Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T12:48:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1416528 bytes, checksum: afeca902a468f80e36241eb75bec099b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T12:48:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1416528 bytes, checksum: afeca902a468f80e36241eb75bec099b (MD5) Previous issue date: 2005-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diversas pesquisas têm demonstrado o potencial de α-galactosidases para o processamento de produtos alimentícios à base de leguminosas. A soja, uma fonte concentrada de isoflavonas, tem sido utilizada na prevenção e tratamento de câncer e osteoporose. Além disso, o leite de soja é considerado um substituto de baixo custo para o leite de vaca, como suplemento nutritivo para crianças intolerantes à lactose. Em contrapartida, leguminosas contêm muitos fatores antinutricionais, sendo um deles os oligossacarídeos de rafinose (RO), que são os principais fatores responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja. As mucosas intestinais de humanos e de animais monogástricos não possuem a enzima α-galactosidase, essencial para a hidrólise de ligações α-1,6 nos RO. Portanto, a eliminação dos RO dos produtos de soja contribui para melhorar o seu valor nutritivo. Esses galacto- oligossacarídeos são extremamente termoestáveis e, práticas tradicionais como embebição, cozimento e germinação são incapazes de eliminá-los completamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a hidrólise de RO presente no extrato desengordurado de soja e nos produtos de soja, melaços leve e pesado utilizando α-galactosidases extra e intracelulares purificadas de Debaryomyces hansenii, além da enzima extracelular imobilizada. Debaryomyces hansenii foi cultivada em meio mineral com extrato de levedura (MME), contendo galactose como fonte de carbono, por 36 h a 30 o C. Após este período, o meio de cultura foi centrifugado, o sobrenadante foi utilizado como fonte da enzima extracelular e as células como fonte da enzima intracelular. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de filtração em gel Sephadex G- 150 e posteriormente, à cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, pH 5,5. As frações protéicas com atividade de α-galactosidase foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0 a 1 M. As enzimas extra e intracelulares apresentaram fatores de purificação de 16,7 e 289 vezes, respectivamente, com um rendimento de 58 e 45 %, respectivamente. Atividades máximas das α-galactosidases extra e intracelulares foram detectadas em pH 5,0, a 60 e 55 o C, respectivamente. A enzima extracelular manteve 80 % da atividade original após pré-incubação por 3 h a 60 o C, enquanto que, a enzima intracelular manteve 85 % da atividade original por 6 h a 55 o C. Os valores da K M para ρ-NP-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima extracelular foram 0,30, 2,01, 9,66 e 16,0 mM, respectivamente, e para a enzima intracelular foram 0,32, 2,12, 10,8 e 32,8 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando ρ-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose e os polímeros goma de alfarroba e goma guar. As α-galactosidases foram completamente inibidas por sulfato de cobre. A enzima extracelular foi completamente inibida por nitrato de prata, enquanto que, a atividade da enzima intracelular foi reduzida em 70 %. Na presença do substrato ρ-NP-αGal a enzima extracelular apresentou inibição não-competitiva por galactose (Ki 2,7 mM) e melibiose (Ki 1,2 mM). A enzima intracelular apresentou inibição do tipo acompetitiva por galactose (Ki 0,70 mM) e inibição competitiva por melibiose (Ki 0,98 mM). O N-terminal da α-galactosidase extracelular foi determinado por seqüenciamento automático (YENGLNLVPQMGWN), apresentando similaridade com α-galactosidases de outros microrganismos. A α-galactosidase extracelular foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e apresentou maior estabilidade comparada à enzima livre, mantendo 94 % de sua atividade original por 16 h a 70 o C. Os resultados dos tratamentos do leite de soja a 60 o C com a α- galactosidase extracelular purificada, com as células permeabilizadas contendo a enzima intracelular e com a enzima extracelular imobilizada, por 2, 2 e 4 h, respectivamente, mostraram redução de 100 % de estaquiose. Houve 100 % de redução de rafinose, com a enzima extracelular e com as células permeabilizadas, após 2 e 4 h, respectivamente. O tratamento do leite de soja com a enzima extracelular imobilizada por 10 h, promoveu redução de 63 % de rafinose. Após tratamento com a α-galactosidase extracelular a 60 o C, os produtos melaços leve e pesado, mostraram 100 % de redução de estaquiose após 2 h de incubação e rafinose foi reduzida em 