Το ενδογενές σύστημα των κανναβινοειδών αποτελεί ένα πολύπλοκο ενδογενές σύστημα μεταγωγής σήματος το οποίο επηρεάζει ένα σημαντικό αριθμό φυσιολογικών διεργασιών και μεταβολικών μονοπατιών του οργανισμού (Cota and Woods, 2005). Απαρτίζεται από τους διαμεμβρανικούς υποδοχείς των κανναβινοειδών (CBR), τα ενδοκανναβινοειδή και τις πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την βιοσύνθεση και την αποικοδόμηση των δεύτερων. (Petrocellis et al., 2004). Τα κανναβινοειδή παρουσιάζουν ποικιλία επιπτώσεων, όπως δυσλειτουργία στη μάθηση και μνήμη, διαφοροποίηση των συναισθηματικών καταστάσεων, μείωση κινητικού ελέγχου και αναλγησία. Αναστέλλουν τη συναπτική διαβίβαση σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου όπως ο ιππόκαμπος, ο επικλινής πυρήνας και ο προμετωπιαίος φλοιός κυρίως μέσω προσυναπτικών μηχανισμών. Το γλουταμινικό οξύ είναι ο κύριος διεγερτικός νευροδιαβιβαστής στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα των θηλαστικών. Οι γλουταμινεργικοί νευρώνες διανέμονται ευρέως στο κεντρικό νευρικό σύστημα και παίζουν ρόλο σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της κωδικοποίησης των πληροφοριών, το σχηματισμό και την ανάκτηση των μνημών, τη χωρική αναγνώριση και τη διατήρηση της προσοχής (McEntee και Crook, 1993). Λόγω του ρόλου του στη συναπτική πλαστικότητα, το γλουταμινικό εμπλέκεται σε γνωσιακές λειτουργίες του εγκεφάλου, όπως η μάθηση και η μνήμη (McEntee και Crook, 1993). Το γλουταμινικό δρα στα μετασυναπτικά κύτταρα σε τρεις οικογένειες ιοντοτροπικών υποδοχέων τους NMDA, τους AMPA και τους καϊνικούς υποδοχείς, ενώ υπάρχουν, επίσης, και γλουταμινικοί μεταβολοτροπικοί υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες. Η αμυγδαλή εκτελεί ένα πρωταρχικό ρόλο στην επεξεργασία των συναισθηματικών αντιδράσεων και τη μνήμη, ενώ ο ιππόκαμπος έχει σημαντικό ρόλο στην εδραίωση των πληροφοριών από βραχυχρόνια μνήμη σε μακροχρόνια μνήμη και στη χωρική πλοήγηση. Οι δύο αυτές περιοχές είναι πλούσιες σε CB1 και NMDA υποδοχείς, ενώ τα τελευταία χρόνια, πληθώρα ερευνών υποδεικνύει ότι η έκθεση πειραματοζώων σε κανναβινοειδή επιφέρει σημαντικές αλλαγές σ’ αυτές τις δύο περιοχές. Στόχος της ερευνητικής εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης των κανναβινοειδών στο γλουταμινεργικό σύστημα, στην αμυγδαλή και τον ιππόκαμπο επίμυων. Η μελέτη επικεντώθηκε στους NMDA υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος με τη χρήση των μεθόδων της in situ υβριδοποίησης για το mRNA των NR1, NR2A και NR2B υπομονάδων του υποδοχέα και της ποσοτικής αυτοραδιογραφίας υποδοχέων, σε επίμυς που τους χορηγήθηκε WIN55212-2, ένας συνθετικός αγωνιστής του CB1 κανναβινοειδικού υποδοχέα, ο οποίος εμφανίζει παρόμοια δράση με την Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (THC), το φυσικό συστατικό του φυτού Cannabis sativa. Μελετήθηκαν τέσσερις ομάδες επίμυων όπου σε δύο από αυτές χορηγήθηκε WIN και στις υπόλοιπες δύο χορηγήθηκε ο διαλύτης του WIN, Vehicle. Στις δύο ομάδες που χορηγήθηκε WIN55212- 2 1mg/kg για 20 ημέρες, οι επίμυς της μίας ομάδας (ομάδα WIN) θανατώθηκαν 2 ώρες μετά από την τελευταία δόση ενώ οι επίμυς της άλλης ομάδας (ομάδα WIN+WITHD) θανατώθηκαν 7 ημέρες μετά την τελευταία δόση. Κατά το διάστημα αυτό δεν έγινε καμία χορήγηση ώστε να μελετηθεί αν οι επιπτώσεις της χρόνιας χορήγησης του WIN ήταν μόνιμες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μετά τη χρόνια χορήγηση του WIN τα επίπεδα έκφρασης των υπομονάδων του NMDA υποδοχέα μειώθηκαν στο ιππόκαμπο και την αμυγδαλή