Ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) είναι η κύρια αιτία της χρόνιας ηπατίτιδας. Το γενετικό υλικό του ιού είναι ένα μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας μήκους 9600 νουκλεοτιδίων, που κωδικοποιεί ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης. Στα 5’ και 3’ άκρα της κωδικής περιοχής υπάρχουν ιδιαίτερα συντηρημένες και με έντονη δευτεροταγή δομή μη μεταφραζόμενες περιοχές. Αντίθετα με το γενικό κανόνα, η έναρξη της μετάφρασης του γονιδιώματος πραγματοποιείται με το μηχανισμό της εσωτερικής πρόσδεσης του ριβοσώματος (IRES). Η αλληλουχία RNA που απαιτείται για τη λειτουργία IRES, περιλαμβάνει όλη την 5’ μη- μεταφραζόμενη περιοχή, εκτός της περιοχής I, και τα πρώτα 75 νουκλεοτίδια της κωδική περιοχής. Μέχρι τώρα είναι γνωστό ότι μέσω της HCV IRES εξαρτώμενης μετάφρασης εκφράζονται όλες οι δομικές και μη δομικές πρωτεΐνες του ιού. Με την βοήθεια δισιστρoνικών συστημάτων μελέτης έχει δειχθεί ότι η HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση του γονιδιώματος του ιού καταστέλλεται από την μη-δομική πρωτεΐνη NS5Α του ιού. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι α) να διερευνηθεί εάν η καταστολή αυτή της HCV IRES εξαρτώμενης μετάφρασης του ιού επηρεάζεται από την παρουσία των υπολοίπων μη δομικών πρωτεϊνών και β) να διερευνηθεί εάν το φαινόμενο αυτό παρατηρείται και στα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας Flaviviridae και συγκεκριμένα στον GBV-B ιό. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση του ιού που καταστέλλεται από την HCV NS5A δε μεταβάλλεται παρουσία των υπολοίπων μη δομικών πρωτεϊνών. Σε αντίθεση η GBV-B NS5A δε φαίνεται να έχει την ικανότητα καταστολής της μετάφρασης μέσω του ομόλογου GBV-B IRES / -

Πραγματοποιήσαμε πολυσταδιακή δειγματοληπτική έρευνα, προκειμένου να μελετήσουμε τον επιπολασμό και τις οδούς μετάδοσης της ηπατίτιδας Β και C στο γενικό πληθυσμό του Νομού Αχαΐας. Για το σκοπό αυτό εξετάσαμε αντιπροσωπευτικό δείγμα 1500 ατόμων χρησιμοποιώντας τρίτης γενιάς αντιδραστήρια. Δείκτες HBV μόλυνσης διαπιστώθηκαν σε 339 άτομα (22,6%) με επιπολασμό anti-HBc αντισωμάτων 21,6% (95%CI:19,5-23,8) και HBsAg αντιγόνου 2,1% (95%CI:1,5-3). Anti-HCV θετικά αντισώματα διαπιστώθηκαν σε 8 άτομα με ELISA-3 (0,5%, 95%CI:0,2-1,1), από τα οποία 5 (62,5%) επιβεβαιώθηκαν με LIA-3 και 3 (37,5%) είχαν PCR θετική. Συλλοίμωξη ή παρελθούσα μόλυνση και από τους δύο ιούς ανιχνεύτηκε σε 5 άτομα (0,3%). Από τη στατιστική σύγκριση που έγινε διαπιστώθηκε αυξημένη HBV μόλυνση σε στατιστικά σημαντικό βαθμό στους άνδρες, στους πλέον ηλικιωμένους, στους εγγάμους/διαζευγμένους/χήρους, σε άτομα χαμηλότερου επιπέδου μόρφωσης, με >2 παιδιά, με συγκατοίκηση <2 άτομα καθώς και στις ορεινές και αγροτικές περιοχές έναντι των αστικών και πεδινών. Επίσης, το θετικό περιβάλλον, η κατάχρηση αλκοόλ, η ύπαρξη σεξουαλικών σχέσεων και η μη χρήση προφυλακτικού τόσο με τον περιστασιακό όσο και με το μόνιμο σύντροφο ήταν παράγοντες κινδύνου της μόλυνσης από ιό Β. Αντίθετα, δε βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά HBV μόλυνσης σε σχέση με τις μεταγγίσεις και τη νοσηλεία >1d. Από την άποψη της επαγγελματικής κατανομής της Β μόλυνσης, ιδιαίτερα επιβαρημένη ήταν η αγροτική και η εργατική