Σήμερα ο καρκίνος του δέρματος αποτελεί την πιο κοινή μορφή καρκίνου. Κάθε χρόνο στις ΗΠΑ πάνω απο ένα εκατομμύριο άνθρωποι προσβάλλονται απο κάποια μορφή καρκίνου του δέρματος. Οι τρεις κύριες κατηγορίες δερματικών καρκίνων είναι το Βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (BCC), το Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) και το Μελάνωμα, με τις δύο πρώτες να αποτελούν πιο ήπιες μορφές καρκίνου με σαφώς καλύτερη πρόγνωση σε σχέση με το μελάνωμα. Ο στόχος αυτής της εργασία είναι να διερευνήσει το ρόλος του μεταγράφικου παράγοντα CREB σε καρκινικά κύτταρα του δέρματος. Ο CREB ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και το μεταβολισμό της γλουκόζης καθώς και γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. ‘Εχει αποδειχθεί οτι ο CREB υπερεκφράζεται ή βρίσκεται στην ενεργή φωσφωριλιωμένη του μορφή σχεδόν σε όλους τους τύπους καρκίνου. Στον καρκίνο του δέρματος υπάρχει ενεργοποίηση και υπερέκφραση του CREB κατά την εξέλιξη προς κακοήθη φαινότυπο. Ξέρουμε επίσης οτι η μεταστατική ικανότητα του μελανώματος σχετίζεται με τη δραστηριότητα και υπερέκφραση του CREB. Παρόλα αυτά η έρευνα σχετικά με τον ρόλο του CREB στον καρκίνο του δέρματος βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο. Ο στόχος αυτής της ερευνητικής εργασίας είναι να διερευνήσει τον ρόλο του CREB στον καρκίνο του δέρματος και πιο συγκεκριμένα στοχεύουμε να μελετήσουμε την έκφραση του pCREB και του CREB σε δείγματα ασθενών, να εξακριβώσουμε ποιά είναι τα γονίδια-στόχοι του CREB κατά την ογκογένεση και μετάσταση, καθώς και τον αριθμό των αντιτύπων του σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και να δημιουργήσουμε stable mutant CREB κυτταρικές σειρές. Τέλος, να μελετήσουμε την επίδραση της αποσιώπησης του CREB σε καρκινικές σειρές με siRNA πειράματα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε μια σειρά απο πειράματα ανοσοïστοχημείας σε Knock out έμβρυα προκειμένου να εντοπίσουμε αντισώματα-δείκτες του πολλαπλασιασμού. Στην συνέχεια μελετήσαμε την παρουσία της ενεργής μορφής του CREB με tissue array σε πλακάκια που έφεραν ιστό από διάφορους τύπους καρκίνου του δέρματος. Επιπλέον, μελετήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων της καρκινικής σειράς Α 375 ανθρώπινου μελανώματος μετά από την επίδραση της αποσιώπησης της έκφρασης του CREB μέσω siRNA μορίων (CREB siRNA knock down). Τέλος, μελετήθηκε η βιωσιμότητα κυττάρων ανθρώπινου μελανώματος (Α375) που εκφράζουν σταθερά μια dominant negative μορφή του CREB (CREB-M1) και μια σταθερά ενεργοποιημένη μορφή (CREB-FY) σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου που είχαν σταθερά διαμολυνθεί με GFP. / --

Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος είναι το αποτέλεσμα της κακοήθους εξαλλαγής των μελανοκυττάρων της επιδερμίδας και χαρακτηρίζεται απο συνεχώς αυξανόμενη επίπτωση και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η αξιοσημείωτη δε ανθεκτικότητα που επιδεικνύει το προχωρημένο μεταστατικό μελάνωμα στα χημειοθεραπευτικά σχήματα και στην ακτινοθεραπεία κάνει επιτακτική την ανάγκη για νέους, πιο αποτελεσματικούς θεραπευτικούς παράγοντες. Ένας αυξανόμενος όγκος δεδομένων υποστηρίζει τη παρουσία και ενεργό συμμετοχή καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων (cancer stem cells, CSCs) στην ανάπτυξη και μετάσταση του μελανώματος. Οι μεταγραφικοί παράγοντες EZH2, SOX2 και Oct4 αποτελούν μόρια – κλειδιά στον έλεγχο του ρυθμιστικού δικτύου του stemness των εμβρυϊκών stem κυττάρων (ESCs). Είναι πλέον γνωστό ότι η χρωματίνη στα ESCs περιλαμβάνει περιοχές με «αντιμαχόμενες» τροποποιήσεις ιστονών (bivalent domain), οι οποίες φυσιολογικά σχετίζονται είτε με ενεργή (Η3Κ4me3) ή με ανενεργή κατάσταση της χρωματίνης (H3K27me3), ενώ η απορρύθμιση των επιγενετικών μηχανισμών ελέγχου σε συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους έχει συσχετισθεί με τη καρκινογένεση στον άνθρωπο. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των bivalent domain φαίνεται να έχουν οι πρωτεΐνες της οικογένειας Polycomb, και ιδιαίτερα ο EZH2 που δρα σαν μεθυλοτρανσφεράση στην επιγενετική τροποποίηση H3K27. Πρόσφατα, μια σειρά από μελέτες έδειξαν ότι CScs στη διηθητική παρυφή του όγκου ενδέχεται να συμμετέχουν ενεργά στη καρκινογένεση. Επιπλέον, η ανακάλυψη ότι η βιολογική διαδικασία της επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) οδηγεί υποπληθυσμούς καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου να αποκτήσουν ιδιότητες stem κυττάρων, φαίνεται να αποτελεί τον σύνδεσμο μεταξύ μετάστασης και κατάστασης πολυδυναμίας (stemness). Σύμφωνα λοιπόν με τη θεώρηση αυτή, είναι πιθανό τα CSCs να εντοπίζονται κυρίως στη διηθητική παρυφή ενός όγκου, ενώ επιπλέον οι ιδιότητες stem κυττάρων που έχουν αποκτήσει είναι το αποτέλεσμα κυρίως της ΕΜΤ. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει επομένως εξαιρετικό ενδιαφέρον η προσεκτική και στοχευμένη εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα στην διηθητική παρυφή του μελανώματος, και αυτός ήταν ένας από τους στόχους της παρούσας διαδακτορικής διατριβής. Σκοπός. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, Oct4, SOX2 όπως επίσης και την παρουσία των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 (bivalent domain) στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Παράλληλα, μελετήθηκε η πιθανότητα αναγνώρισης και στοχοποίησης καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες stem κυττάρων, με ιδιαίτερη έμφαση στη διηθητική παρυφή του όγκου. Υλικό και μέθοδος. Το ποσοστό κυττάρων με ανοσοθετικότητα για τα αντισώματα έναντι των μεταγραφικών παραγόντων EZH2, SOX2 και Oct4 όπως επίσης και των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 and H3K27me3 εκτιμήθηκε σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα 250 του δέρματος, εφαρμόζοντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Από αυτό το σύνολο των 89 δειγμάτων τα 70 αφορούν πρωτοπαθές μελάνωμα δέρματος, ενώ τα υπόλοιπα 19 προέρχονται από υλικό που εξαιρέθηκε κατά τη χειρουργική εκτομή του μεταστατικού μελανώματος. Επιπλέον 14 δείγματα περιείχαν εκτός από καρκινικά κύτταρα μελανώματος και κύτταρα σπίλων. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) και H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA). Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI). Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Πυρηνική χρώση ανιχνεύθηκε για τα αντισώματα έναντι των EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ αντίθετα βρέθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση για τους παράγοντες SOX2 και Oct4. Παρατηρήθηκε ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας στα κύτταρα μελανώματος με σημαντικά αυξημένο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με θετική ανοσοχρώση H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή του όγκου. Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο μεταγραφικός παράγοντας EZH2, χωρίς όμως η διαφορά να είναι στατιστικά σημαντικά, ενώ παρατηρήθηκε και σε ορισμένες μεμονωμένες περιπτώσεις με τον SOX2. Όσον αφορά τον ΕΖΗ2, βρέθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του παράγοντα στα κύτταρα μελανώματος σε σχεση με τα σπιλοκύτταρα (p=0.02). H πυρηνική έκφραση SOX2 ήταν σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της βασική στιβάδας (p=0.02), όπως επίσης και στα σπιλοκύτταρα συγκριτικά με τα κερατινοκύτταρα της βασικής (p=0.0016) και της υπερβασικής στιβάδας (p=0.027). Η συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης με διάφορες παραμέτρους των ασθενών έδεξε υψηλότερα επίπεδα SOX2 στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045), στα κύτταρα μελανώματος με πάχος όγκου κατά Breslow <1mm (p=0.023), χωρίς εξέλκωση (p=0.009) και με αριθμό μιτώσεων ≤6 μιτ/mm2 (p=0.016). Τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης Oct4 βρέθηκαν υψηλότερα στα σπιλοκύτταρα σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα (p<0.001) αλλά και με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.004). Η μελέτη ωστόσο της κυτταροπλασματικής ανοσοθετικότητας έδειξε σημαντική μείωση των επιπέδων Oct στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κερατινοκύτταρα