των επίμυων, ενώ μετά την διακοπή της χορήγησης του WIN, τα επίπεδα έκφρασης επανέχρονται. Είναι πιθανό ότι οι αλλαγές στην έκφραση και λειτουργία των υποδοχέων του γλουταμινικού που παρουσιάζονται ως προσαρμοστικές αλλαγές στο νευρικό σύστημα, να είναι ένας κοινός μηχανισμός με τον οποίο τα εθιστικά ναρκωτικά επηρεάζουν την νευρική λειτουργία. / The endocannabinoid system is a complicated endogenous signaling system that affects a variety of physiological processes and metabolic routes in human body (Cota and Woods, 2005). The endocannabinoid system includes the transmembrane cannabinoid receptors (CBR), the endocannabinoids and the enzymes that synthesize and degrade the endocannabinoids (Petrocellis et al., 2004). Cannabinoids have a variety of effects, such as impairment in learning and memory, modulation of emotional states, reduced motor control and analgesia. Cannabinoids inhibit synaptic transmission in several brain regions such as the hippocampus, nucleus accumbens and the prefrontal cortex mainly via presynaptic mechanisms. Glutamate is the most abundant excitatory neurotransmitter in the mammalian central nervous system. The glutamatergic neurons are widely distributed in the central nervous system and play a role in many biological processes, including the coding of information, the formation and recovery of memories, the spatial recognition and maintaining the attention (McEntee και Crook, 1993). Because of its role in synaptic plasticity, glutamate is involved in cognitive functions like learning and memory in the brain. (McEntee και Crook, 1993). Glutamate activates three families of ionotropic receptors in postsynaptic cells, those are NMDA, AMPA and kainate receptors, while there are also metabotropic G proteins coupled glutamate receptors. Amygdala has a primary role in the processing of emotional reactions and memory, whereas hippocampus has an important role in the consolidation of informations from short term memory into long term memory and spatial navigation. These two brain regions contain a large number of CB1 and NMDA receptors, while recently, many studies suggest that animals treated with cannabinoids display significant changes in these two areas. The aim of this research was to study the changes in glutamatergic system in the amygdala and hippocampus of rats treated with cannabinoids. We focused on NMDA glutamate receptors, using in situ hybridization for studying the expression of NR1, NR2A and NR2B subunits and quantitative receptor autoradiography, in rats treated with WIN55212-2, a synthetic agonist of the CB1 cannabinoid receptor, which shows similar effects with delta-9-tetrahydrocannabinol (THC), a natural component of the plant Cannabis sativa. Adult rats were injected with WIN55212-2 (1mg/kg) and Vehicle. Animals received repeated administrations of WIN55212-2 1mg/kg once a day for 20 days. Animals in group WIN were sacrificed 2 hours after the last administration whereas in group WIN + WITHD were sacrificed 7 days after the last administration. During this time there was no administration of WIN so we could study whether the effects of chronic exposure were permanent. Our results demonstrate that chronic exposure to WIN55212-2 produced significant decreases in the expression of NMDA receptor's subunits in hippocampus and amygdala. These changes were reversed one week after abstinence. These adaptive synaptic changes may share common mechanisms with addictive drugs in modifying neural circuitry.