τάξη. Πάντως, από την πολυπαραγοντική ανάλυση που ακολούθησε μόνο το άρρεν φύλο (ΣΚ 4,1, 95%CI:2,4-7,1), η αυξημένη ηλικία (≥30 ετών ΣΚ 9, 95%CI:4,2-19,4) και το θετικό περιβάλλον (ΣΚ 1,3, 95%CI:0,9-1,8) είχαν ανεξάρτητη σχέση με την HBV μόλυνση. Η γενετήσια και η ενδοοικογενειακή οδός αποτελούσαν τους συχνότερους τρόπους διασποράς του ιού Β, ενώ η παρεντερική οδός ήταν η κυρίαρχη στην μετάδοση του ιού C. Χρόνια ηπατίτιδα Β διαπιστώθηκε στο 9,5% των HBsAg θετικών που ελέγχτηκαν στο Τμήμα Λοιμώξεων (σε κανέναν δεν ανιχνεύτηκε HBV-DNA ιαιμία), ενώ το 60% των επιβεβαιωμένων anti-HCV θετικών έπασχε από χρόνια ηπατίτιδα C. Εμβολιασμό έναντι της ηπατίτιδας Β δήλωσαν 183 άτομα (12,2%), στο 85,8% μαθητές και H.C.W, και anti-HBs>10mIU/ml ανιχνεύτηκαν στο 83,6%. Τέσσερα άτομα (2,2% των εμβολιασθέντων) παρουσίασαν και δείκτες παρελθούσας HBV μόλυνσης. Η «αποτυχία» του εμβολίου υπολογίστηκε στο 7,5%. Οι άνδρες, παρά τον τετραπλό κίνδυνο μόλυνσης, εμβολιάζονταν σε μικρότερο βαθμό συγκριτικά με τις γυναίκες, ενώ δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά εμβολιασμού μεταξύ αυτών που είχαν θετικό και αρνητικό περιβάλλον. Συμπερασματικά, ο Νομός Αχαΐας κατατάσσεται στις ενδιάμεσης ενδημικότητας περιοχές όσον αφορά στην ηπατίτιδα Β και στις χαμηλής ενδημικότητας όσον αφορά στην ηπατίτιδα C. Οι κύριοι οδοί μετάδοσης είναι η γενετήσια και η ενδοοικογενειακή για τον ιό Β και η παρεντερική για τον ιό C. Παρά την πολύ μικρή συχνότητα στο γενικό πληθυσμό και λόγω του υψηλού ποσοστού μετάπτωσης σε χρονιότητα, η ηπατίτιδα C παίζει όχι μόνο εξίσου σημαντικό αλλά ίσως και πρωταγωνιστικό ρόλο στη νοσηρότητα από χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια στην περιοχή μας. Ειδικά για την ηπατίτιδα Β, η υιοθέτηση του μαζικού εμβολιασμού θα αλλάξει το επιδημιολογικό τοπίο, αλλά χρειάζεται παράλληλα πιο ικανοποιητική κάλυψη των ομάδων υψηλού κινδύνου. / A community-based survey was conducted using the multistage random sampling method, in order to determine the prevalence and routes of transmission of hepatitis B and C in the general population of Achaia region in the Southwestern Greece. For this purpose we examined a representative sample of 1500 individuals using third generation assays. HBV infection markers were detected in 339 subjects (22,6%) with anti-HBc prevalence 21,6% (95%CI:19,5-23,8) and HBsAg prevalence 2,1% (95%CI:1,5-3). Anti-HCV antibodies were detected in 8 subjects with ELISA-3 (0,5%, 95%CI:0,2-1,1), 5 of which (62,5%) were confirmed with LIA-3 and 3 (37,5%) were HCV-RNA positive. Dual or past infection with both viruses was detected in 5 subjects (0,3%). Male sex, older age, married/divorced/widowed family status, lower level of education, more than two children, cohabitation with less than two persons, positive environment, alcohol abuse, sex, absence of condom prophylaxis during sexual intercourse with single or multiple partners were all risk factors for HBV infection (statistically significant). On the contrary, there was not significant difference between HBV-negative and HBVinfected individuals when transfusions or hospitalization >1d were concerned. Workers and people in the agricultural sector were particularly affected. Nevertheless, multivariate