Le virus de l’hépatite C (HCV) est l’agent responsable de l’hépatite C, maladie qui touche environ 3% de lapopulation mondiale. Une des caractéristiques de cette infection est son évolution dans 60 à 90% des casvers des formes chroniques avec des complications sévères telles que la cirrhose et le carcinomehépatocellulaire. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le HCV est l’absence de systèmes decultures in vitro efficaces et de modèles animaux adaptés car le HCV n’infecte que l’homme et le chimpanzé.l’anticorps D32.10. Pour cela, nous avons développé un test de cellbindinget nous avons montré quel’interaction des particules virales sériques (HCVsp) radiomarquées à l’Iode 125 avec les celluleshépatocytaires (Huh‐7 et HepaRG) est spécifique et saturable impliquant des sites de haute et faible affinité.De plus, l’anticorps D32.10 est capable d’inhiber spécifiquement et efficacement les interactions de hauteaffinité entre les HCVsp et les cellules HepaRG avec une IC50 ≤ 0,5 μg/ml. Nous avons mis en évidence quel’inhibition est plus efficace lorsque nous utilisons sélectivement une population de particules HCVenveloppées exprimant fortement E1E2. Récemment, nous avons développé un système d’infection originaldes cellules HepaRG qui sont des cellules progénitrices du foie par les HCVsp et avons montré quel’infection, la réplication et la propagation dépendent de l’état de prolifération/différenciation de cescellules. Nous avons aussi démontré que les particules virales produites dans ce système contiennent del’ARN viral, expriment les protéines d’enveloppe E1E2 et sont infectieuses. Des études préliminairesmontrent que l’anticorps D32.10 inhibe fortement l’infection (95% à 80% aux jours 14 et 21 aprèsinfection) vraisemblablement au niveau des étapes précoces du cycle viral.Dans un second temps, nous avons recherché la prévalence des anticorps de même spécificité que le D32.10(anti‐E1E2A,B) dans différents groupes de patients HCV positifs afin de déterminer leur significationbiologique. Par un test ELISA utilisant les peptides biotinylés E1, E2A et E2B dans la phase de capture, nousavons démontré que la réponse anticorps anti‐E1E2A,B était présente dans 90% des cas chez les patientsqui guérissent spontanément avec des titres élevées (≥ 1/1000). Cette réponse humorale est absente ourare (< 10%) chez les patients porteurs chroniques non traités ou non répondeurs aux traitementsantiviraux. Une étude longitudinale a été réalisée chez des patients non répondeurs ou répondeursdéveloppant une réponse virologique soutenue à une bithérapie standard, interféron pégylé plus ribavirine.L’analyse statistique des résultats a montré que les anticorps anti‐E1E2A,B pouvaient être prédictifs de laréponse au traitement avec une spécificité et une valeur prédictive positive de 100%.La convergence des résultats in vitro et in vivo supporte un rôle neutralisant de l’anticorps monoclonalD32.10, permettant d’envisager son utilisation en immunothérapie. / Hepatitis C Virus (HCV) is the major etiological agent of liver disease in the world with approximately180 million people who are seropositive. The majority (60‐90%) of infected individuals progressesto chronic hepatitis that increases their risk for developing cirrhosis and hepatocellular carcinoma.One of the major limitations of HCV research is the lack of efficient in vitro culture systems andappropriateanimal models. vitro direct cell‐binding assay and an infection system of the human HepaRG cell line were developedby using HCVsp. The HepaRG cells possess potent ability to acquire a mature hepatocyte phenotype.The E1E2‐specific mAb D32.10 was shown to inhibit efficiently and specifically high affinityinteractionsthrough glycosaminoglycans and the CD81 tetraspanin between HCVsp and HepaRGcells with an IC50 = 0.5 μg/ml. This inhibition was more efficient when E1E2‐positive envelopedHCVsp were used selectively for binding studies (IC50 < 0.5 μg/ml). Establishment of infection,replication and propagation of HCVsp were shown to depend on the proliferation/differentiationstage of HepaRG cells. Persistent HCV infection in HepaRG cells could be obtained with production ofE1E2/RNA(+) infectious HCV particles. Preliminary data showed a complete early inhibitory effect ofthe D32.10 mAb on virion RNA production in HepaRG culture supernatants (95% at D14 and 80% atD21 post‐infection).Furthermore, the detection of the anti‐E1E2/D32.10‐binding peptide antibodies during natural HCVinfection demonstrated significant prevalence (90%) of these antibodies: (1) in patients whorecovered spontaneously from HCV infection with high titers compared to patients with chronichepatitis C, and (2) in patients who are complete responders compared to non responders toantivirals. Kinetic analyses revealed that the anti‐E1E2/D32.10‐like humoral response appeared veryearly with high titers (≥ 1/1000) and was associated with complete virus eradication. The positiveand negative predictive values (ROC curve analysis) for achieving or not a sustained viral response toantiviral therapy are 100% and 86%, respectively, reflecting diagnostic accuracy. The anti‐E1E2/D32.10‐binding peptide antibodies may thus predict the outcome of HCV infection andrepresent a new relevant pronostic marker in serum for the HCV diagnosis.Convergence of in vitro and in vivo data strongly support the neutralizing activity of the D32.10 mAb,and thus immunotherapeutic potential of this unique anti‐E1E2 D32.10 mAb.