Οι έρευνες που αρχικά στόχευαν στην ανίχνευση του μηχανισμού δράσης της Δ9-τετραϋδροκανναβινόλης, του κύριου ψυχοδιεγερτικού συστατικού που εξάγεται από την ινδική κάνναβη, οδήγησαν τελικά στην ανακάλυψη ενός νέου νευρορυθμιστικού συστήματος, του ενδογενούς κανναβινοειδούς συστήματος. Το ενδοκανναβινοειδές σύστημα περιλαμβάνει μια σειρά από ενδογενείς, λιπιδικής φύσεως προσδέτες (κυρίως την ανανδαμίδη και την 2-αραχιδονοϋλγλυκερόλη), μεμβρανικούς υποδοχείς (CB1-brain type, CB2-immune type, αλλά και άλλους) που ανήκουν στην υπεροικογένεια των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων, καθώς και τα ένζυμα εκείνα που είναι απαραίτητα για τη βιοσύνθεση και αποικοδόμησή τους. Στον ενήλικο εγκέφαλο τα ενδοκανναβινοειδή λειτουργούν ως παλίνδρομα σηματοδοτικά μόρια: απελευθερώνονται από μετασυναπτικά κύτταρα, ενώνονται με υποδοχείς που εντοπίζονται στους προσυναπτικούς νευρώνες και ρυθμίζουν την απελευθέρωση διαφόρων νευροδιαβιβαστών (κυρίως του ανασταλτικού γ-αμινοβουτυρικού οξέος, αλλά και του διεγερτικού γλουταμινικού οξέος). Οι κύριες επιδράσεις της τετραϋδροκανναβινόλης οφείλονται στη διέγερση αυτών των υποδοχέων και είναι ευφορία, διαταραχή πρόσφατης μνήμης και άλλων νοητικών λειτουργιών, ακινησία, αναλγησία, αύξηση της όρεξης. Στον αναπτυσσόμενο οργανισμό, η εντόπιση νωρίς κατά την εμβρυϊκή ζωή λειτουργικών CB1 υποδοχέων σε θέσεις στις οποίες δεν εκφράζονται στην ενήλικο ζωή (άτυπες θέσεις) αποτέλεσε μία από τις πρώτες ενδείξεις, οι οποίες οδήγησαν στην υπόθεση ότι το ενδοκανναβινοειδές σύστημα παίζει κάποιον/ους ρόλο/ους στην φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη. Το ενδιαφέρον σχετικά με τη σπουδαιότητα της ύπαρξης φυσιολογικής σηματοδότησης μέσω του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος προκειμένου να επιτευχθεί όχι μόνο φυσιολογική εμβρυογένεση, αλλά και μεταγεννητική ανάπτυξη, επικεντρώθηκε στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Τα πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι τώρα έχουν οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι τα κανναβινοειδή συμμετέχουν σε όλες τις διαδικασίες της φυσιολογικής εμβρυϊκής ανάπτυξης του νευρικού συστήματος: πολλαπλασιασμό και δέσμευση των προγονικών νευρικών κυττάρων προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, διαφοροποίηση των δεσμευμένων νευροβλαστών ή σπογγιοβλαστών, μετανάστευση των μεταμιτωτικών νευρώνων, μορφολογική και λειτουργική ωρίμανση των νευριτών, δημιουργία λειτουργικών συνάψεων, απόπτωση και μυελινοποίησηση των νευραξόνων. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας σχετικά με τον φυσιολογικό ρόλο των κανναβινοειδών στην ανάπτυξη του εμβρύου και ιδιαίτερα στην ανάπτυξη του κεντρικού νευρικού συστήματος. Μετά από μία συνοπτική περιγραφή της φυσιολογικής εμβρυογένεσης του κεντρικού νευρικού συστήματος, ακολουθεί η ανάλυση του ενδογενούς κανναβινοειδούς συστήματος, καθώς και των σηματοδοτικών μονοπατιών που η ενεργοποίηση των υποδοχέων του διεγείρει. Στη συνέχεια αναπτύσσονται διεξοδικά όλες οι απόψεις περί συμμετοχής του συστήματος αυτού στην φυσιολογική εμβρυογένεση. Είναι γνωστό ότι η τετραϋδροκανναβινόλη περνά τον αιματοπλακουντιακό φραγμό, φτάνει μέχρι τον εγκέφαλο του εμβρύου σε σημαντικές συγκεντρώσεις και μπορεί επομένως να διαταράξει τη φυσιολογική σηματοδότηση