statistical analysis revealed that male sex (RR 4,1, 95%CI:2,4-7,1), older age (≥30y RR 9, 95%CI:4,2-19,4) and positive environment (RR 1,3, 95%CI:0,9-1,8) were the only independently associated with HBV infection risk factors. Sexual and intrafamiliar exposure were the commonest ways for HBV transmission, while percutaneous exposure was the main route for HCV transmission. Chronic hepatitis B was diagnosed in 9,5% of HBsAg carriers who were examined by the physicians of the Department of Infectious Diseases (nobody was HBV-DNA positive), while 60% of those with confirmed anti-HCV antibodies had chronic hepatitis C. 183 subjects declared B immunization (12,2%), mostly pupils and health care workers (85,8%), and anti-HBs>10mIU/ml were detected in 83,6% of them. Four (2,2%) had, also, positive markers of past HBV infection. Vaccination failure was estimated at 7,5%. Men, despite their fourfold risk of infection, were immunized at a lower rate than women, while there was not significant difference in immunization rate between those with positive and negative environment. In conclusion, Achaia region can be classified as an intermediate HBV and a low HCV endemicity area. The main routes of HBV and HCV transmission are the sexual/intrafamiliar and percutaneous respectively. Despite the very low prevalence of hepatitis C and due to its higher range of chronicity, the number of chronically HBV and HCV infected in the general population seem to be comparable and, even, hepatitis C can play a leading role in chronic viral liver disease in our region. As far as hepatitis B is concerned, the adoption of mass immunization programmes will alter the epidemiological landscape and this should be especially encouraged in persons belonging to high risk groups.

- / -

H λοίμωξη που προκαλείται απο τον ιό της ηπατίτιδας C HCV είναι μείζον πρόβλημα για την δημόσια υγεία όπως επίσης και η κύρια αιτία της χρόνιας ηπατικής νόσου και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, με περίπου 180 εκατομμύρια μολυσμένα άτομα σε όλο τον κόσμο. Ο HCV είναι ένας RNA ιός θετικής πολικότητας που ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας των Flaviviridae. Έξι γονότυποι ( 1-6 ) είναι γνωστοί, καθένας από τους οποίους μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε αρκετές υποτύπους. Το γονιδίωμα του HCV αποτελείται από ένα μεγάλο ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF), πλαισιωμένο από ιδιαίτερα δομημένες 5 'και 3' αμετάφραστες περιοχές (UTRs). Και οι δύο περιοχές UTRs είναι συντηρημένες και έχουν τον έλεγχο της ιογενούς μετάφρασης και αναπαραγωγής. Το 5' UTR του HCV περιέχει μια περιοχή IRES απο την οποία γινεται η έναρξη της cap ανεξάρτητης μετάφρασης του ιικού RNA. Η HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση του ORF παράγει μια ενιαία πρόδρομη πολυπρωτεΐνη που μεσω μετα-μεταφραστικής τροποποίησης από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες, οδηγεί στην ωρίμανση δομικών και μη δομικών πρωτεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι διαφορετικές κυτταρικές ή ιικές πρωτεΐνες μπορούν να ρυθμίσουν την ενεργότητα του HCV IRES. