Η αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού ουβικιτίνης-πρωτεοσώματος αποτελεί βασική διαδικασία που εξυπηρετεί σημαντικές ομοιοστατικές λειτουργίες του κυττάρου. Η ουβικιτίνη δεσμεύεται ομοιοπολικά στις πρωτεΐνες-στόχους μέσω ενός καταρράκτη ενζυμικών αντιδράσεων, στον οποίο καθοριστικό ρόλο παίζουν τα Ε3 ένζυμα, οι Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης. Η πρωτεΐνη Arkadia είναι μια Ε3 λιγάση με έναν χαρακτηριστικό RING τομέα 69 αμινοξικών καταλοίπων στο C-τελικό άκρο της, μέσω του οποίου ασκεί την δράση της. Εμπλέκεται στο TGF-β σηματοδοτικό μονοπάτι το οποίο ρυθμίζει θετικά, ουβικιτινιλιώνοντας και στοχεύοντας για αποικοδόμηση πρωτεΐνες που αποτελούν αρνητικούς ρυθμιστές του. Κύριο χαρακτηριστικό του RING τομέα της Arkadia, ο οποίος έχει μελετηθεί και χαρακτηριστεί δομικά μέσω πολυπυρηνικής και πολυδιάστατης NMR φασματοσκοπίας, είναι η δέσμευση δύο ιόντων Zn2+ με χαρακτηριστικό διασταυρώμενο τρόπο (cross brace). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο του Zn στην δομή και κατ’επέκταση στην δραστικότητα των RING τομέων, πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις σε δύο αμινοξέα που συμμετέχουν στα μοτίβα δέσμευσης των δύο ιόντων Zn2+, οι H962C και H965C. Το μετάλλαγμα της H962C, στο οποίο εστιάζει η παρούσα εργασία, παρήχθη με βάση τις κλασσικές τεχνικές κλωνοποίησης DNA. Κατάλληλα δείγματα πρωτεΐνης εμπλουτισμένα σε πυρήνες ενεργούς στην φασματοσκοπία NMR, 15N και 13C, προετοιμάστηκαν ώστε να διεξαχθούν τα απαραίτητα πειράματα για τον προσδιορισμό της δομής. Το σύνολο των NMR φασμάτων απέδειξε ότι πρόκειται για ένα καλά δομημένο και σταθερό πολυπεπτίδιο. Τα δεδομένα από τις μετρήσεις ατομικής απορρόφησης και την επεξεργασία των φασμάτων επιβεβαίωσαν την διατήρηση της δέσμευσης δύο ιόντων Zn2+ ανά πολυπεπτίδιο, όπως στον RING τομέα του φυσικού τύπου της Arkadia. Ταυτόχρονα, πραγματοποιούνται περαιτέρω NMR μελέτες και αναλύσεις των φασμάτων με χρήση των κατάλληλων υπολογιστικών προγραμμάτων για την διερεύνηση της δομής και ικανότητας αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο. / The degradation of the intracellular proteins through the ubiquitin-proteasome pathway is a crucial procedure that serves the cellular homeostasis. Ubiquitin is covalently attached to the target proteins through an enzymatic cascade, in which the E3 enzymes (E3 ubiquitin ligases) play a determinant role. Arkadia is an E3 ubiquitin ligase containing a characteristic RING domain in its C-terminus, comprised of 69 amino acids, which is responsible for its function. It is involved in TFG-β signaling pathway, where it ubiquitinates and subsequently leads negative regulators to proteasomal degradation. The most important characteristic of Arkadia’s RING domain, which has been studied and structurally characterized through multinuclear and multidimensional NMR spectroscopy, is that it bounds to zinc ions in a cross-brace manner. As the role of the zinc binding is critical for the structure and subsequently the activity of RING domains, His962 and His965, which participate in the zinc binding motifs, were mutated to cysteines. The Arkadia H962C mutant, on which the present work is focused, was produced through the classical techniques of DNA cloning. Protein samples were uniformly labeled in 15N and 13C nuclei in order for all the necessary NMR experiments to be carried out. The total of the NMR spectra demonstrated that Arkadia RING mutant H962C is a well structured and stable polypeptide. Furthermore, the information that came from the atomic absorption data and the analysis of the NMR spectra confirmed that the RING mutant maintains the RING wild type ability to bind two zinc ions. At the same time, further NMR studies are being carried out in order to investigate its structure and ability to interact with the E2 enzyme.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι ομο- ή ετεροπενταμερείς διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες, σχηματίζοντας ιοντικά κανάλια, συμβάλλουν στην λειτουργία του μυικού και νευρικού συστήματος. Η επικείμενη εμπλοκή των υποδοχέων αυτών σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις του οργανισμού, επιβάλλει τη γνώση της δομής τους, απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη εξειδικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Μέχρι τώρα, δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του μορίου του ανθρώπινου υποδοχέα μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ή μέσω πειραμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η απουσία των συγκεκριμένων πληροφοριών, οφείλεται στη φύση του μορίου του υποδοχέα όπως η ύπαρξη των υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών, το μέγεθος του μορίου καθώς και η αδυναμία απομόνωσης σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια υδατοδιαλυτά, λειτουργικά, με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωσή τους και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Τα τμήματα του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, τα οποία συγκεντρώνουν τις παραπάνω προϋποθέσεις, είναι τα εξωκυτταρικά αμινοτελικά πολυπεπτίδια των διαφόρων υπομονάδων που τον αποτελούν. Από την άλλη πλευρά, ο οργανισμός που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως σύστημα ετερόλογης έκφρασης, πρέπει να είναι εύκολος στους χειρισμούς του, γρήγορος, οικονομικός, με μεγάλο επίπεδο έκφρασης (όπως τα βακτήρια π.χ. E.coli) αλλά ταυτόχρονα να έχει την ικανότητα να πραγματοποιεί μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες που εκφράζει ώστε τα παραγόμενα μόρια να μπορούν να αναδιπλωθούν (όπως τα ευκαρυωτικά κύτταρα). Άρα, για να προκύψουν τα επιθυμητά μόρια, σύμφωνα με τις παραπάνω προϋποθέσεις, εκφράστηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα (ECDs) των ανθρώπινων υπομονάδων α1, α4 και β2 στο υπερκείμενο καλλιέργειας του μεθυλοτροφικού ζυμομύκητα P. pastoris. Αρχικά, μελετήθηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα των α4 και β2 υπομονάδων με διαφορετικούς επιτόπους ώστε να γίνει η επιλογή του καλύτερου συνδιασμού που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για έκφραση των δύο υπομονάδων στο ίδιο σύστημα. Η έκφραση των α4 και β2 ECDs με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό τους άκρο (α4-ECD-6xHis και β2-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση μικρών ποσοτήτων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων τα οποία κρίνονται ακατάλληλα για δομικές μελέτες εξαιτίας της υδροφοβικότητας και κατά συνέπεια του μεγέθους τους. Όταν πραγματοποιήθηκε αλλαγή της υδρόφοβης περιοχής μεταξύ των κυστεινών 128 και 142 με την αντίστοιχη υδρόφιλη ολιγοπεπτιδική αλληλουχία της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη (AChBP) στις ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες, παρατηρήθηκε αισθητή βελτίωση για την β2-ECD υπομονάδα (β2-cysloop-ECD-6xHis) τόσο σε επίπεδο έκφρασης όσο και στο μέγεθος το οποίο σχηματίζει. Ωστόσο, παρόμοια βελτίωση για την α4-cysloop-ECD-6xHis υπομονάδα, παρατηρήθηκε όταν αντικαταστάθηκε ο καρβοξυτελικός επίτοπος των έξι αμινοξικών καταλοίπων ιστιδίνης από τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG (α4-cysloop-ECD-FLAG). Στα πειράματα συνέκφρασης, των δύο υπομονάδων στο ζυμομύκητα P. pastoris που ακολούθησαν, αρχικά πιστοποιήθηκε η συνέκφραση και στη συνέχεια ο σχηματισμός ετεροπολυμερούς των δύο υπομονάδων. Ακόμα, η απογλυκοζυλίωση των α4-cysloop-ECD-FLAG και β2-cysloop-ECD-6xHis όταν εκφράζονται μόνες τους ή όταν εκφράζονται ταυτόχρονα στο υπερκείμενο του P. pastoris, φανέρωσε την αύξηση της ομοιογένειας των μορίων τους. Επιπλέον, ενθαρυντική ήταν η εύρεση της επιθυμητής στοιχειομετρίας 2 α4/ 3 β2 των υπομονάδων βάση της οποίας συμμετέχουν στο σχηματισμό του ετεροπολυμερούς. Ωστόσο, η μάζα του ετεροπολυμερούς των ανασυνδιασμένων α4 και β2 υπομονάδων, όπως προέκυψε από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης (1191 και 496kDa), απέχει κατά πολύ από την θεωρητικά αναμενόμενη μάζα ετεροπενταμερούς των 