της υπερβασικής στιβάδας (p<0.001), όπως επίσης στα μεταστατικά σε σχέση με τα πρωτοπαθή μελανώματα (p=0.025). Αξιοσημείωτο είναι επίσης ότι το προφίλ έκφρασης του Oct4 βρέθηκε σε ορισμένες περιπτώσεις να αυξάνεται τοπικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων εντός των μελανωμάτων. Τα μελανώματα με υψηλό επίπεδο διήθησης κατά Clark (IV-V) (p=0.038) ή μεγάλο 251 πάχος όγκου κατά Breslow (>1mm) (p<0.001) εμφάνισαν χαμηλότερο ποσοστό καρκινικών κυττάρων με ανοσοθετικότητα για το αντίσωμα H3K4me2 σε σχέση με τους όγκους με μικρότερο βαθμό διήθησης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι οι μεταστατικοί όγκοι είχαν χαμηλότερα ποσοστά θετικής ανοσοχρώσης και για τις δύο επιγενετικές τροποποιήσεις, H3K4me2 και H3K27me3, συγκριτικά με τους πρωτοπαθείς όγκους (p=0.0065 και p=0.027 αντίστοιχα). Τέλος, η ανάλυση της παράλληλης ανοσοϊστοχημικής έκφρασης στα κύτταρα μελανώματος έδειξε θετική συσχέτιση των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων (p<0.01), όπως επίσης και μεταξύ του EZH2 και της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 (p=0.03). Ισχυρή συσχέτιση βρέθηκε παρομοίως μεταξύ των επιπέδων έκφρασης Oct4 και SOX2, τόσο για την πυρηνική όσο και την κυτταροπλασματική εντόπιση (p<0.001 και p<0.001 αντίστοιχα). Συμπεράσματα. Λαμβάνοντας υπόψη τη λειτουργική σημασία των τριών υπό μελέτη μεταγραφικών παραγόντων και του ρόλου των επιγενετικών μηχανισμών στην καρκινογένεση, τα ευρήματα μας εισηγούνται ότι οι ΕΖΗ2, SOX2, Oct4 όπως επίσης και οι επιγενετικές τροποποιήσεις Η3Κ4me3 και H3K27me3 αποτελούν εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα, και ιδιαίτερα στη διηθητική παρυφή του όγκου. Η υπόθεση αυτή πρέπει να διεριευνηθεί περαιτέρω, καθώς θα μπορούσε να αποτελέσει, σε συνδυασμό και με άλλες μελέτες, ένα μικρό βήμα προς τη κατεύθυνση της στοχευμένης αντικαρκινικής θεραπείας του μελανώματος στα πλαίσια της Ιατρικής του μέλλοντος. / Cutaneous malignant melanoma originates from melanocytes and is characterized by constantly growing incidence and mortality rates world-wide. The substantial unresponsiveness of advanced metastatic melanomas to most forms of chemotherapy and radiation indicates an urgent need for more effective agents to overcome chemoresistance. Accumulating evidence strongly suggests the presence and involvement of cancer cells with properties of stem cells (CSCs) in the initiation, progression and metastasis of malignant melanoma. EZH2, SOX2 and Oct4 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Genome-wide analyses of chromatin states of embryonic stem and progenitor cells suggest a ‘bivalent’ colocalization of the activating H3K4 methylation and the repressive H3K27me3 in development-associated genes, while the misregulation of histone modifications on specific residues actively contributes to human cancer. PcG proteins and mainly EZH2 are responsible for maintaining the balance of the bivalent chromatin domain through the methylation of H3K27. Recently a number of studies have shown that cancer cells with properties of stem cells at the tumor invasion front might be involved in the development of metastasis. The discovery that the epithelial to mesenchymal transition (EMT) generates cells with properties of stem cells and a more invasive and metastatic phenotype, brings a connection between metastasis and stem-cell state. According to this model, cells with stem cell properties are located predominantly at the invasion front of the tumor and can derive through the acquisition of transient EMT phenotype. In this context, a comparative analysis of the expression profile of putative CSC markers between the invasion front and the inner tumor mass could test this hypothesis in the case of cutaneous melanoma as well. Purpose. Taking these data into account, we performed the current study in order to evaluate the immunohistochemical expression of EZH2, SOX2 and Oct4 as well as H3K4me2 and H3K27me3, which constitute stem cell-like "bivalent"domains, in cutaneous malignant melanoma, investigating