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η κατανόηση της ρύθμισης της HCV IRES εξαρτώμενης μετάφρασης. Πρώτον, προσπαθήσαμε να ορίσουμε το ρόλο των ιικών πρωτεϊνών στην HCV IRES εξαρτώμενη μετάφραση που παραμένει αμφιλεγόμενος. Σαφώς, οι μελέτες μας έδειξαν ότι η HCV NS5A ρυθμίζει αρνητικά την ενεργότητα του IRES με κύτταρο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπρόσθετα, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η ενεργοποιημένη PKR ρυθμίζει θετικά την ενεργότητα του IRES ενώ η καταστολή της έκφρασης της ενδογενούς PKR έχει το αντίθετο αποτέλεσμα. Επιπλέον, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η NS5A μεσολαβεί ανασταλτικά στην IRES-εξαρτώμενη μετάφραση και συνδέεται με την αδρανοποίηση της PKR. Τέλος στην παρούσα εργασία ερευνήσαμε τη ρύθμιση της ενεργότητας του HCV IRES σε συνθήκες χαμηλού οξυγόνου, δεδομένου ότι υποξικές περιοχές εντοπίζονται στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο (HCC) και συνδέονται με την ύπαρξη ενός εναλλακτικού προφίλ κυτταρικής μετάφρασης Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η HCV IRES-εξαρτώμενη μετάφραση ρυθμίζεται αρνητικά σε υποξικές συνθήκες και μάλιστα με κύτταρο-εξαρτώμενο τρόπο. / HCV infection is a major public health problem and a leading cause of chronic liver disease and hepatocellular carcinoma, with approximately 180 million infected individuals worldwide. HCV is a positive sense RNA virus that belongs to the genus hepacivirus of the Flaviviridae family. Six major HCV genotypes (1–6) are known, each of which can be further subdivided into several subtypes (1a, 1b, 2a, etc). The HCV genome consists of a large open reading frame (ORF), flanked by highly structured 5’ and 3’ untranslated regions (UTRs). Both UTRs are conserved and control viral translation and replication. The HCV 5'-UTR contains an IRES that initiates cap-independent translation of the viral RNA. IRES-mediated translation of the HCV ORF yields a single polyprotein precursor that is co- and post-translationally processed by cellular and viral proteases, giving rise to mature structural and non structural proteins. Several studies have suggested that different cellular non canonical proteins or viral proteins can regulate the HCV IRES activity. The aim of this study was to understand the regulation of the HCV IRES dependent translation. Firstly, we tried to delineate the role of the viral proteins on HCV IRES dependent translation that still remains controversial. Clearly our studies demonstrated that HCV NS5A down-regulates IRES activity in a cell-type dependent manner. Additionally, we provide strong evidence that activated PKR up-regulates the IRES activity while silencing of endogenous PKR had the opposite effect. In addition, we concluded that the NS5A-mediated inhibitory effect on IRES-dependent translation was linked with the PKR inactivation. Moreover, as it is already reported that localised hypoxic areas are continuously present in HCC due to its high proliferation rate leading to an altered translation pattern, we investigated modulation of HCV IRES activity under low oxygen settings. Our results provided preliminary evidence that HCV-IRES-dependent translation is negatively regulated by low oxygen levels or under hypoxia-mimicking conditions in cell-specific manner.