175kDa. Μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός σε δείγματα του απομονωμένου ετεροπολυμερούς, επιβεβαίωσαν το παραπάνω αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα της μελέτης μείωσης του μεγέθους των ετεροπολυμερών με απορρυπαντικά, έδειξαν ότι είναι δυνατή η επιθυμητή μείωση του μεγέθους αλλά σε υψηλές τιμές συγκεντρώσεων απορρυπαντικού. Επιπλέον, η ανάγκη για ακόμα υψηλότερες τιμές απορρυπαντικών προς βελτίωση της ομοιογένειας δεν συνίσταται, διότι κατευθύνει τους σχηματισμούς των πρωτεϊνικών μοριών σε ασταθείς καταστάσεις οι οποίες χαρακτηρίζονται από ευμετάβλητες διαμορφώσεις και πολλές φορές καταστροφή των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Ακόμα, το γεγονός ότι τα απομονωμέμενα ετεροπολυμερή των α4 και β2 ECDs δεν εμφανίζουν την ικανότητα δέσμευσης νικοτίνης, σε συνδιασμό με τα παραπάνω αποτελέσματα μελέτης τους, οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι δεν τηρούν τις προϋποθέσεις των κατάλληλων πρωτεϊνικών δειγμάτων τα οποία προορίζονται για πειράματα μελέτης της δομής τους. Η έκφραση της ανασυνδιασμένης α1-ECD με τον επίτοπο των έξι αμινοξικών καταλοίπων στο καρβοξυτελικό της άκρο (α1-ECD-6xHis) στο υπερκείμενο καλλιέργειας του P. pastoris, κατέληξε στην απομόνωση υδατοδιαλυτού και λειτουργικού μορίου. Οι πληροφορίες των μελετών κυκλικού διχρωισμού σε δείγμα της απομονωμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, δείχνουν ότι πρόκειται για ένα μόριο με διαμόρφωση και μάλιστα, σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής, εμφανίζει ένα πλούσιο περιεχόμενο β-πτυχωτής επιφάνειας (40,9%). Ωστόσο, οι δοκιμές κρυστάλλωσης στις οποίες τέθηκαν δείγματα της α1-ECD-6xHis, δεν απέδωσαν το επιθυμητό αποτέλεσμα της κρυστάλλωσης του μορίου. Ακόμα και όταν πραγματοποιήθηκε προσπάθεια μελέτης του μορίου σε διαλύματα (NH4)2SO4 με μεταβλητή συγκέντρωση, pH και θερμοκρασία, στάθηκε αδύνατο να κρυσταλλωθεί το μόριο. Το πρόβλημα της συγκεκριμένης έκφρασης, εντοπίστηκε επιπλέον και στο ποσό της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης που είναι δυνατόν να απομονωθεί. Για να αυξηθεί το επίπεδο έκφρασης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα μεταβολής των συνθηκών καλλιέργειας (θερμοκρασία, σύσταση θρεπτικού μέσου) όπως επίσης και των συνθηκών απομόνωσης. Παρατηρήθηκε βελτίωση στην ποσότητα του τελικού απομονωμένου προϊόντος η οποία όμως δεν θεωρείται ικανοποιητική. Για το λόγο αυτό, στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έκφραση και απομόνωση της α1-ECD με τον επίτοπο του οκταπεπτιδίου FLAG στο αμινοτελικό της άκρο, στο υπερκείμενο καλλιέργειας του ίδιου ζυμομύκητα. Το επίπεδο έκφρασης της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης, ήταν αρκετά ικανοποιητικό (1mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας) και μάλιστα αυξημένο κατά πολύ σε σχέση με τις προηγούμενες εκφράσεις (0,34mg πρωτεΐνης /lt υπερκειμένου καλλιέργειας). Ωστόσο, η αδυναμία ορθής λήψης φάσματος του μορίου μέσω κυκλικού διχρωισμού εξαιτίας αυξημένου θορύβου, στάθηκε η αιτία να σταματήσει η έκφραση της συγκεκριμένης ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης. / Nicotinic acetylcholine receptors are homo- or heteropentameric transmembrane glycoproteins which form ion channels and contribute to the function of muscles and neurons. The involvement of these receptors in pathological situations, imposes the knowledge of their structure for the development of specific therapeutic approaches. Till now, there is not sufficient knowledge about the structure of the human acetylcholine receptor through x-ray crystallography or through NMR experiments. The absence of these data, comes from the nature of the receptor molecules such as the existence of hydrophobic transmembrane domains, the size of the molecule. Therefore, it is necessary to obtain hydrophilic and functional protein molecules with native-like structure and in adequate quantities in order to be possible structural studies of these molecules. So, the most suitable domains of the acetylchlonine receptors to be used for these studies, are the extracellular domains. At the beginning, studies of extracellular domains of α4 and β2 subunits with different tags were accomplished in order to choose the best combination to be used in cooexpression experiments in Pichia Pastoris. The expression of the extracellular domains of α4 and β2 tagged with 6xHis in the C-terminus (α4-ECD-6xHis and β2-ECD-6xHis) to the supernatant of the P. pastoris culture, gave very little amounts of protein aggregates which are not suitable for structural studies because of their hydrophobicity. When the hydrophobic region between Cys 128 and Cys 142 was changed with the respective hydrophilic region from Acetylcholine Binding Protein, an increase of expression of the β2-ECD subunit and a decrease of protein aggregation was observed. However, a similar improvement for α4-cysloop-ECD-6xHis subunit was observed after substitution of 6xHis tag with FLAG tag. Thereafter, the cooexpression experiments through P. pastoris, showed the formation of an heteropolymer which is formed by the two different subunits. Moreover, the in vitro deglycosylation of α4-cysloop-ECD-FLAG and β2-cysloop-ECD-6xHis, either they are coexpressed or not, revealed an improvement of homogeneity of these molecules. Besides these results, the determination of the desirable stoichiometry 2 α4/ 3 β2 of the subunits that participate in the heteropolymer, was also encouraging. However, the estimation of protein mass of the α4β2 heteropolymer, through gel filtration chromatography (1191 and 496 kDa), showed that these formations are much bigger than the expected mass of heteropentamers. This result is also confirmed by dynamic light scattering experiments. The results from decreasing the size of heteropolymers in the presence of detergents, showed that this is possible to be achieved in high concentrations of detergents with the danger of denaturing the protein molecules. So, it was obvious that this strategy for studying the structure of the extracellular domain of α4β2 receptors, had to be changed. The expression of the extracellular domain of α1 subunit tagged with 6xHis to the supernatant of P. pastoris culture, led to the isolation of water soluble and functional molecule. Data from circular dicroism studies in a protein sample, showed that α1-ECD has a formation rich in β-sheets (40.9%). However, crystallization trials in samples of α1-ECD-6xHis, gave no protein crystals. Moreover, the yield of the purified protein was too small. In order to achieve an increase of the protein yield, experiments of modifying the temperature and the composition of nutrient were carried out. The result from these experiments showed a slight improvement for the final quantity of protein that is obtained but not satisfactory. For this reason, there were performed expression and isolation of the extracellular domain of α1 subunit with a FLAG tag in the N-terminus, to the supernatant of P. pastoris culture. The quantity of purified protein was dramatically increased (1mg protein/lt of culture supernatant). However, it was not possible to obtain a circular dichroism spectrum without background noise and that was the reason for not continuing the expression of this protein.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι κατιονικοί δίαυλοι, οι οποίοι ενεργοποιούνται κατόπιν πρόσδεσης κατάλληλου νευροδιαβιβαστή και ευθύνονται για την κυτταρική επικοινωνία δια μέσου της ακετυλοχολίνης. Ο κυριάρχος τύπος νικοτινικών υποδοχέων στον εγκέφαλο των θηλαστικών με υψηλή συγγένεια για νικοτίνη, αποτελείται από α4 και β2 υπομονάδες. Ο συγκεκριμένος τύπος υποδοχέων, είναι υπεύθυνος για την εξάρτηση στην νικοτίνη και θεωρείται ότι εμπλέκεται στις ασθένειες Alzheimer και Parkinson. Για το λόγο αυτό οι συγκεκριμένοι δίαυλοι, αποτελούν έναν σημαντικό στόχο σχεδιασμού και ανάπτυξης φαρμάκων. Στην προσπάθειά μας να αποκτήσουμε υδρόφιλες περιοχές του ανθρώπινου υποδοχέα α4β2 για δομικές μελέτες ικανές να προσδένουν αγωνιστές, εκφράσαμε τα εξωκυττάρια τμήματα των συγκεκριμένων υπομονάδων στο ευκαρυωτικό σύστημα έκφρασης ζύμης Pichia pastoris. Στα αγρίου τύπου εξωκυττάρια τμήματα αλλά και στις μεταλλαγμένες μορφές τους, στις οποίες έχει αντικατασταθεί η κυστινική θηλιά με την περισσότερο υδρόφιλη αντίστοιχη περιοχή της πρωτεΐνης η οποία δεσμεύει ακετυλοχολίνη, δεν παρατηρήθηκε καμία ειδική αλληλεπίδραση με γνωστούς προσδέτες. Κρίθηκε λοιπόν αναγκαίο να εκφράσουμε τα εξωκυττάρια τμήματα διασυνδεόμενα με ένα ολιγοπεπτίδιο 24 αμινοξικών καταλοίπων (AGS)8, ως ένα μόριο. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι το συγκαταμερές β2-24-α4-mECD αλλά όχι το α4-24-β2-mECD είναι αρκετά υδατοδιαλυτό μόριο με πολύ καλές ιδιότητες πρόσδεσης αγωνιστών. Η ιωδινιωμένη επιβατιδίνη (125Ι-επιβατιδίνη) και η τριτιωμένη νικοτίνη ([3Η]-νικοτίνη) δεσμεύονται στο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD με σταθερές διάσπασης (Kd) 0,38 και 19 nM αντίστοιχα, τιμές οι οποίες προσεγγίζουν τις αντίστοιχες γνωστές από τη βιβλιογραφία, που προσδίδονται σε ολόκληρο τον ανθρώπινο υποδοχέα α4β2. Επιπλέον, το πόσο ειδική είναι η δέσμευση της 125Ι-επιβατιδίνης φαίνεται και από το γεγονός ότι παρεμποδίζεται συναγωνιστικά από τους αγωνιστές νικοτίνη, κυτισίνη, ακετυλοχολίνη και καρβαμυλοχολίνη με τιμές σταθεράς αναστολής (Κi) ίσες με 20,64, 3,24, 242 και 2254 nM αντίστοιχα. Επιπλέον, επιχειρήθηκε η δημιουργία πενταμερών εξωκυττάριων τμημάτων των ανθρώπινων υπομονάδων α4 και β2. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε συνέκφραση καθενός από τα δύο συγκαταμερή (α4-24-β2-mECD και β2-24-α4-mECD), τα οποία φέρουν χαρακτηριστική αλληλουχία έξι ιστιδινών (6xHis), με κάθε εξωκυττάριο τμήμα των μεταλλαγμένων υπομονάδων α4 ή β2 τα οποία φέρουν την χαρακτηριστική αλληλουχία του οκταπεπτιδίου FLAG. Στις περιπτώσεις της συνέκφρασης του συγκαταμερούς α4-24-β2-mECD με καθένα από τα εξωκυτταρικά και μεταλλαγμένα τμήματα των υπομονάδων α4 ή β2 (α4-mECD ή β2-mECD) δεν παρατηρήθηκε δέσμευση με 125Ι-επιβατιδίνη και συνεπώς δεν προχωρήσαμε σε περαιτέρω χαρακτηρισμό. Μόνο στην περίπτωση της συνέκφρασης του συγκαταμερούς β2-24-α4-mECD με το β2-mECD παρατηρήθηκε πρόσδεση με 125Ι-επιβατιδίνη. Επίσης, οι μελέτες δυναμικής σκέδασης φωτός εμφάνισαν μία εκτεταμένη ετερογένεια μεγέθους των τελικών προϊόντων όπως απομονώνονται μέσω της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης, αποκλείοντας, τουλάχιστον σε αυτό το σημείο οποιαδήποτε προσπάθεια δομικής μελέτης για τα συγκεκριμένα μόρια. Κατασκευάστηκαν επίσης δύο συγκαταμερή τριμερών (β2-24-β2-24-α4-mECD και β2-24-α4-24-β2-mECD). Δυστυχώς, η ανάλυση μέσω SDS-PAGE και η αποτύπωση κατά Western αποκάλυψε την ύπαρξη ενός μείγματος, το οποίο αποτελείται από ολόκληρα τα μόρια (τριμερή) αλλά και από πολυπεπτίδια στα οποία απουσιάζουν ένα ή και δύο από τα μονομερή εξωκυττάρια τμήματα (διμερή και μονομερή αντίστοιχα). Το συγκεκριμένο αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το σύστημα ετερόλογης έκφρασης το οποίο χρησιμοποιούμε (P. pastoris) αν και είναι κατάλληλο για την έκφραση των λειτουργικών διμερών συγκαταμερών (β2-24-α4-mECD), είναι μάλλον ακατάλληλο για την έκφραση πιο περίπλοκων κατασκευών, πιθανότατα εξαιτίας γεγονότων ομόλογου ανασυνδιασμού των πλασμιδίων πριν ή κατά την ενσωμάτωσής τους στο γονιδίωμα της ζύμης. Ακόμα, ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι το απογλυκοζυλιωμένο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD εμφανίζει τις ίδιες ιδιότητες πρόσδεσης αγωνιστών. Επιπροσθέτως, το απογλυκοζυλιωμένο συγκαταμερές β2-24-α4-mECD απομονονέται ως μονομερές, γεγονός το οποίο, σε συνδιασμό με την προηγούμενη παρατήρηση, καθιστά την συγκεκριμένη πρωτεΐνη κατάλληλη να χρησιμοποιηθεί σε δομικές μελέτες και πιθανόν για την φαρμακολογική εκτίμηση καινούργιων και ειδικών αγωνιστών για υποδοχείς α4β2. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are ligand-gated cation channels responsible for cell communication via the neurotransmitter acetylcholine. The predominant nAChR subtype in the mammalian brain with a high affinity for nicotine is composed of α4 and β2 subunits. This nAChR subtype is responsible for addiction to nicotine and is thought to be implicated in Alzheimer and Parkinson diseases and therefore presents an important target for drug design. In an effort to obtain water-soluble, ligand-binding domains of the human α4β2 nAChR appropriate for structural studies, we expressed the extracellular domains (ECDs) of these subunits in the eukaryotic expression system Pichia pastoris. The wild-type ECDs and their mutants containing the more hydrophilic Cys-loop from the snail acetylcholine-binding protein (individually expressed or coexpressed) did not demonstrate any specific interaction with ligands. We then linked the mutated ECDs with the 24 amino acid peptide (AGS)8 and observed that the β2-24-α4-mECD concatamer, but not the α4-24-β2-mECD one, exhibited very satisfactory water solubility and ligand binding properties. The 125I-epibatidine and [3H]nicotine bound to β2-24-α4-mECD with dissociation constants (Kd) of 0.38 and 19 nM, respectively, close to the published values for the intact α4β2 nAChR. In addition, 125I-epibatidine binding was blocked by nicotine, cytisine, acetylcholine, and carbamylcholine with inhibition constants (Ki) of 20.64, 3.24, 242, and 2,254 nM, respectively. In addition, we attempted to create pentameric domains of the extracellular human subunits α4 and β2. Initially, we accomplished the coexpression of the particular concatamers, α4-24-β2-mECD and β2-24-α4-mECD, bearing the six histidine tag (6xHis), with each of the mutated extracellular domains of the subunits α4 and β2 (α4-mECD and β2-mECD), bearing the characteristic octapeptide FLAG tag. The coexpression of the concatamer α4-24-β2-mECD with each of α4 or β2-mECD did not lead to binding to 125I - epivatidine and therefore we did not proceed to any further characterization. Only in the case of the coexpression of the concatamer β2-24-α4-mECD with the β2-mECD we observed binding to 125I - epivatidine. Aditionally, the dynamic light scattering studies demonstrated a widespread size heterogeneity of the final product as isolated by gel filtration chromatography, blocking, at least at this point, any further attempt for structural studies of the specific molecules. We then constructed two trimeric concatamers (β2-24-β2-24-α4-mECD and β2-24-α4-24-β2-mECD) . Unfortunately, the analysis by SDS-PAGE and Western blot revealed the presence of a mixture which consists of entire molecules ( trimers ), but also from polypeptides which are missing one or two of the monomer extracellular domains (dimers and monomers, respectively). This result indicates that the heterologous expression system which is used (P. pastoris), is suitable for the expression of functional bilateral concatamers (β2-24-α4-mECD), but is rather unsuitable for the expression of more complex structures, probably due to events of homologous recombination of the plasmids before or during integration into the yeast genome . Interestingly, deglycosylation of the concatamer did not affect its ligand binding properties. Furthermore, the deglycosylated β2-24-α4 ECD existed mainly in monomeric form, thus forming an appropriate material for structural studies and possibly for pharmacological evaluation of novel α4β2 nAChR-specific agonists.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της σχέσης της λεκτικής εργαζόμενης μνήμης και της παραγωγής γραπτού λόγου από μαθητές Δ’ τάξης Δημοτικού είτε με κανονική επίδοση είτε με μαθησιακές δυσκολίες. Στα περισσότερα γνωστικά μοντέλα γραπτής έκφρασης επισημαίνεται ο καθοριστικός ρόλος της εργαζόμενης μνήμης κατά την παραγωγή γραπτού λόγου. Για τον σκοπό της έρευνας δημιουργήθηκαν δύο εξισωμένες ως προς το φύλο και τη χρονολογική ηλικία ομάδες, οι οποίες διέφεραν στη σχολική επίδοση. Κάθε ομάδα αποτελούταν από 27 μαθητές, οι οποίοι συμμετείχαν σε μια σειρά από δοκιμασίες λεκτικής εργαζόμενης μνήμης, ενώ κλήθηκαν να γράψουν και ένα αφηγηματικό κείμενο. Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ότι υπάρχουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων στις δοκιμασίες εργαζόμενης μνήμης και στη γραπτή παραγωγή. Επιπλέον, υπάρχει συνάφεια μεταξύ της εργαζόμενης μνήμης και της γραπτής έκφρασης, ενώ η εργαζόμενη μνήμη επεξηγεί μεγάλα ποσοστά της συνολικής διακύμανσης της παραγωγής γραπτού λόγου. Περαιτέρω έρευνες κρίνονται απαραίτητες για επαλήθευση των αποτελεσμάτων σε μαθητές και άλλων ηλικιών, αλλά και για διερεύνηση της συνεισφοράς της μνήμης στην παραγωγή άλλων κειμενικών ειδών. / The purpose of the present thesis was to examine the relation between verbal working memory and writing ability in students attending fourth grade of elementary school with and without learning disabilities. Most cognitive models of writing suggest a central role for working memory during the writing of a text. For the purpose of the study, two groups of students matched in gender and chronological age, but differ in educational achievement. Each group consisted of 27 participants, who were tested using a series of verbal working memory tasks and wrote a narrative text. The results of the study indicated that there was statistically significant difference between the two groups in verbal working memory tasks and in written production. Furthermore, there were statistically significant correlations between the working memory tests and the students’ writing ability. Also, working memory interpreted a large percentage of the total variance of the written production. Further research is necessary in order to confirm the results in older school students and to investigate the contribution of working memory in the production of different text genres, in addition to narrative ones.

Με στόχο την απομόνωση του γονιδίου hsp83 της μεσογειακής μύγας, πραγματοποιήθηκε διαλογή μιας cDNA βιβλιοθήκης από προνύμφες 3ου σταδίου, με ανιχνευτή το δεύτερο εξώνιο του hsp83 ομόλογου γονιδίου της Drosophila auraria. Από τη διαλογή αυτή προέκυψαν αρκετοί αλληλεπικαλυπτόμενοι κλώνοι, ο μεγαλύτερος των οποίων (CM-1) είχε μέγεθος 2.593 kb και περιελάμβανε ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο 715 αμινοξέων, από τη μετάφραση του οποίου προκύπτει ένα πολυπεπτίδιο προβλεπόμενου μοριακού βάρους 81,74 kDa. Η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία έδειξε πολύ μεγάλη ταυτότητα με όλα τα μέλη της οικογένειας HSP90 και ειδικότερα με τις HSP83 ομόλογες πρωτεΐνες της Drosophila. Επιπλέον, η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία περιείχε όλες τις συντηρημένες περιοχές των μελών της οικογένειας των HSP90 και στο καρβοξυτελικό της άκρο, έφερε το πενταπεπτίδιο MEEVD, το οποίο είναι χαρακτηριστικό όλων των κυτταροπλασματικών ισομορφών αυτής της οικογένειας. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα ο κλώνος CM-1, ονομάστηκε Cchsp83. Ο κλώνος αυτός, εκτός από ολόκληρη την κωδική περιοχή του γονιδίου, περιείχε μέρος της 5’ μη μεταφραζόμενης περιοχής και ολόκληρη την 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του hsp83 γονιδίου της μεσογειακής μύγας. Ανάλυση κατά Southern σε γονιδιωματικό DNA με διάφορα ένζυμα περιορισμού και κατάλληλους cDNA ανιχνευτές, έδειξε ότι το Cchsp83 γονίδιο υπάρχει σε ένα μόνο αντίγραφο στο γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας. Ανάλυση “Northern” έδειξε την ύπαρξη ενός μεταγράφου με μέγεθος 2,7 kb περίπου. Το Cchsp83 γονίδιο, χαρτογραφήθηκε με in situ υβριδοποίηση σε μία θερμοεπαγόμενη χρωμοσωματική διόγκωση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων του εντόμου (6R:94C). Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Cchsp83 έγινε σε επίπεδο RNA με RT-PCR σε ολικό RNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανάλυση Western σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα. Αντισώματα για την CcHSP83 αναπτύχθηκαν μετά από έκφραση ενός σημασμένου με 6 His τμήματος του Cchsp83 cDNA (490-690aa) σε βακτήρια E. coli. Η αντίδραση του Cchsp83 γονιδίου στην αύξηση της θερμοκρασίας είναι πολύ γρήγορη και ευαίσθητη. Μετάγραφα του γονιδίου ανιχνεύονται μετά από 5 λεπτά θερμικού στρες και σε θερμοκρασίες αρκετά χαμηλές (300C). Η επαγωγή του γονιδίου γίνεται μέγιστη μετά από 30-60 λεπτά θερμικού στρες στους 37-390C. Η επαναφορά της έκφρασης του γονιδίου στα φυσιολογικά επίπεδα μετά από θερμικό στρες είναι αργή, αφού για να γίνει αυτό απαιτούνται 4 ώρες ανάκαμψης στους 250C, μετά από μόλις 30 λεπτά θερμικού στρες στους 380C. Αναπτυξιακή μελέτη του προτύπου έκφρασης του Cchsp83 έδειξε ότι το γονίδιο εκφράζεται σε όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης της μεσογειακής μύγας. Στους 250C τόσο τα επίπεδα του RNA, όσο και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, είναι υψηλά στα εμβρυικά στάδια, χαμηλά στα προνυμφικά και μέτρια στα νυμφικά και ενήλικα στάδια. Μετά από θερμικό στρες στους 380C, τα επίπεδα των μεταγράφων αυξάνονται αρκετά, ιδιαίτερα στα στάδια που σε φυσιολογικές συνθήκες είναι χαμηλά. Όσον αφορά στα επίπεδα της πρωτεΐνης, τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια μετά από θερμικό στρες στους 350C, αλλά όχι στους 37-390C, όπου δεν παρατηρήθηκε καθόλου επαγωγή. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι σε υψηλές θερμοκρασίες καταστέλλεται η ωρίμανση ή και η μετάφραση του Cchsp83 RNA. Με στόχο την απομόνωση των ρυθμιστικών περιοχών του γονιδίου Cchsp83 της μεσογειακής μύγας, πραγματοποιήθηκε διαλογή μιας χρωμοσωματικής λEMBL-4A βιβλιοθήκης, με ανιχνευτή το δεύτερο εξώνιο του hsp83 ομόλογου γονιδίου της Drosophila auraria. Από τη διαλογή αυτή απομονώθηκαν δύο κλώνοι, ένας από τους οποίους περιελάμβανε μέρος της κωδικής περιοχής, την 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή και 3,5 kb της 5’ ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83. Σύγκριση της γονιδιωματικής αλληλουχίας με τη cDNA αλληλουχία, αποκάλυψε την ύπαρξη ενός μικρού εσωνίου 275 bp ανάμεσα στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή και στην αρχή της κωδικής περιοχής του γονιδίου. Βιοπληροφορική ανάλυση και πειράματα 5’ RACE, υποδηλώνουν ότι το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου βρίσκεται 144 bp ανοδικά του 5’ άκρου του εσωνίου και 23 bp καθοδικά ενός τυπικού στοιχείου TATA (ΤΑΤΑΑΑΤΑ). Δύο πιθανά στοιχεία απόκρισης στη θερμοκρασία (HSEs) εντοπίστηκαν στην εγγύς 5’ περιοχή του γονιδίου, 35 και 330 bp ανοδικά του στοιχείου TATA. Επιπλέον, βρέθηκαν 4 ακόμα πιο απομακρυσμένα HSEs, 1.595, 2.861, 2.880 και 2.890 bp, ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής, καθώς και ένα HSE μέσα στο εσώνιο. Λειτουργική ανάλυση της εγγύς 5’ ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83 πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του γενετικού μετασχηματισμού. Τρία αλληλεπικαλυπτόμενα τμήματα του υποκινητή του γονιδίου Cchsp83, μήκους 519 bp (-380/+139, PL), 230 bp (-86/+144, PM) και 193 bp (-55/+139, PS) τοποθετήθηκαν μπροστά από το γονίδιο αναφοράς lacZ και εισήχθησαν στο γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας με το σύστημα μετασχηματισμού Minos. Η έκφραση του γονιδίου αναφοράς, ελέγχθηκε σε όλες τις διαγονιδιακές σειρές που προέκυψαν με την ποσοτική ενζυματική μέθοδο της β-γαλακτοζιδάσης. Οι PM-lacZ και PS-lacZ σειρές δεν έδειξαν ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης του lacZ γονιδίου τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες, όσο και σε συνθήκες θερμικού στρες. Αντιθέτως, οι περισσότερες από τις PL-lacZ σειρές έδειξαν σημαντικά επίπεδα συστατικής έκφρασης. Το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου αναφοράς μελετήθηκε σε μία PL-lacZ σειρά και βρέθηκε παρόμοιο με εκείνο του ενδογενούς γονιδίου, υποδηλώνοντας ότι η -380/+139 περιοχή του υποκινητή περιλαμβάνει όλα τα ρυθμιστικά στοιχεία που απαιτούνται για την ορθή χρονική έκφραση του Cchsp83 γονιδίου σε φυσιολογικές συνθήκες. Αν και η περιοχή αυτή του υποκινητή περιλαμβάνει δύο δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερμοκρασία καθώς και την 5’ UTR, εντούτοις δεν είχε την ικανότητα να οδηγήσει σε θερμοεπαγόμενη έκφραση το γονίδιο αναφοράς. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η περιοχή -380/+139 του Cchsp83 γονιδίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη διαγονιδιακών συστημάτων σήμανσης της μεσογειακής μύγας, τα οποία αναμένεται να συμβάλλουν στη διατήρηση και ανίχνευση κατάλληλων στελεχών που χρησιμοποιούνται σε προγράμματα βιολογικού ελέγχου του επιβλαβούς αυτού εντόμου. / By using the second exon of the D. auraria hsp83 gene as a probe, a number of overlapping cDNA clones were isolated from a Ceratitis capitata (medfly) cDNA library. The longest cDNA had a size of 2,593 bp and contained an open reading frame coding for a putative polypeptide of 715 amino acids with a predicted molecular weight of 81.74 kDa. In addition, it contained a part of the 5’-untranslated region and the complete 3’-untranslated region of a medfly hsp83 homolog, named Cchsp83. The predicted amino acid sequence showed a high degree of identity to all known sequences of the HSP90 family and was more closely related to the Drosophila HSP83 homologs. The putative medfly HSP83 contained all the conserved sequences of the members of the HSP90 family and was ended, at the C-terminal, with the pentapeptide MEEVD that characterizes all the cytosolic members of this family. Genomic Southern blot analysis, with several restriction enzymes and appropriate cDNA probes, indicated that the Cchsp83 gene exists as a single copy in the medfly genome. Northern blot hybridization revealed a single transcript of approximately 2.7 kb. In situ hybridization analysis showed that the Cchsp83 gene maps at the 94C region of the 6th chromosome (6R:94C), which corresponds to one of the major heat shock puffs of the medfly salivary gland polytene chromosomes. Evaluation of the Cchsp83 gene transcript and protein levels was performed by RT-PCR and western analysis, using total RNA and protein from synchronized animals. Anti-HSP83 antibodies were prepared against a histidine tag purified chimeric polypeptide from E. coli cells, transformed with a part of the coding region (aa 490-690) of the Cchsp83 cDNA. The response of the Cchsp83 gene to heat was fast and sensitive. Heat-induced transcript levels could be detected within 5 min at temperatures as low as 300C. Maximum transcript levels were obtained after 30-90 min treatments at 35-390C. Following recovery at 250C, after a 30 min heat shock, the accumulated transcripts remained at high levels for approximately 3h and declined to the non-induced levels 1h later. Developmental studies showed that the Cchsp83 gene is expressed constitutively throughout medfly development. At 250C, both transcript and protein levels were high in embryonic stages, low in larval stages and moderate in pupal and adult stages. Following heat shock at 380C, the transcript levels increased approximately 3- to 5-fold, depended on the developmental stage. Similar results were obtained for the protein levels after a heat shock at 350C, but not at 380C, suggesting that the Cchsp83 mRNAs are not translated efficiently at high temperatures. Screening of a genomic λEMBL-4A library from 24-h-old medfly embryos with the second exon of the D. auraria hsp83 gene, resulted in the isolation of a genomic clone containing part of the coding region, the untranslated leader region (5’ UTR) and 3.5 kb from the 5’ flanking region of the gene. Comparison of the genomic and cDNA nucleotide sequences revealed the presence of a small intron of 275 bp between the 5’ untranslated and coding regions of the gene. Thus the Cchsp83 gene is organized into two exons separated by a small intron. Computational analysis and 5’ RACE experiments, suggested that the putative transcription initiation site of the gene is located 144 bp upstream of the 5’ splicing site of the intron and 23 bp downstream of a typical TATA box (TATAΑΑΤΑ). Two putative heat shock elements (HSEs) were identified in the proximal 5’ flanking region of the gene, 35 and 330 bp, upstream of the TATA box. In addition to them, four distal HSEs, 1,595, 2,861, 2,880 and 2,890 bp, upstream of the putative transcription initiation site and one HSE inside the intron were identified. Functional analysis of the proximal 5’ flanking region of the Cchsp83 gene was performed by germline transformation. Three overlapping promoter fragments PL (-380/+139), PM (-86/+144) and PS (-55/+139), were fused to the lacZ reporter gene and the resulting constructs were introduced into the medfly genome via Minos-element mediated germline transformation. The expression of the reporter gene, in at least 8 homozygous transformed lines for each construct, was evaluated by quantitative β-galactosidase assays. The PM-lacZ and PS-lacZ lines did not show detectable levels of lacZ expression at neither normal or heat shock conditions. On the other hand, most of the PL-lacZ lines showed significant levels of constitutive lacZ expression. Developmental expression studies in one of these lines showed that the reporter gene exhibited similar developmental expression pattern to the endogenous one, suggesting that the PL promoter region includes all the necessary regulatory elements for driving correct temporal expression of the Cchsp83 at normal conditions. Although this promoter region contained the two proximal HSEs and the 5’ UTR, it was unable to drive heat-induced expression of the reporter gene suggesting that additional upstream and/or downstream sequences are necessary for the heat-induced expression of the Cchsp83 gene. Our data indicate that the PL promoter region of the Cchsp83 gene can be used as a driver for the development of robust transgenic marker systems in medfly. Such systems are important for detecting, maintaining and recognizing medfly strains that are used today in population control programs of this agricultural pest.

Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών επιτρέπει τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα σε ένα μόνο πείραμα δημιουργώντας έτσι ένα τεράστιο σύνολο δεδομένων για ανάλυση. Για να είναι δυνατή η εξαγωγή σημαντικής πληροφορίας για το υπό μελέτη βιολογικό σύστημα, έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι προεπεξεργασίας και ανάλυσης των δεδομένων. Στις μεθόδους προεπεξεργασίας των δεδομένων συμπεριλαμβάνονται και οι μέθοδοι κανονικοποίησης. Σκοπός της κανονικοποίησης είναι η ελαχιστοποίηση των συστηματικών σφαλμάτων που εντοπίζονται στα εκτιμώμενα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων, έτσι ώστε οι εμφανιζόμενες διαφορές τους να οφείλονται κυρίως σε βιολογικούς παράγοντες. Επίσης, η κανονικοποίηση καθιστά εφικτή τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης δεδομένων από περισσότερες της μίας μικροσυστοιχίες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία παρατίθεται μια ανασκόπηση των μεθόδων κανονικοποίησης για δεδομένα γονιδιακής έκφρασης cDNA μικροσυστοιχιών καθώς και μια σύγκριση των αναλυόμενων μεθόδων κανονικοποίησης. / Microarray technology allows the measurement of gene expression levels of thousands of genes simultaneously in a single experiment, therefore creating a vast set of data for analysis. In order to be able to extract the most essential information for the biological system under examination in a specific microarray, various methods are used for data pre-processing and analysis. These data pre-processing methods also include normalization methods. The purpose of normalization is the minimization of the systematic errors that are found in the estimated gene expression levels, so as the observed biological differences be due mainly to biological factors. Furthermore, the normalization makes possible the comparison of gene expression levels of data from more than one microarrays. In the present thesis a review of the normalization methods for gene expression microarray data is presented, as well as a comparison between the analysed normalization methods.