besides the potential identification of cancer cells with stem cells properties at the invasion front of the tumor. Materials and methods. Expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 was evaluated in 89 malignant melanoma (MM) lesions, deriving from 79 patients, using immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. The analyzed cases were accessioned over the time interval 2001-2010 and retrieved from an electronic database maintained by the Department of Pathology of the University General Hospital of Patras (Rion, Greece). The sample consists of 70 primary and 19 metastatic specimens. 14 specimens contained both melanoma cells and nevus cells. Analysis and comparative studies were carried out on the expression of the proteins tested in nevus cells (where existed), melanoma cells, melanoma cells at the invasion front, basal and suprabasal 253 keratinocytes as well. Polymer based technique (Envision, Dako, USA) or MACH4 Universal HRPPolymer Detection (Biocare Medical, USA) and primary antibodies against EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) and H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 19.0). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. The three markers studied, EZH2, H3K4me2 and H3K27me3, were identified in the cell nuclei of melanoma cells, nevus cells and normal epidermal keratinocytes, while SOX2 και Oct4 showed nuclear as well as cytoplastik expression. A specific distribution pattern of H3K4me2 and H3K27me3 was found, as stronger levels were localized at the invasion front of the tumor (p=0.034 and p<0.01 respectively). A similar trend was also observed for EZH2, whithout achieving however statistical significance (p=0.08), and similarly for SOX2 in a few sporadic cases. Significantly increased EZH2 immunohistochemical expression was observed in melanoma cells with respect to nevus cells (p=0.02). Nuclear SOX2 levels were also higher in melanoma cells than basal keratinocytes (p=0.02) and in nevus cells than basal keratinocytes (p=0.0016) and suprabasal keratinocytes (p=0.027). Furthermore LIs in melanoma cells presented significantly higher values in primary with respect to metastatic malignant melanoma lesions (p=0.045) as well as in melanoma cells with low Breslow’s depth (≤1mm) (p=0.023), under the absence of ulceration (p=0.009) and with low (≤6/mm2) mitotic rate (p=0.016). As well as nuclear expression of Oct4 is concerned, it was found increased in nevus cells with compared to keratinocytes (p<0.001) and melanoma cells (p=0.004). Cytoplastic expression of Oct4 followed an opposite trend, with decreasing levels in melanoma cells with respekt to suprabasal keratinocytes (p<0.001) and in metastic compared to to primary melanoma cases (p=0.025). Remarkably occasionally increased Oct4 expression in endothelial cells of the tumor microvasculature in melanoma tissues was observed. Furthermore, H3K4me2 and H3K27me3 levels were lower in metastatic with respect to primary melanoma cases (p=0.0065 and p=0.027 respectively). Advanced melanoma demonstrated significantly lower H3K4 immunohistochemical expression than cases of lowest Clark’s level (I) (p=0.038) or low Breslow’s depth (≤1 mm) (p<0.001). Moreover, EZH2 expression in melanoma cells was higher compared to nevus cells (p=0.02). Finally statistical analysis further revealed a positive correlation in melanoma cells betwenn EZH2 and H3K27me3 (p=0.03), H3K4me2 and H3K27me3 (p<0.01), as well as between Oct4 and SOX2 for both nuclear and cytoplastik expression (p<0.001 and p<0.001 respektively). Conclusions. Our results suggest the possibility that combined immunohistochemical expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 might identify cancer cells with potential stem cell properties, particularly at the invasion front of this malignancy. This hypothesis should be further investigated, as many of the epigenetic changes are reversible via pharmacologic manipulations and new CSC-directed therapies, overpassing the resistance of advanced melanoma, may be developed.