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) είναι η πιο σημαντική πρωτοπαθής νεοπλασία του ήπατος παγκοσμίως. Πολλοί αιτιολογικοί παράγοντες έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη του ΗΚΚ, όπως η κίρρωση, οι ιοί της ηπατίτιδας και το αλκοόλ. Χρόνια λοίμωξη με ηπατίτιδα Β (HBV) και C (HCV) συχνά καταλήγει σε κίρρωση και ενισχύει την πιθανότητα ανάπτυξης ΗΚΚ. Ωστόσο οι υποκείμενοι μηχανισμοί που οδηγούν στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Ο HBV είναι ένας DNA ιός που ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή και θεωρείται ότι με τον τρόπο αυτό προκαλεί καρκινογένεση. Επιπρόσθετα, ο ιός κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 17 kDa,την HBx, η οποία είναι γνωστό ότι αποτελεί αιτιολογικό παράγοντα ανάπτυξης ΗΚΚ. Η παρούσα ανασκόπηση αναλύει το ρόλο της HBx στους μοριακούς μηχανισμούς που σχετίζονται με την παθογένεση της επαγόμενης από τον HBV ηπατικής καρκινογένεσης. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most important primary hepatic cancer, being a common cancer type worldwide. Many aetiological factors have been related with HCC development, such as cirrhosis, hepatitis viruses and alcohol. Chronic infection with hepatitis B (HBV) and C viruses (HCV) often results in cirrhosis and enhances the probability of developing HCC. The underlying mechanisms that lead to malignant transformation of infected cells, however, remain unclear. HBV is a DNA virus that integrates into the host genome, and this integration is believed, in part, to be carcinogenic. Besides, the virus encodes a 17 kDa protein, HBx, which is known to be a causative agent in the formation of HCC. This review examines the role of HBx in the molecular mechanisms involved in the pathogenesis of HBV-induced hepatocarcinogenesis.

- / -

Η πολυλειτουργική πρωτεΐνη core του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) εμπλέκεται στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) που προκαλείται από τον ιό της ηπατίτιδας C, αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο συμβαίνει αυτό δεν είναι κατανοητός. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt/ β-κατενίνη, παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ηπατοκυττταρικού καρκίνου, και τροποποιείται από την πρωτεΐνη core του ιού της ηπατίτιδας C. Ο ιός της ηπατίτιδας C χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη γενετική ποικιλομορφία και διαφορετικά κλινικά δείγματα διαφέρουν όσον αφορά την μολυσματικότητα τους και την παθογένεια που προκαλούν. Σκοπός αυτής της μελέτης είναι να καθοριστεί ο ρόλος της γενετικής ποικιλομορφίας της πρωτεΐνης HCV core στην ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt/ β-κατενίνη και να μελετηθεί ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο η πρωτεΐνη HCV core ρυθμίζει την ενεργοποίηση αυτή. Η ενεργότητα του μονοπατιού Wnt/β-κατενίνη μελετήθηκε σε HEK 293T και Huh 7.5 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν παροδικά τις πρωτεΐνες core των γενοτύπων 1a, 1b, 3a, 4a, 4f και από ένα μοναδικό δείγμα του γενοτύπου 1a που προέρχεται από έναν ασθενή από την Καμπότζη (1aCam). Μελέτες βασισμένες στη μέτρηση ενεργότητας της λουσιφεράσης, Western blot ανάλυση και qPCR, χρησιμοποιήθηκαν για την μέτρηση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων και πρωτεϊνών. Βρέθηκε ότι η HCV core πρωτεΐνη ρυθμίζει θετικά την μεσολαβούμενη από τη β-κατενίνη Tcf-εξαρτώμενη ενεργότητα της λουσιφεράσης σε ένα γενοτυπο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε συμφωνά με τα αποτελέσματα αυτά βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη HCV core σταθεροποίει τα επίπεδα της β-κατενίνης, τόσο σε παροδικά μετασχηματισμένα κύτταρα, όσο και σε κύτταρα που μολύνονται με βακουλοϊούς που εκφράσουν τις πρωτεΐνες core των υποτύπων 4a και 4f. Τέλος, βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη HCV core συμβάλει στην θετική ρύθμιση των γονιδίων c-myc, αξίνης και Tbx3, τα οποία είναι καθοδικά γονίδια στόχοι του μονοπατιού Wnt/β-κατενίνη και εμπλέκονται στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Συμπερασματικά, οι πρωτεΐνες HCV core διαφορετικών γενοτύπων του ιού ρυθμίζουν διαφορετικά το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt/β-κατενίνη και η διαφορετική αυτή ρύθμιση μπορεί να σχετίζεται με ικανότητα των διαφόρων γενοτύπων του ιού της ηπατίτιδας C να επάγουν την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. / The multifunctional HCV core protein is implicated in the development of hepatocellular carcinoma (HCC) caused by HCV infection, but the underlying mechanism is not fully understood. Activation of the Wnt/ β-catenin pathway plays a major role in HCC and is modulated by the HCV core protein. HCV is characterized by extensive genetic diversity and different clinical isolates do vary in their infectivity and pathogenesis mainly due to variations in the structure/function relationships of individual viral proteins. The aim of this study is to determine the possible influence of genetic variability in HCV core protein in enhancing the Wnt/ β-catenin signaling activity and to elucidate the molecular mechanisms by which HCV core modulates activation of β-catenin. The Wnt/β-catenin activity was investigated in transiently transfected HEK 293T and Huh 7.5 cell lines transiently expressing HCV core proteins from HCV genotypes 1a, 1b, 4a, 4f and from a unique isolate of genotype 1a obtained from a Cambodian patient (1aCam). Luciferase-based reporter assay, Western blot, and qPCR, were used to measure gene and protein expression levels. We found that, HCV core protein upregulates β-catenin-mediated Tcf-dependent luciferase activity in a genotype specific manner. Consistent to these findings, HCV core stabilizes β-catenin levels. Finally, we showed that HCV core contributes to the upregulation of Tbx3 gene expression, a downstream target gene of Wnt/ β-catenin pathway contributing to HCC development. In conclusion, HCV core protein from different genotypes appears to differentially regulate the Wnt/β-catenin signaling pathway and this finding may contribute to different potential of HCV genotypes to induce HCC.

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) perturbe le métabolisme lipidique de son hôte. En effet, les particules virales sont hétérogènes mais les plus infectieuses sont celles retrouvées aux plus basses densités du fait de leur association avec des composants des lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines riches en triglycérides (TG) et contenant l’apolipoprotéine B (ApoB) produites par les hépatocytes ; ces complexes sont appelés lipo-viro-particules (LVP). De plus, les malades présentent fréquemment une stéatose hépatique, c'est-à-dire une accumulation de TG dans les gouttelettes lipidiques (GL) des hépatocytes, qui stockent les lipides neutres au sein d’une monocouche de phospholipides essentiellement constitués de phosphatidylcholine. Notre hypothèse de travail est que le VHC usurpe le métabolisme lipidique des hépatocytes au profit de la production de LVP. Une étude publiée au début de mon travail de thèse a révélé que la lysophosphatidylcholine acyltransférase 1 (LPCAT1) catalyse la synthèse de phosphatidylcholine directement à la surface des GL, avec pour conséquence un remodelage de ces dernières. Cela nous a incités à examiner si cette voie est détournée par le VHC, puis à déterminer le rôle de LPCAT1 à la fois dans le métabolisme lipidique des hépatocytes et dans le cycle infectieux du VHC. Lors de l’infection de novo par le VHC, les cellules de la lignée hépatocytaire Huh-7.5.1 et les hépatocytes humains en culture primaire (HHP) présentaient une diminution de l’expression de l’ARNm et de la protéine LPCAT1, suggérant