saccharomyces cerevisiae με σκοπό την ανίχνευση λειτουργικών υπο-δομών στον πρωτεϊνικό του γράφο. Επιπρόσθετα, η ανίχνευση αυτών των υπο-δομών υλοποιήθηκε με έναν νέο αλγόριθμο, τον Detect Module from Seed Protein (DMSP), ο οποίος δεν διαμερίζει το γράφο σε ομάδες όπως οι κλασικοί τρόποι ομαδοποίησης αλλά χτίζει υπο-δομές ξεκινώντας από μια πρωτεΐνη-«σπόρο». / -

The process of embryogenesis is governed by the expressions of groups of genes which are acting in a coordinate way. Uncovering how the expressions of these genes control the development of a multicellular organism is fundamental for developmental biology. Gene expression atlases could capture quantitative spatio-temporal information of all genes expressed in a developing embryo. In other words, they could reveal the underlying genetic activity during the embryogenetic processes by providing information about, apart from how much and which, where and when the genes are expressed at cellular level and the interactions between them. The extraction of relative gene expression data and their simultaneous study in animal models, such as zebrafish, would be greatly facilitated by the existence of such atlases. This Master Thesis focuses on the early zebrafish embryogenesis and its goal is to design and implement an image processing framework that will provide the means to gather the expression patterns of different genes from different embryos at a given developmental stage into a common template. The framework should work with image-based data from different embryos, each fluorescently stained to label nuclear DNA and the expression patterns of a reference gene and another gene of interest. The volumetric data from each fluorescent label are contained in different channels. Therefore the crux of the framework lies in its ability to combine appropriately the information from the different channels and deal with a three-dimensional image registration problem. The implemented framework works with datasets of two embryos, one that serves as a template and depicts a whole embryo and another that has to be aligned with the first and depicts part of the other embryo. It is composed of different steps, responsible for preprocessing the channels, coarsely positioning the partial embryo view in the three dimensional template’s space and determining the geometrical transformation that finally aligns it with the template using as reference the gene expression pattern common to all labelled embryos. The resulting transformation is used to map the second expression patterns, thus producing their spatial expression atlas. The algorithm developed is based on the Insight Segmentation and Registration Toolkit. The framework was evaluated with data from six embryos at the same developmental stage and four different registration methods were compared in terms of performance. Visual inspection of the results identified the combination of the correlation coefficient, as a similarity measure function between two images, with the gradient descent optimization algorithm as the most appropriate method for this specific application. The final results obtained showed that the framework achieves its goal of integrating several gene expression patterns into a common template. This framework is ready to be used in order to construct a gene expression atlas integrating a large number of gene expression data of the zebrafish embryogenesis. In the near future, this atlas should be validated with known genetic interactions and used to unravel new ones, so that gene regulatory network models can become a reality. / Η διαδικαςία ανάπτυξης των εμβρύων καθορίζεται από τις συγχρονισμένες εκφράσεις ορισμένων γονιδίων. Το πώς αυτές ελέγχουν την δημιουργία ενός πολυκύτταρου οργανισμού από ένα κύτταρο αποτελεί αντικείμενο μελέτης της Αναπτυξιακής Βιολογίας. Ένας χάρτης γονιδιακής έκφρασης θα μπορούσε να συνδυάζει χρονικές, χωρικές και ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με την έκφραση των γονιδίων που ενορχηστρώνουν την διαδικασία ανάπτυξης ενός εμβρύου. Σε έναν τέτοιον χάρτη η γενετική δραστηριότητα θα αναλυόταν σε συνιστώσες που αφορούν το ποια, πότε, πού και πόσο εκφράζονται τα γονίδια σε κυτταρικό επίπεδο. Η ύπαρξη τέτοιων χαρτών για οργανισμούς, όπως το ζεβρόψαρο, που πρωταγωνιστεί σε μελέτες που αφορούν σπονδυλωτά, θα διευκολύνει την ταυτόχρονη μελέτη των εκφράσεων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων. Η παρούσα διπλωματική εστιάζεται στον σχεδιασμό και στην υλοποίηση μιας διαδικασίας επεξεργασίας εικόνας που θα είναι ικανή να συγκεντρώσει τις γονιδιακές εκφράσεις ενός συγκεκριμένου σταδίου ανάπτυξης του ζεβρόψαρου σε έναν τρισδιάστατο άτλαντα. Τα δεδομένα που πρέπει να επεξεργαστεί είναι τρισδιάστατες απεικονίσεις διαφορετικών εμβρύων, κάθε ένα από τα οποία έχει σημανθεί με φθορίζουσες ουσίες με στόχους το DNA των πυρήνων και τις εκφράσεις δύο γονιδίων, εκ των οποίων η μία είναι κοινή για όλα τα έμβρυα. Η πληροφορία που αποκαλύπτει κάθε ουσία βρίσκεται σε διαφορετικό κανάλι της κάθε εικόνας. Συνεπώς η διαδικασία θα πρέπει να συνδυάζει κατάλληλα τις πληροφορίες των διαφορετικών καναλιών και να ευθυγραμμίζει τρισδιάστατες εικόνες. Η υλοποιημένη διαδικασία δέχεται σειρές δεδομένων από δύο έμβρυα. Η μία απεικονίζει πλήρως ένα έμβρυο, το οποίο αποτελεί το έμβρυο αναφοράς και η άλλη μέρος του άλλου εμβρύου, το οποίο κα πρέπει να ευθυγραμμιστεί με το πρώτο. Η διαδικασία αποτελείται από διάφορα βήματα, τα οποία προεπεξεργάζονται τα δεδομένα, μετασχηματίζουν την εικόνα του μερικώς απεικονιζόμενου εμβρύου ώστε να αποκτήσει μια κατάλληλη αρχική θέση στον χώρο που ορίζεται από την εικόνα του ολόκληρου εμβρύου και τέλος ευθυγραμμίζουν την πρώτη εικόνα στην δεύτερη χρησιμοποιώντας ως αναφορά τη γονιδιακή έκφραση που είναι κοινή για όλα τα σημασμένα έμβρυα. Οι παράμετροι που προκύπτουν από την ευθυγράμμιση χρησιμοποιούνται για την αντιστοίχιση των άλλων σημασμένων γονιδιακών εκφράσεων, δημιουργώντας έτσι ένα τρισδιάστατο χάρτη εκφράσεων. Η υλοποίηση βασίστηκε στο Insight Segmentation and Registration Toolkit. Η διαδικασία δοκιμάστηκε με δεδομένα από έξι έμβρυα του ίδιου σταδίου ανάπτυξης και συγκρίθηκαν οι επιδόσεις τεσσάρων μεθόδων αντιστοίχισης. Οπτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων ανέδειξε τον συνδυασμό της συνάρτησης του συντελεστή συσχέτισης με τον αλγόριθμο βελτιστοποίησης gradient descent ως την πιο κατάλληλη μέθοδο για την συγκεκριμένη εφαρμογή. Τα τελικά αποτελέσματα απέδειξαν ότι η διαδικασία επιτυγχάνει τον στόχο της. Η διαδικασία που υλοποιήθηκε στην παρούσα διπλωματική είναι έτοιμη προς χρήση για την δημιουργία ενός χάρτη γονιδιακής έκφρασης του ζεβρόψαρου. Αντικείμενο μελλοντικής μελέτης αποτελεί η επικύρωση του χάρτη με ήδη γνωστές γονιδιακές αλληλεπιδράσεις και κατόπιν η χρήση του για την εύρεση νέων.