Η επούλωση των πληγών είναι μια ουσιώδους σημασίας φυσιολογική διεργασία για τη διατήρηση της ομοιόστασης ενός ιστού, και ειδικά όσον αφορά το δέρμα έχει απασχολήσει πληθώρα μελετητών τα τελευταία 100 χρόνια. Αυτό συμβαίνει σε μεγάλο βαθμό διότι το δέρμα είναι ένας ιδιαίτερα σύνθετος ιστός που οι τραυματισμοί του επηρρεάζουν μια πληθώρα δομών, κυτταρικών στιβάδων και κυτταρικών σειρών. Το τραύμα προκαλεί επίσης βλάβη ακόμα και σε επίπεδο ανεξάρτητων κυττάρων. Η ποικιλία των κυτταρικών τύπων που συμμετέχουν στην επούλωση, η πολυπλοκότητα των μηχανισμών, και ο ιδιαίτερος ρόλος που διαδραματίζουν τα stem κύτταρα σε αυτή τη διαδικασία αναμένεται να αποτελέσει αυξημένου ενδιαφέροντος πεδίο έρευνας και για τα χρόνια που θα επακολουθήσουν. Η παρούσα μελέτη αποτελεί βιβλιογραφική ανασκόπηση η οποία επικεντρώνεται τόσο στους μηχανισμοί αναγέννησης και επούλωσης που λαμβάνουν χώρα στο δέρμα, όσο και στον ρόλο τον οποίο διαδραματίζουν τα stem κύτταρα στην άρτια επιτέλεση αυτών των βιολογικών φαινομένων / Wound healing is a fundamental natural process for maintaining the homeostasis of a tissue. Especially when it comes to skin, wound healing is an especially complex process, and its trauma affects a wide diversity of structures. This study focuses on the cellular and molecular mechanisms of healing and regeneration that take place in skin, as well as the role of stem cells in this procedure.

Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετάται η συμπεριφορά του ανθρώπινου δέρματος κατά την εφαρμογή σημειακής (κατακόρυφης) δύναμης αλλά και μη σημειακής (επιφανειακής). Για τη μελέτη κατασκευάζεται εικονικό μοντέλο τμήματος του δέρματος με χρήση πεπερασμένων στοιχείων. Στόχος είναι η εισαγωγή του μαθηματικού μοντέλου σε ρομποτικό σύστημα το οποίο θα κάνει ένεση προκαλώντας το λιγότερο δυνατό πόνο ή μασάζ με τη μεγαλύτερη δυνατή αποτελεσματικότητα. Στη διπλωματική δεν προγραμματίζεται κάποιο ρομπότ που να επιτελεί το έργο αυτό, αλλά αναπτύσσεται ο κώδικας σε matlab ο οποίος μετασχηματισμένος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί από ένα ρομποτικό σύστημα. Αρχικά, αναλύεται η μέθοδος των πεπερασμένων στοιχείων ώστε να επιλεγεί το κατάλληλο μοντέλο για το πρόβλημά μας. Με την παραδοχή ότι υπάρχει αξονική συμμετρία επιλέγεται να χρησιμοποιηθεί μια δομή δύο διαστάσεων αποτελούμενη από δύο στρώματα διαφορετικής ελαστικότητας (υποθετικά, δέρμα και υποδόριος ιστός). Για τη μοντελοποίηση αυτή αναλύονται οι διαδικασίες που πρέπει να ακολουθηθούν και οι παραδοχές που πρέπει να ληφθούν υπ’ όψιν. Επίσης, αναλύεται με μαθηματικό τρόπο η προσέγγιση του προβλήματος παραμόρφωσης σε δύο διαστάσεις. Στη φάση αυτή, ανάπτυξης και επιλογής του βέλτιστου μοντέλου, η προσομοίωση γίνεται εξ' ολοκλήρου σε matlab. Στη συνέχεια, αφού ορισθεί το μοντέλο σε δύο διαστάσεις πρέπει να προσδιοριστούν οι παράμετροι για το