une régulation transcriptionnelle de cette enzyme par le VHC. L’extinction de LPCAT1 en cellules Huh- 7.5.1, infectées ou non, induisait une diminution du nombre des GL accompagnée d’une augmentation de leur taille, suggérant une fusion des GL, ainsi qu’une accumulation intracellulaire de TG à l’état d’équilibre, donc une stéatose. La sécrétion des TG néosynthétisés et de l’ApoB était également augmentée, témoignant d’une augmentation de la production de VLDL. Dans les cellules Huh-7.5.1 et les HHP infectés par le VHC, l’extinction de LPCAT1 n’affectait pas la réplication du génome viral mais augmentait la production de virus infectieux, indiquant un effet sur la morphogenèse du VHC. De plus, les particules virales produites avaient une infectiosité spécifique supérieure corrélant avec une densité plus basse, des propriétés caractéristiques des LVP. En conclusion, le VHC diminue l’expression de LPCAT1, une enzyme associée aux GL des hépatocytes, ce qui apparaît comme une stratégie virale permettant d’augmenter le contenu en TG, et de là l’infectiosité spécifique des particules virales néoformées. Cibler la voie du métabolisme lipidique contrôlée par LPCAT1 représenterait une approche thérapeutique intéressante, car susceptible de réduire à la fois le titre viral et la stéatose hépatique. / No abstract

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας παρατηρείται ένα προοδευτικώς αυξανόμενο ενδιαφέρον για την διερεύνηση της ύπαρξης ή μη συσχέτισης, ανάμεσα στην γενετική ποικιλομορφία της περιοχής του πυρηνικού υποκινητή (Core Promoter, CP, 1700-1849), της προπυρηνικής περιοχής (Precore, PC, 1814-1901) και της περιοχής του κυρίως πυρηνικού αντιγόνου (Core, 1901-2450) του ιού της Ηπατίτιδας Β, τόσο σε νουκλεοτιδικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, και στην κλινική εικόνα της Οξείας ή Χρόνιας Ηπατίτιδας Β, την πιθανότητα εξέλιξης και το ρυθμό εξέλιξης της χρόνιας HBV λοίμωξης σε Χρόνια Ενεργό Ηπατίτιδα, Κίρρωση του Ήπατος και Ηπατοκυτταρικό Καρκίνωμα (ΗΚΚ). Στόχοι Έρευνας: Λαμβάνοντας υπόψη όλες τις προηγουμένως δημοσιευθείσες εργασίες και δεδομένης της ολοένα και αυξανόμενης σημασίας που αποκτά η γενετική ποικιλομορφία της περιοχής του πυρηνικού αντιγόνου στην εξέλιξη της χρόνιας HBV λοίμωξης, προχωρήσαμε σε ανάλυση της γονιδιακής αλληλουχίας των περιοχών του κυρίως πυρηνικού υποκινητή , και της προπυρηνικής περιοχής καθώς και σε ανάλυση της γονιδιακής και πρωτεϊνικής αλληλουχίας του πυρηνικού αντιγόνου σε στελέχη του ιού που απομονώθηκαν από 23 Χρόνιους Ασυμπτωματικούς Φορείς (ΧΑΦ) του ιού HBV, χρησιμοποιώντας ως μάρτυρες (controls) στελέχη του ιού που απομονώθηκαν από 4 ασθενείς με Χρόνια Ενεργό Ηπατίτιδα Β (ΧΕΗΒ) προ της ενάρξεως οποιασδήποτε θεραπευτικής αγωγής και κλωνοποιήθηκαν. Οι στόχοι της παρούσας έρευνας συνοψίζονται ως εξής: α) Να καταγράψουμε το σύνολο των μεταλλάξεων στις υπό μελέτη περιοχές και το σύνολο των αμινοξικών αντικαταστάσεων στο πυρηνικό αντιγόνο χωρίς να εστιάσουμε μόνο σε 3-4 μεταλλάξεις οι οποίες αποτέλεσαν μεμονωμένο αντικείμενο μελέτης στην συντριπτική πλειονότητα των έως τώρα δημοσιευμένων ερευνών, β) Να εξακριβώσουμε την συχνότητα εμφάνισης κάθε μετάλλαξης και πως αυτή διαφοροποιείται ανάλογα με την κλινική κατάσταση και το ορολογικό προφίλ των ασθενών, τον γονότυπο, και τον υπότυπο του ιού, γ) να προτείνουμε ένα ακριβές προφίλ μεταλλάξεων και αμινοξικών αντικαταστάσεων που χαρακτηρίζει τους ΧΑΦ και να δείξουμε πως αυτό διαφοροποιείται στους ασθενείς με ΧΕΗΒ, δ) Να ερευνήσουμε την ποσοτική αλλά και ποιοτική επίπτωση των διαπιστούμενων, στην κωδικοποιούσα το πυρηνικό αντιγόνο αλληλουχία, νουκλεοτιδικών αλλαγών επί της αμινοξικής αλληλουχίας του πυρηνικού αντιγόνου, και πως αυτή επηρεάζει την σύσταση των αντιστοίχων επί του πυρηνικού αντιγόνου αντιγονικών επίτοπων, ε) Να προτείνουμε νέες τεχνικές απομόνωσης ιικού DNA και πολυμερισμού τμημάτων