Η νόσος Αλτσχάιμερ καταλαμβάνει την πρωτοκαθεδρία στις μη αναστρέψιμες άνοιες με τους επιδημιολογικούς της δείκτες να αυξάνονται όσο μεγαλώνει το προσδόκιμο ζωής του ανθρώπου. Η χρήση φαρμάκων, με αρχική στόχευση άλλη πάθηση, στη νόσο Αλτσχάιμερ αποκαλείται φαρμακευτικός επαναπροσδιορισμός και προσφέρει σαφή πλεονεκτήματα στην ασφάλεια, την ταχύτητα και το κόστος ανάπτυξης μίας εν δυνάμει θεραπείας, ιδιαίτερα όταν η μέχρι σήμερα αντιμετώπιση της πάθησης περιορίζεται στην καθυστέρηση εξέλιξης της βλάβης και τις δευτερογενείς εκδηλώσεις. Στην παρούσα εργασία, εκμεταλλευτήκαμε εργαλεία φαρμακευτικής επαναστόχευσης που βασίζονται στις γονιδιακές υπογραφές πέντε μελετών μικροσυστοιχιών της νόσου Αλτσχάιμερ. Καίριο στάδιο στη συγκρότηση γονιδιακών υπογραφών είναι ο προσδιορισμός της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων. Εφαρμόζοντας τρεις διαφορετικές τεχνικές (Limma, ChDir, mAP-KL) για το σκοπό αυτό και τοποθετώντας τα αποτέλεσματα σε τέσσερα ξεχωριστά εργαλεία φαρμακευτικής επαναστόχευσης (cMap, SPIEDw, sscMap, LINCS-L1000), αναδείξαμε φάρμακα που συστηματικά αντιστρατεύονται τη νόσο. Η περαιτέρω ανάλυση σε επίπεδο χημικής δομής, λειτουργικών μονοπατιών και δικτυακής θεώρησης προσδιόρισε το μηχανισμό δράσης των φαρμάκων και πρότεινε νέα βιοδραστικά μόρια ως δυνατικές θεραπευτικές επιλογές. / Alzheimer’s disease dominates dementias of irreversible cause with alarming epidemiologic characteristics due to rise of human life expectancy. The use of initially otherwise purposed drugs in Alzheimer is described as drug repositioning and offers clear advantages in terms of safety, speed and cost issues in the development of a potential therapy, particularly when current treatments are limitited to symptoms’ delay and secondary comorbidities. In this study, we exploited drug repurposing tools based on gene signatures from five microarray experiments of Alzheimer’s disease. A fundamental step in constructing gene signatures is to define differential gene expression. For this purpose, we used three different methods (Limma, ChDir, mAP-KL) which we analyzed with four distinct drug repurposing tools (cMap, SPIEDw, sscMap, LINCS-L1000) and found drugs that systematically reverse the disease signature. Further processing of the results with regard to chemical structure, pathway and network analysis revealed the mode of the drugs’ actions and highlighted them as potential therapeutic choices for Alzheimer’s disease.

Το σύστημα του Συμπληρώματος απαρτίζεται από μια ομάδα πρωτεϊνών του πλάσματος και κυτταρικών υποδοχέων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή μέσω της αλληλεπίδρασής τους τόσο με συστατικά της φυσικής, όσο και της προσαρμοστικής ανοσίας. Παράλληλα, μια ομάδα από ρυθμιστικές πρωτεΐνες του πλάσματος και της κυτταρικής μεμβράνης προστατεύει τα κύτταρα του ξενιστή από την αυτόλογη δράση του Συμπληρώματος. Η σύνθεση του τελικού λυτικού συμπλόκου MAC, που οδηγεί σε κυτταρόλυση, ρυθμίζεται από τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες : CD59, vitronectin και clusterin. Μέχρι σήμερα οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες της λυτικής οδού του Συμλπηρώματος έχουν ελάχιστα χαρακτηριστεί σε σπονδυλωτά πέραν των θηλαστικών. Οι οστεϊχθύες αποτελούν ένα σημαντικό μοντέλο, καθώς είναι οι μόνοι οργανισμοί που εμφανίζουν ένα πλήρως αναπτυγμένο και διευρυμένο σύστημα συμπληρώματος, μέσω διπλασιασμού πολλών γονιδίων του Συμπληρώματος. Προκειμένου να μελετηθεί η παρουσία και η φυλογενετική εξέλιξη του ρυθμιστικού μορίου της clusterin, το οποίο παρεμποδίζει την πρόσδεση του συμπλόκου C5b-7 στην μεμβράνη του κυττάρου-στόχου, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρόλυσης, έγινε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός του γονιδίου της clusterin στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss irideus). Απομονώθηκαν δύο ισομορφές του γονιδίου της clusterin, clusterin-1 (TCLU-1) και clusterin-2 (TCLU-2) από cDNA βιβλιοθήκη ήπατος πέστροφας, με χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων. Οι προκύπτουσες αμινοξικές αλληλουχίες των ισομορφών clusterin-1 και clusterin-2 παρουσιάζουν 89% ταυτοσημία μεταξύ τους, καθώς και 40 και 38% ταυτοσημία με την clusterin του ανθρώπου, αντίστοιχα. Η μοριακή δομή των συναγομένων πρωτεϊνών αντιστοιχεί στην α΄ αλυσίδα της clusterin και ομοιάζει με εκείνη των θηλαστικών. Γονιδιωματικοί κλώνοι απομονώθηκαν και για τις δύο ισομορφές και μελετήθηκε η οργάνωση εξωνίων-εσωνίων των αντίστοιχων γονιδίων. Η οργάνωση των γονιδίων clusterin-1 και clusterin-2, με τα μέχρι στιγμής δεδομένα, δείχνει αντιστοιχία εξωνίων - εσωνίων με το γονίδιο της clusterin του ανθρώπου, στην περιοχή ομολογίας τους. Ως προς το μέγεθος, τα αντίστοιχα εξώνια φαίνονται συντηρημένα, ενώ τα εσώνια ποικίλουν, εμφανίζοντας μικρότερο μέγεθος συγκριτικά με εκείνα της clusterin του ανθρώπου. Ανάλυση κατά Southern έδειξε ότι η clusterin απαντάται σε δύο τουλάχιστον αντίγραφα στο γονιδίωμα της πέστροφας. Τα γονίδια clusterin-1 και clusterin-2 εμφανίζουν διαφορική έκφραση στο επίπεδο του mRNA σε διάφορους ιστούς πέστροφας, όπως διαπιστώθηκε με RT-PCR. Παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα mRNA του γονιδίου TCLU-1 στο ήπαρ και στο σπλήνα, ενώ η έκφραση του γονιδίου TCLU-2 παρατηρήθηκε αυξημένη στην καρδιά και στο έντερο, χαμηλή στο ήπαρ και στο σπλήνα δεν ανιχνεύτηκε. Τέλος, η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών της clusterin από διάφορους οργανισμούς εμφάνισε την TCLU-1 να ομαδοποιείται με την TCLU-2, ενώ η όλη υποομάδα προηγείται φυλογενετικά των ορθόλογων πρωτεϊνών του pufferfish και του zebrafish και αυτές των ορθόλογων των άλλων οργανισμών που αναλύθηκαν. Συμπερασματικά, το γονίδιο της clusterin ανιχνεύεται στην ιριδίζουσα πέστροφα, σε δύο τουλάχιστον ισομορφές και παρουσιάζει ομολογία με την clusterin του ανθρώπου, τόσο στο επίπεδο οργάνωσης του γονιδίου, όσο και στο επίπεδο της αμινοξικής αλληλουχίας και της προκύπτουσας δομής. Η παρουσία ισομορφών από εναλλακτικό μάτισμα που ισχύει στην clusterin του άνθρωπου δεν έγινε δυνατόν να πιστοποιηθεί. / The complement system consists of a group of plasma proteins and cell receptors that play a critical role in host defense, by interacting with components of both innate and adaptive immunity. Α group of plasma and cell membrane regulatory proteins protects the host cells from the autologous complement activation. The conformation of the lytic complex MAC, which results to the cytolysis, is regulated by the regulatory proteins: CD59, clusterin και vitronectin. Up to date, the regulatory proteins of MAC complex are not well characterized in low vertebrates. Bony fish represent an attractive model for studies on complement system, as they are, the only organisms that reveal a completely developed and extended system, via duplication and functional differentiation of many genes of the complement system. In order to elucidate the presence and the evolution of the clusterin regulatory molecule, which impedes the binding of C5b-7 complex to the membrane of the target cell, inhibiting cytolysis, we report here the cloning and characterization of the clusterin gene in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss irideus). Two isoforms of clusterin gene, clusterin-1 (TCLU-1) and clusterin-2 (TCLU-2) were isolated from a trout liver cDNA library, by PCR using specific oligonoucleotides. The deduced amino-acid sequences of the isoforms TCLU-1 and TCLU-2 show 89% identity to each other, as well as 40 and 38% identity to human clusterin, respectively. The domain structure of the deduced proteins corresponds to the α΄ chain of clusterin and resembles to that of mammalian. Genomic clones were isolated for the two isoforms and intron-exon organization of corresponding genes was clarified. The organization of the clusterin genes TCLU-1 and TCLU-2, as the partial data have shown, is in line with the intron-exon organization of the human clusterin gene, at their homology region. Regarding the length, the corresponding exons seem to be conserved, but the introns in trout clusterin genes are shorter than human clusterin. Southern blot analysis has shown that clusterin can be found as two copies at least, in the trout genome. Also, the genes TCLU-1 and TCLU-2 reveal differential expression, at mRNA level, among several trout tissues, as it was found out by RT-PCR analysis. High levels of TCLU-1 mRNA are detected in liver and spleen. On the other hand, TCLU-2 is expressed mainly in heart and intestine, while is not detected any expression in spleen. Finally, the phylogenetic analysis of the clusterin proteins from various organisms, showed grouping of TCLU-1 and TCLU-2, while this subgroup precedes evolutionary the clusterin orthologs of pufferfish, zebrafish and the other examined organisms, afterwards. Conclusively, the clusterin gene in rainbow trout is detected as two isoforms and shows homology with human clusterin, not only at the level of gene organization, but also at the level of amino-acid sequence and domain architecture. The alternative splicing of human clusterin was not able to be certified in trout.