60 e 50 %, respectivamente. Portanto, observa-se que as α-galactosidases de Debaryomyces hansenii foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares. / Several researches have demonstrated the potential of α-galactosidases in the processing of legume derived food. Soybean is a concentrated source of isoflavones, which has been used in prevention and treatment of cancer and osteoporosis. Besides, soy milk is considered a substitute for cow milk, as well as a nutritional suplement for lactose intolerant children. On the other hand, there are many antinutritional features in legume. The raffinose oligosaccharides (RO) are the main responsible for gastric and intestinal diseases related to the ingestion of soy products. The intestinal mucous membrane of men and monogastrics animals does not have the α-galactosidase enzyme, which is essential for hydrolysis of the α-1,6 linkages in the RO. Therefore, the most important factor for improvement of soy nutritional value is to eliminate the RO from soy products. These galacto- oligosaccharides are extremely thermostable and traditional practices like embebition, cooking and germination are unable to eliminate them completely. The present work aims to evaluate the hydrolysis of RO present in the fat free soybean extract and in the soybean molasses, using purified extra and intracellular α- galactosidases from Debaryomyces hansenii and the immobilized extracelular enzyme. The Debaryomyces hansenii was cultivated in mineral medium with yeast extract (MME), which contained galactose as carbon source for 36 h at 30 o C. Following the centrifugation of the culture medium, the supernatant was used as extracellular enzyme source and the cells as intracellular enzyme source. The enzymatic extracts were submitted to the chromatography of gel filtration Sephadex G-150 followed by the ion exchange chromatography DEAE- Sepharose, pH 5.5. The protein fractions with α-galactosidase activity were eluted with NaCl gradient from 0 to 1 M. The extra and intracellular enzymes presented purification factors of 16.7 and 289 times, respectively, with a recovery of 58 and 45 %, respectively. The maximum activities of the extra and intracellular α- galactosidases were detected in pH 5.0 at 60 and 55 o C, respectively. The extracellular enzyme maintained 80 % of its original activity after a pre-incubation for 3 h at 60 o C, while the intracellular enzyme maintained 85 % of its original activity for 6 h at 55 o C. The values of K M for ρ-NP-αGal, melibiose, stachyose and raffinose for the extracellular enzyme were 0.30, 2.01, 9.66 e 16.0 mM, respectively, and for the intracellular enzyme were 0.32, 2.12, 10.8 e 32.8 mM, respectively. The α-galactosidases presented absolute specificity for galactose in α position, hydrolysing ρ-NP-αGal, stachyose, raffinose, melibiose and the polymers locust bean gum and guar gum. The α-galactosidases were completely inhibited by copper sulphate. The extracellular enzyme was completely inhibited by silver nitrate, while the intracellular enzyme activity was reduced in 70 %. In the presence of substrate ρ-NP-αGal the extracellular enzyme presented a non- competitive inhibition by galactose (Ki 2.7 mM) and melibiose (Ki 1.2 mM), the intracellular enzyme showed acompetitive inhibition by galactose (Ki 0.70 mM) and competitive inhibition by melibiose (Ki extracellular α-galactosidase was 0.98 mM). The N-terminal of the determined by automatic sequencing (YENGLNLVPQMGWN), presenting some similarity with α-galactosidases of other organisms. The extracellular α-galactosidase was immobilized in insoluble support (modified silica) and presented greater stability than the free enzyme, maintaining 94 % of its original activity for 16 h at 70 o C. The results of the treatments of soy milk at 60 o C with purified extracellular α-galactosidase, permeable cells containing the intracellular enzyme and immobilized extracellular enzyme, for 2, 2 and 4 h, respectively, showed reduction of 100 % in the amount of stachyose. There was 100 % reduction in the amount of raffinose by the extracellular enzyme and by permeable cells, after 2 and 4 h, respectively. The treatment of the soy milk with the immobilized extracellular enzyme for 10 h promoted reduction of 63 % in raffinose amount. After a treatment with extracellular α-galactosidase the light and heavy molasses products showed 100 % reduction of stachyose after incubation for 2 h at 60 o C, and the raffinose was reduced to 60 and 50 %, respectively. Therefore, it can be observed that α-galactosidases of Debaryomyces hansenii were efficient in reducing the RO presents in soy derived products, and they are appropriate to industrial use in the processing of these sugars. / Dissertação importada do Alexandria