Les variants viraux impliqués dans la transmission du VHC ont rarement été étudiés en raison des difficultés rencontrées pour recruter des patients au stade de la primo-infection. Pour mener cette étude, nous avons analysé le goulot d’étranglement génétique subit par les quasi-espèces virales au cours de 3 accidents d’exposition au sang impliquant des représentants du personnel soignant contaminés par piqûre d’aiguille. En utilisant la technique d’amplification de génomes uniques nous avons obtenu les gènes codant les glycoprotéines d’enveloppe virales E1E2 des variants viraux présents dans ces quasi-espèces. Ces gènes ont été séquencés et soumis à une analyse phylogénétique. Nous avons ensuite pu étudier les propriétés phénotypiques des glycoprotéines d’enveloppe dérivées de variants qui apparaissent au stade très précoce de l’infection. Pendant cette période, le VHC pourrait être plus vulnérable à l’élimination par des vaccins préventifs ou par des immunothérapies. / Little is known about the transmitted variants responsible for the spread of HCV infection, principally because of the difficulties to recruit patients early enough in infection. To address this issue, we proposed to track the genetic bottleneck event in HCV quasispecies, leading to productive clinical infection in three health care workers accidentally contaminated through needlestick accidents. By using a single genome amplification (SGA) approach we identified genes coding the viral envelope glycoprotein E1E2 which composed these quasispecies. The E1E2 sequences were then directly sequenced and subjected to a phylogenetic analysis. By cloning these full-length E1E2 sequences, we investigated the phenotypic properties of the envelope glycoproteins potentially involved in selective HCV transmission and early stage of infection, a period during which the virus might be most vulnerable to elimination by preventive vaccines or immunotherapies.

La problématique de la neutralisation par les anticorps constitue un enjeu majeur dans la perspective de la conception d’un vaccin efficace contre le VIH et les connaissances récemment acquises conforte NT l’absolue nécessité de maintenir une recherche cognitive fondamentale sur le sujet. L’un des objectifs de ce travail de thèse a été de documenter les propriétés biologiques en terme de sensibilité à la neutralisation de variants présents chez certains patients asymptomatiques à long terme (ALT) et présentant des caractéristiques particulières. Nous avons pu identifié certains déterminants moléculaires associés à la sensibilité ou à la résistance à l’anticorps monoclonal 2G12 tels le site potentiel de glycosylation (PNGS) en position N302 et la longueur de la boucle V1V2 du gène env. Nous avons ensuite caractérisé la relation entre l’évolution du gène env et la sensibilité à la neutralisation dans un contexte d’évolution tardive chez un patient ALT. Ces travaux ont permis de mettre en évidence une poursuite de l’évolution du gène env plus de 10 ans après l’infection et ceci malgré la présence d’anticorps largement neutralisants et d’une réponse autologue croissante au cours du temps. Le contexte de la transmission mère enfant (TME) constitue un modèle de choix afin d’étudier le rôle des anticorps neutralisants. Afin d’identifier d’éventuels corrélats de protection, mon travail a consisté à étudier la réponse neutralisante dans une population de 114 couples mères-enfants. Nous avons pu confirmer que le spectre de neutralisation des sérums maternels n’était pas associé à une moindre TME du VIH-1, mais que les anticorps neutralisant certains isolats pourraient constituer des indicateurs d’intérêt associé à un moindre risque de transmission. L’ensemble de ces travaux souligne à nouveau la complexité et la pertinence à poursuivre les investigations relatives à l’identification d’éventuels corrélats de protection. / Basic research on neutralizing antibodies. still remains relevant in term of HIV vacccine development. One of the aim of this thesis was to document the neutralization sensitivity of particular HIV-1variants from long term non progressor (LTNP) patients. We first identified molecular signatures associated with sensitivity to 2G12, such as a potential N-linked glycosylation site (PNGS) at N302 and a longer V1V2 loop of gp120. We also studied the relationship between long-term evolution of the virus and neutralization sensitivity in a LTNP patient. We showed that HIV-1 may continue to evolve in presence of both broadly neutralizing antibodies and increasing autologous neutralizing activity more than 10 years post-infection. Mother-to-child transmission provides a natural model for studying the role of neutralizing antibodies. In previous studies, we showed that the presence or high titers of neutralizing antibodies against a CRF01_AE strain, MBA, was associated with a lower rate of HIV-1 intrapartum transmission in Thailand (Barin et al., 2006; Samleerat et al., 2009). In order to confirm this observation and to identify potential correlates of protection in the MTCT context, we examined the breadth and levels of neutralizing antibodies in 57 transmitting and 57 non-transmitting untreated HIV-1 infected mothers. Our study confirmed that the breadth of maternal neutralizing antibodies was not associated with protection of infants from infection, but that neutralizing antibodies to particular strains might be associated with a lower rate of MTCT of HIV-1.