του ιικού γονιδιώματος σε ασθενείς με πολύ χαμηλά επίπεδα ιαιμίας, όπως οι ΧΑΦ, στ) Να επιβεβαιώσουμε ή να αντικρούσουμε τα δεδομένα της διεθνούς βιβλιογραφίας, που αφορούν στην συχνότητα εμφάνισης μεταλλάξεων και την εντόπιση τους στις υπό μελέτη περιοχές, την διαφοροποίηση αυτών μεταξύ διαφορετικών κατηγοριών ασθενών, διαφορετικών γονότυπων και διαφορετικών υπότυπων του αυτού γονότυπου του ιού. / Infection with HBV may lead to a wide spectrum of liver disease that ranges, in acute infection from mild self-limited to fulminant hepatitis, and in persistent infection from an ASC state to severe chronic hepatitis, cirrhosis and HCC. Several host factors are important in determining outcome, including age at infection, immune competence and MHC haplotype. Viral factors may also play an important role. Over the past decade, there has been considerable interest in whether certain genetic variants of HBV are associated with increased pathogenicity, such as the development of acute liver failure and progression of persistent infections to Chronic Active Hepatitis B, Liver Cirrhosis and Hepatocellular Carcinoma. Aims We proceeded to the sequencing of the entire CP, PC and Core regions of the HBV genome and the analysis of the Molecular variation in them in HBV isolates derived from 23 ASCs and 4 patients with CHB. 17 ASCs were Greeks (genotype D [ayw3]) and 6 were Chinese (Genotype C [ayr]) while all CHB patients were Greeks (though 3 of Genotype D ayw3 and 1 of Genotype D ayr). Our ultimate aims were the identification of all nucleotide and amino acid substitutions within the aforementioned regions and Core protein, respectively, and the demonstration of the differential presentation, distribution and frequency patterns of these substitutions and their respective combinations, in terms of clinical, virological and immunological characteristics of the patients.

L'hépatite B chronique reste un problème majeur de santé publique. Sous traitement par analogues nucléos(t)idiques (NUCs), l'objectif thérapeutique ultime est la clairance de l'antigène (Ag) HBs. Nous avons étudié l'influence de la variabilité des protéines d'enveloppe, impliquées dans l'entrée cellulaire du virus et cibles de la réponse immune, sur la clairance de l'Ag HBs. Des patients traités par NUCs ayant obtenu une clairance de l'Ag HBs (resolvers) ont été appariés à des non-resolver. Deux mutations combinées sT125M/sP127T, caractéristiques des non-resolver, étaient associées à une baisse de l'antigénicité prédite. L'analyse par séquençage haut débit montrait une plus grande variabilité du gène S chez les non resolver. Des tests fonctionnels portant sur des particules virales mutées en sT125M et sP127T sont en cours. Ces données moléculaires sont en faveur de l'existence de "motifs" spécifiques dans le gène S associés à la persistance de l'Ag HBs sous traitement par NUCs / Hepatitis B virus (HBV)-related chronic infection remains difficult to eradicate. On treatment by nucleos(t)ide analogues (NUCs), HBs Antigen (Ag) clearance is the ultimate but difficult therapeutic goal. Our aim was to investigate how variability of HBV envelope protein, crucial in viral cellular entry and targeted by host immune response, could play a role in HBsAg clearance. HBV chronically infected patients, treated by NUCs with HBsAg clearance (resolver) were matched with patients without HBsAg clearance (non resolver). Combined mutations sT125M/sP127T, associated with HBsAg persistence, displayed a lower predicted antigenicity. Ultra Deep Sequencing of S gene showed a higher variability in non resolver. Functional assays on viral particles including sT125M and sP127T mutations versus reference particles are in progress. As a conclusion, molecular features observed in non NR argue in favor of a different pattern in HBV S characteristics according to variable NUCs efficiency