σχετικό πάχος των δύο στρωμάτων και τη σχετική τους ελαστικότητα ώστε το μοντέλο να ανταποκρίνεται στην πραγματικότητα. Για να επιτευχθεί η συγκριτική αυτή αξιολόγηση, χρησιμοποιούνται δύο ομάδες πραγματικών πειραματικών τιμών που περιγράφονται σε σχετικές μελέτες διαθέσιμες στη διεθνή βιβλιογραφία. Δοκιμάζονται συγκριτικά διάφορα ζεύγη παραμέτρων με στόχο να γίνει μια ανάλυση ευαισθησίας του μοντέλου, και να εντοπιστεί αυτός ο συνδυασμός τιμών για τον οποίο υπάρχει η ελάχιστη απόκλιση από τα πειραματικά δεδομένα. Τέλος, αξίζει να αναφέρουμε πως στο δεύτερο τμήμα της εργασίας όπου μοντελοποιείται η συμπεριφορά του δέρματος σε μη σημειακή καταπόνηση χρησιμοποιούνται τα ίδια πειραματικά δεδομένα καθώς και δεδομένα από άλλες προσπάθειες μοντελοποίησης. Ο κώδικας που χρησιμοποιείται είναι κατά ένα μεγάλο ποσοστό ίδιος με αυτόν του 1ου μέρους. / The scope of this thesis is the study of the behavior of the human skin surface at the application of a vertical point as well as a non-point force on it. A model of a skin part is developed for the needs of this study, with use of finite elements method. The aim is to introduce the mathematical model in a robotic system which will inject causing the least possible pain or massage with maximum efficiency. In this thesis the robot is not being programmed, but it is been developed the code in matlab which by an appropriate transformation it could be used by the robot. First of all, the finite element method is been analyzed in order to select an appropriate model for our problem. Assuming axial symmetry is chosen to use a two-dimensional structure consisting of two layers of different elasticity (supposedly, skin and subcutaneous tissue). For the modeling the procedures we have to follow and the standards we should take into account are being analyzed. Furthermore we analyze the approach of the problem of deformation in two dimensions mathematically. At this stage, construction and selection of the optimal model, the simulation is entirely in matlab application. Then, after having built the model in two dimensions, the parameters for the relative thickness of both layers and their relative flexibility to the model to reflect reality must be defined. To achieve comparative evaluation, two groups of actual experimental values described in related studies available in the literature. Several pairs of parameters are being tested and compared in order to do a sensitivity analysis of the model, and found this combination of values for which there is little deviation from the experimental data. Finally it is worth mentioning that the second part of the work where the behavior of the skin in non-spot stress is being modeled there are used the same experimental data and data from other modeling efforts. The code used is a large proportion same as the one used in the 1st part.