Η θερμοκρασία ανάπτυξης αποτελεί παράγοντα μεγάλης σημασίας στην οντογένεση των ιχθύων, αφού ως ποικιλόθερμοι οργανισμοί είναι συνεχώς εκτεθειμένοι στις μεταβολές του περιβάλλοντός τους. Έχει παρατηρηθεί πως η θερμοκρασία ανάπτυξης δύναται να προκαλέσει μετατόπιση του χρονοδιαγράμματος των οντογενετικών γεγονότων και πλαστικότητα σε μορφολογικούς και φυσιολογικούς χαρακτήρες (πχ στο μυοσκελετικό και το καρδιαγγειακό σύστημα). Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει μελετηθεί η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης του zebrafish και σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη του ολικού μεταγραφικού προτύπου νυμφών zebrafish. Για το λόγο αυτό σχεδιάστηκαν δύο πειράματα, όπου τρεις θερμοκρασιακές συνθήκες ανάπτυξης (22, 28 και 32oC) εφαρμόστηκαν στην πρώιμη οντογενετική περίοδο: για το διάστημα 0-20 dpf* (1ο πείραμα) και 10-20 dpf (2ο πείραμα). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA από τα άτομα ηλικίας 20 dpf όλων των πληθυσμών και από τα άτομα ηλικίας 10 dpf του πληθυσμού των 28oC του 2ου πειράματος και ακολούθησε υβριδοποίηση σε ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες Affymetrix, με 15.509 αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες γονιδίων (probe sets). Τα 21 μεταγραφικά προφίλ επεξεργάσθηκαν με τα εξειδικευμένα προγράμματα ανάλυσης μικροσυστοιχιών, dChip και MeV (v.4.5.1). Η κανονικοποίηση και το φιλτράρισμα των δεδομένων των μικροσυστοιχιών απέδωσε μεταγραφικά πρότυπα με 9.488 probe sets. Με τεχνικές πολυπαραμετρικής στατιστικής ανάλυσης (HCL και PCA) πραγματοποιήθηκαν οι συγκρίσεις των μεταγραφικών προτύπων μεταξύ των πειραματικών πληθυσμών για κάθε θερμοκρασία ανάπτυξης και οντογενετικό στάδιο. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισμό των μεταγραφικών προτύπων μεταξύ των δύο πειραμάτων, ii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 28oC και 32oC ως προς αυτά των 22oC και στα δύο πειράματα, και iii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 28oC διαφορετικού οντογενετικού σταδίου (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf). Θα αναμέναμε τα πρότυπα έκφρασης των 28oC να παρουσιάζουν παρόμοιο πρότυπο, κάτι που δεν παρατηρείται. Αυτό οφείλεται στο πειραματικό σφάλμα που υπεισέρχεται από το διαφορετικό χρόνο πραγματοποίησης των δύο πειραμάτων και τις ρυθμίσεις κατά την υβριδοποίηση. Έτσι πραγματοποιήθηκε η κανονικοποίηση των “28”, που απαλείφει το πειραματικό σφάλμα. Οι HCL και PCA αναλύσεις έδειξαν i) σαφή διαχωρισμό των μεταγραφικών προτύπων των 28oC και 32oC ως προς αυτά των 22oC ως αποτέλεσμα της επίδρασης της θερμοκρασίας ανάπτυξης, ii) σαφή διαχωρισμό των προτύπων των 22oC των δύο πειραμάτων ως αποτέλεσμα της επίδρασης της περιόδου εφαρμογής και διάρκειας της θερμοκρασιακής αγωγής και iii) σαφή διαχωρισμό των πρότυπων των 28oC (ηλικίας 10 dpf vs 20 dpf) ως αποτέλεσμα της επίδρασης του οντογενετικού σταδίου. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ανάλυση σημαντικότητας (SAM) και λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση (λογισμικό DAVID) των στατιστικώς σημαντικών γονιδίων που διαφοροποιούν τα πρότυπα. Η ανάλυση των γονιδίων, ως προς την ιστοειδική έκφραση ανέδειξε γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη του ματιού, των θωρακικών πτερυγίων και του εγκεφάλου στους πληθυσμούς των 22oC έναντι των 28oC και 32oC. Η παρούσα εργασία αποδεικνύει την επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης και της διάρκειας της θερμοκρασιακής αγωγής, καθώς επάγει μηχανισμούς πλαστικότητας στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Τέλος, υποδεικνύεται πως η πρώιμη οντογενετική περίοδος τείνει να είναι περισσότερο θερμοευαίσθητη, καθώς παρατηρείται εντονότερη επίδραση της θερμοκρασίας (στην περίπτωση των 22οC)στην ανάπτυξη του ατόμου. *dpf: days post fertilization / Developmental temperature plays a principal role in the ontogeny of fish. It is known that developmental temperature may shift the initiation time of the ontogenetic stages and induce plasticity in morphological and physiological characters e.g. the musculoskeletal and the cardiovascular system. However, its effect on the gene expression pattern has not previously been attempted for zebrafish. In the present study, zebrafish Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets were used to map the transcriptome profile of: a) 20 dpf* old zebrafish larvae at three developmental temperatures, i.e. 22oC, 28oC and 32oC (1st experiment) and b) 20 dpf old zebrafish larvae, which were all grown at 28oC for the first 10 days and subsequently divided into three groups, which were grown at 22oC, 28oC and 32oC, respectively; the profile of 10 dpf old larvae was also measured (2nd experiment). We have isolated total RNA from the above populations and then, hybridization of RNA samples has been done on oligonucleotide Affymetrix microarrays of 15,509 probe sets. All 21 profiles were normalized and filtered (dChip software), and multivariate statistical analysis techniques were used on the normalized 9,488 probe set expression profiles (TM4 MeV software). Hierarchical Clustering (HCL) and Principal Component Analysis (PCA) on expression profiles indicated: a) clear separation of the two experiments based on their transcriptomic patterns, b) clustering of the 28oC and 32oC profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22oC in both experiments and c) clear separation of the 28oC profiles based on the developmental stage. We would expect expression profiles of 28oC to be clustered together, though this was not observed because of experimental parameters during the hybridization, as the two experiments were carried out independently on different dates. So the normalization of “28” profiles took place, in order to eliminate the experimental noise. HCL and PCA, then, indicated: a) clustering of the 28oC and 32oC profiles of the 20 dpf old larvae separately from those at 22oC, as the effect of developmental temperature, b) clear separation of 22oC profiles of the two experiments, based on the effect of the period and duration of thermal conditions and c) clear separation of the 28oC profiles based on the developmental stage. Then, Significant Analysis of Microarrays (SAM) and Functional Genomic Classification Analysis (DAVID software) of statistically significant genes was carried out. Analysis of genes based on tissue-specific expression indicated characteristic genes for the development of the eye, pectoral fins and brain in 22oC profiles versus 28oC and 32oC profiles. The present study has proved that thermal effect is determinative among the early ontogenetic stage, especially in the case of longer cold thermal period, and developmental temperature may induce plastic response of gene expression, that could affect the fate of fish. *dpf: days post fertilization

Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αντιψωριασικών φαρμάκων σε καλλιέργειες ανθρώπινων κερατινοκυττάρων με τη χρήση μικροσυστοιχιών DNA. Σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT χορηγήθηκαν τα παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος all-trans retinoic acid (ATRA) και acitretin, σε διαβαθμισμένες δόσεις, προκειμένου να διαπιστωθεί η επίδραση τους στα κύτταρα. Μελετήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τις δοκιμασίες της χρωστικής Trypan Blue και ΜΤΤ. Επιλέχθηκαν δύο συγκεντρώσεις (10^-6 και 10^-8 Μ) των φαρμάκων που αντιστοιχούσαν σε βιωσιμότητα κυττάρων περίπου 80%, οι οποίες χορηγήθηκαν εκ νέου σε καλλιέργειες κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, έγινε εκχύλιση του RNA και έλεγχος της ποιότητας του με ηλεκτροφόρηση (Bioanalyzer). Το RNA χρησιμοποιήθηκε για την in vitro μεταγραφή cDNA που σημάνθηκε με φθοριοχρώματα και άμεσα ακολούθησε υβριδισμός σε πλακίδιο μικροσυστοιχιών (OneArray) το οποίο περιείχε ανιχνευτές για όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα μαζί με τους κατάλληλους μάρτυρες. Σε κάθε πλακίδιο υβριδίστηκαν ταυτόχρονα cDNA από κύτταρα στα οποία είχε χορηγηθεί ρετινοειδές και κύτταρα στα οποία δεν είχε χορηγηθεί. Η επεξεργασία των δεδομένων της σαρώσεως με ειδικό λογισμικό ανέδειξε 700 περίπου γονίδια που ρυθμίζονται θετικά ή αρνητικά σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις μικροσυστοιχίες, επιλέχθηκαν 34 γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε βασικές βιολογικές διεργασίες όπως πρωτεϊνοσύνθεση, κυτταρική σηματοδότηση, πολλαπλασιασμός, κυτταρική διαφοροποίηση, κυτταρικός θάνατος, φλεγμονή. Επιπρόσθετα, επιλέχθηκαν 22 γονίδια τα οποία έχουν επίσης κομβικό ρόλο σε σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταρικές λειτουργίες. Η επιλογή αυτή έγινε για να μελετηθεί πιο σφαιρικά η επίδραση των φαρμάκων σε βασικούς κυτταρικούς μοριακούς μηχανισμούς. Στο σύνολο των επιλεγμένων γονιδίων έγινε ποσοτική Real-Time PCR και για το σκοπό αυτό έγινε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών. Η qRT-PCR εν τέλει, επιβεβαίωσε τα αρ-χικά αποτελέσματα από τα microarrays. Διαπιστώθηκε ότι η κυτταρική απόκριση στη χορήγηση των ρετινοειδών, εξειδικευμένα για κάθε δραστική ουσία και για κάθε δόση δεν είναι μονοσήμαντη, αλλά ότι ταυτόχρονα επάγονται λειτουργικά μονοπάτια με διαφορετικούς ρόλους. Επίσης διαπιστώθηκε ότι η μεταβολή κατά δύο τάξεις μεγέθους της δόσης που προσλαμβάνουν τα κύτταρα επάγει αντίρροπες κυτταρικές αποκρίσεις. Συγκεκριμένα, η ολιστική προσέγγιση της μεταβολής της γονιδιακής έκφρασης ανέδειξε ότι η χορήγηση ATRA σε συγκέντρωση 10^-6Μ στις κυτταροκαλλιέργειες ευνοεί την πρωτεϊνοσύνθεση και την διαφοροποίηση των κυττάρων ενώ ασκεί αντιφλεγμονώδη δράση. Η χορήγηση της δραστικής ουσίας ATRA στη δόση 10^-8Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT σε μεγαλύτερο βαθμό από τον πολλαπλασιασμό τους. Επιπλέον, φαίνεται ότι σε αντίθεση με τη μεγαλύτερη δόση, ευνοείται η σύνθεση μορίων που επάγουν την φλεγμονή. Παρόμοια, η ασιτρετίνη στη δόση 10^-6Μ ευνοεί τη διαφοροποίηση των κυττάρων και την σύνθεση μορίων που επάγουν τη φλεγμονή. Η ασιτρετίνη στην μικρότερη δόση (10^-8 Μ) ευνοεί κύρια την διαφοροποίηση, λιγότερο τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και φαίνεται ότι προάγει σε σημαντικό βαθμό την απόπτωση. Οι μεγαλύτερες δόσεις των ρετινοειδών που μελετήθηκαν φαίνεται ότι είναι απαγορευτικές για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αντίθεση με τις μικρότερες δόσεις. Επισημαίνεται ότι για τη θεραπεία της ψωρίασης όπου χρησιμοποιούνται, επιθυμητές δράσεις είναι η παραγωγή μορίων με αντιφλεγμονώδη δράση, ο περιορισμός του αυξημένου κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αύξηση της κυτταρικής απόπτωσης και τέλος πολύ ση-μαντικό είναι η επιτυχής περάτωση της διαφοροποίησης των κυττάρων. Συμπερασματικά, η χρήση τεχνικών υψηλής απόδοσης, κύρια των μικροσυστοιχιών cDNA που επιτρέπουν την εκτεταμένη μελέτη του γονιδιώματος και της qRT-PCR για πιο στοχευμένη μελέτη, μπορούν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην εξακρίβωση μοριακών μηχανισμών. / In the current project we performed gene expression profiling, using cDNA microarrays, when specific doses of derivatives of retinoic acid were applied in HaCaT cell culture. These specific drugs are used in the treatment of psoriasis but their exact effect in molecular level remains elusive. All-trans retinoic acid and acitretin were applied in gradient doses. Cell viability was monitored using MTT and Trypan blue assays. Two specific doses (10^-6 & 10^-8 M), in which cell viability was approximately 80%, were chosen for the treatment of HaCaT cells. Subsequently, the treated cells were collected and RNA was extracted using standard methods. At a next step, RNA quality was examined by electrophoresis (Bioanalyzer) and spectrometry. High quality RNA showing no traces of degradation was used as template for in vitro transcription. Finally, synthesis of fluoro-labeled cDNA was performed from RNA derived from both treated and untreated samples and was immediately hybridized to DNA microarray slides (OneArray). Analysis of the hybridization data was performed using specific software. As a result, 700 genes (both up-regulated and down-regulated) were chosen for further analysis. Among them, 34 genes were chosen to validate the microarrays results by the use of quantitative Real-Time PCR. These genes appeared to play crucial role in basic cellular functions like protein synthesis, signal transduction, cell death, cell differentiation and proliferation. Furthermore, 22 additional essential genes that are related to the above processes were chosen in aim to examine drugs effects. The data processing revealed that the 10^-6 M dose of ATRA has a positive effect in protein synthesis, cell differentiation and anti-inflammatory action. Moreover ATRA at a concentration of 10^-8 M promotes differentiation more than proliferation and it has inflammatory effect as well as acitretin has in 10^-6 M dose. On the other, hand acitretin in 10^-8 M dose facilitates differentiation more than proliferation but mainly induces cell death. Generally, high doses (10-6 M) of the drugs inhibit cell proliferation more efficient than low doses (10-8 M). In fact, during psoriasis treatment, the anti-inflammatory action, inhibition of cell proliferation, induction of cell differentiation and cell death are considered desirable drug effects. Our study shows that cDNA microarray analysis represents a powerful tool that can be used for extended genomic studies and the results that are obtained can be validated and used for the elucidation of several molecular mechanisms.