Le Virus de l’Hépatite C (VHC) infecte 170 millions de personnes dans le monde mais aucun vaccin n’est encore disponible. Le processus d’entrée du VHC dans les hépatocytes représente une cible prometteuse pour le développement de stratégie thérapeutique et est finement régulé par un nombre par les deux glycoprotéines d’envelope du VHC, E1 et E2, assemblé sous la forme d’un hétérodimère incorporé à la surface des particules virales. Cependant, comment E1 et E2 dialoguent, modifient leurs conformations et se coordonnent mutuellement au cours de l’entrée reste encore à être définit. Dans ce travail, nous avons souhaité clarifier l’interrelation entre E1 and E2 au cours de l’entrée afin d’ouvrir la voie à de potentiels stratégies thérapeutiques. Nous avons tout d’abord examiné si une importante divergence génétique entre des hétérodimères E1E2 pouvait être liée à l’existence de fonctions particulières. Nous avons observé une spécialisation des E1E2 isolé des Lymphocytes B pour l’infection de ces mêmes cellules mais pas des hépatocytes, suggérant que de nouvelles fonctions peuvent émerger de la plasticité conformationel de E1E2. Dans un second temps, nous sommes parvenus à identifier un dialogue conservé entre E1 et le domaine III de E2 (E2 DIII), critique pour les processus d’attachement et de fusion du VHC. Nous avons aussi montré grâce à une approche bio-informatique l’existence d’une co-évolution très importante entre E1 et E2. Cette approche a également prédit de potentiel changement de conformations au sein de l’hétérodimère, suggérant que E2 est sans doute une protéine de fusion capable de se replier sur elle-même via le repliement de son domaine III et l’aide de E1. Ainsi, ces différents travaux soulignent l’implication de E1 et E2 au sein de dialogues fins et complexes, qui régulent à la fois les conformations et les fonctions de l’hétérodimère. Ainsi, cela suggère que l’hétérodimère E1E2 représente plutôt une unité fonctionnelle et structurale unique, plutôt que l’association de deux protéines aux fonctions distinctes. / Hepatitis C Virus (HCV) infects more than 170 million people worldwide but no vaccine is available yet. HCV entry may represent a promising target for therapies and is mediated by two envelope glycoproteins, E1 and E2, assembled as heterodimer onto the virus surface. However, how E1 and E2 dialog, structurally rearrange and act together during these steps remain poorly defined. In this work, we aimed to clarify the interrelation of E1E2 during virus entry, thus opening ways to potential new therapeutic strategies. We first investigated whether a strong genetic divergence between E1E2 heterodimers may highlight distinct functions. We observed that B-cell derived E1E2 were specialized for B-cell infection, suggesting that new functions can emerge from the E1E2 conformational plasticity. In a second approach, we identified a conserved dialog between E1 and the domain III of E2 that was critical for virus binding and fusion. Moreover, a computational model predicted a strong co-evolution between E1 and E2 as well as potential structural rearrangements, suggesting that HCV E2 is likely a fusion protein able to fold over via its domain III through the mediation of E1. Altogether, these different works highlight that E1 and E2 are involved in complex dialogs that regulate the heterodimer folding and functions, suggesting that E1E2 heterodimer is more likely a single functional protein entity than an association of two proteins with specific functions.

L'hépatite B chronique reste un problème majeur de santé publique. Sous traitement par analogues nucléos(t)idiques (NUCs), l'objectif thérapeutique ultime est la clairance de l'antigène (Ag) HBs. Nous avons étudié l'influence de la variabilité des protéines d'enveloppe, impliquées dans l'entrée cellulaire du virus et cibles de la réponse immune, sur la clairance de l'Ag HBs. Des patients traités par NUCs ayant obtenu une clairance de l'Ag HBs (resolvers) ont été appariés à des non-resolver. Deux mutations combinées sT125M/sP127T, caractéristiques des non-resolver, étaient associées à une baisse de l'antigénicité prédite. L'analyse par séquençage haut débit montrait une plus grande variabilité du gène S chez les non resolver. Des tests fonctionnels portant sur des particules virales mutées en sT125M et sP127T sont en cours. Ces données moléculaires sont en faveur de l'existence de "motifs" spécifiques dans le gène S associés à la persistance de l'Ag HBs sous traitement par NUCs / Hepatitis B virus (HBV)-related chronic infection remains difficult to eradicate. On treatment by nucleos(t)ide analogues (NUCs), HBs Antigen (Ag) clearance is the ultimate but difficult therapeutic goal. Our aim was to investigate how variability of HBV envelope protein, crucial in viral cellular entry and targeted by host immune response, could play a role in HBsAg clearance. HBV chronically infected patients, treated by NUCs with HBsAg clearance (resolver) were matched with patients without HBsAg clearance (non resolver). Combined mutations sT125M/sP127T, associated with HBsAg persistence, displayed a lower predicted antigenicity. Ultra Deep Sequencing of S gene showed a higher variability in non resolver. Functional assays on viral particles including sT125M and sP127T mutations versus reference particles are in progress. As a conclusion, molecular features observed in non NR argue in favor of a different pattern in HBV S characteristics according to variable NUCs efficiency