Το καρκίνωμα εκ πλακώδους επιθηλίου ή πλακώδες καρκίνωμα (ΠΚ) του δέρματος είναι ο δεύτερος πιο συχνός καρκίνος του δέρματος και εμφανίζεται συνήθως σε έδαφος ακτινικής υπερκεράτωσης (ΑΚ). Τα νεοπλασματικά κύτταρα εκφράζουν μια ποικιλία αντιγόνων προσελκύοντας με αυτό τον τρόπο λεμφοκύτταρα, τα διηθούντα τον όγκο λεμφοκύτταρα (Tumor Ιnfiltrating Lymphocytes-TILs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Με βάση το ανοσοφαινοτυπικό τους προφίλ η πλειοψηφία των TILs εκφράζει το μόριο CD3 και αφορά σε Τ-λεμφοκύτταρα. Αυτά με την σειρά τους διαχωρίζονται σε CD8+ Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα και CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα. Η έκφραση του δείκτη CD25+ επιτρέπει τον διαχωρισμό των CD4+ λεμφοκυττάρων σε δύο επιπλέον υποομάδες, τα T-επικουρικά (CD4+/CD25-) και τα Τ-ρυθμιστικά (CD4+/CD25+) κύτταρα. Ο πιο αξιόπιστος δείκτης για την ανίχνευση των Τ-ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) θεωρείται ο Forkhead box P3 (Foxp3). Ο αυξημένος αριθμός των TILs έχει συσχετισθεί με την πρόγνωση και τη θεραπευτική αντιμετώπιση σε μια ποικιλία νεοπλασμάτων, περιλαμβανομένων και καρκίνων του δέρματος όπως το μελάνωμα. Η μεθοδολογία αξιολόγησης της λεμφοκυτταρικής διήθησης, ωστόσο, δεν έχει ακόμα αποσαφηνισθεί και ποικίλλει στα διάφορα είδη νεοπλασμάτων. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας η ανίχνευση των Τ-λεμφοκυττάρων έγινε με ανοσοϊστοχημική μέθοδο με τη χρήση των κατάλληλων αντισωμάτων (CD3, CD4, CD8, Foxp3). Η παρουσία των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου με δυο διαφορετικά ημιποσοτικά συστήματα βαθμολόγησης για όλους τους μελετηθέντες Τ-κυτταρικούς υποπληθυσμούς καθώς και με ένα τρίτο σύστημα ποσοτικής καταμέτρησης για τα Τregs. Σκοπός ήταν να γίνει σύγκριση των μεθόδων ώστε να βρεθεί η καταλληλότερη μεθοδολογία αξιολόγησης της λεμφοκυτταρικής διήθησης στο πλακώδες καρκίνωμα του δέρματος, να υπολογιστεί ο αριθμός των Tregs στις μελετούμενες οντότητες χρησιμοποιώντας το βέλτιστο σύστημα βαθμολόγησης και να αναζητηθούν διαφορές στην πυκνότητα των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών μεταξύ των οντοτήτων, οι οποίες μπορεί να έχουν παθογενετική ή θεραπευτική κλινική σημασία. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the skin is the second most common skin cancer. It usually develops in a background of actinic keratosis (AK). Neoplastic cells express a variety of antigens, attracting lymphocytes in the tumor microenvironment (Tumor Ιnfiltrating Lymphocytes-TILs). Based on the immunophenotypic profile, the majority of TILs expresses the CD3 molecule, so they are T-lymphocytes. These in turn are divided into CD8+ cytotoxic T-lymphocytes and CD4+ T-lymphocytes. The expression of CD25 enables the separation of CD4+ lymphocytes in two further subgroups, the T-helper (CD4+/CD25-) and T-regulatory (CD4+/CD25+) cells. The most reliable marker for the detection of T-regulatory cells (Tregs) is considered to be the Forkhead box P3 (Foxp3). The increased number of TILs is associated with prognosis and treatment in a variety of tumors, including skin cancers, such as melanoma. The evaluation methology of lymphocytic infiltration, however, is not yet clarified and varies in different types of tumors. In the context of this thesis, the detection of T-lymphocytes was performed by immunohistochemistry using the appropriate antibodies (CD3, CD4, CD8, Foxp3). The presence of the cells was evaluated using light microscopy with two different semiquantitative scoring systems, for all the T-lymphocyte subpopulations, as well as with a third system of quantification of Tregs. The purpose was to compare the methods in order to find the most suitable methodology for the evaluation of the lymphocytic infiltration in squamous cell carcinoma of the skin, to evaluate the number of Tregs in the studied entities using the best method and examine for differences in the density of lymphocyte subpopulations.