από τους CB1 υποδοχείς, η οποία φαίνεται να είναι απαραίτητη για την δημιουργία του φυσιολογικού νευρικού συστήματος. Η κατανόηση των μηχανισμών μέσω των οποίων τα κανναβινοειδή συμμετέχουν στη φυσιολογική εμβρυογένεση μπορεί ερμηνεύσει τα νοητικά και κοινωνικά ελλείμματα που παρουσιάζουν απόγονοι γυναικών που κατά τη διάρκεια της κυήσεως έκαναν χρήση κάνναβης, κάποια από τα οποία διαρκούν μέχρι την ενήλικο ζωή. / Recent evidence suggests that the endogenous cannabinoid system emerges and is operative early during brain development and that CB1 receptors are located in areas that do not contain or have a small density of these receptors in adult brain. This was the first hint which led to research about the potential role of the endocannabinoid system during brain development. It is now well accepted that endocannabinoids, acting as epigenetic factors, regulate neural progenitor proliferation, commitment into neuroblasts or spongioblasts, as well as differentiation of commited cells, control of neurite outgrowth, neurotransmitter maturation and establishment of synaptic contacts. There is also a great interest in the role of cannabinoids as neuroprotective agents in the developing, as well as the adult brain, though their role as a general endogenous protection system is yet to be established. In utero exposure to tetrahydrocannabinol (THC) induces behavioral and cognitive deficits enduring into adulthood. Improving our knowledge on the molecular mechanisms of cannabinoid actions during brain development could lead to a better understanding of these deficits.

Ο νεογνικός χειρισμός, ένα πειραματικό μοντέλο πρώιμων εμπειριών, είναι γνωστό ότι επηρεάζει τη λειτουργία του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων βελτιώνοντας την προσαρμοστικότητα, την αντιμετώπιση του στρες, τις διανοητικές ικανότητες και γενικά τις διεργασίες του εγκεφάλου που σχετίζονται με την πλαστικότητα. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ο νεογνικός χειρισμός τροποποιεί τη σεροτονινεργική, τη ντοπαμινεργική αλλά και τη γλουταμινεργική οδό, την κύρια διεγερτική οδό στον εγκέφαλο, μέσα από εκλεκτικές επιδράσεις τόσο στους υποδοχείς NMDA όσο και στους υποδοχείς AMPA στον εγκέφαλο των επίμυων. Το σύστημα των ενδοκανναβινοειδών του εγκεφάλου, δρώντας μέσω των υποδοχέων CB1, εμπλέκεται καθοριστικά στη διατήρηση της ομοιόστασης και της ενεργειακής ισορροπίας του οργανισμού, ενώ φαίνεται να έχει «αγχολυτικό» ρόλο ρυθμίζοντας συμπεριφορές όπως η πρόσληψη τροφής, ο φόβος και το άγχος, το αίσθημα ανταμοιβής και ευφορίας. Επίσης, διαδραματίζει έναν ιδιαίτερο ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος καθοδηγώντας τη δημιουργία των συνδέσεων του φλοιού με τις υποφλοιώδεις δομές. Πρόκειται για ένα δυναμικό σύστημα το οποίο δύναται να τροποποιείται με την εμπειρία, ενώ η λειτουργία του μεταβάλλεται κατά τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια, με τις κορυφαίες αλλαγές να σημειώνονται κατά την περίοδο της εφηβείας. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να ερευνηθεί εάν ο νεογνικός χειρισμός μπορεί να επιδρά στο σύστημα των ενδοκανναβινοειδών και αν η επίδραση αυτή μπορεί να παρουσιάζεται με διαφορετικό τρόπο στην εφηβεία από την ενηλικίωση. Μελετήσαμε έτσι την έκφραση των υποδοχέων CB1 στον εγκέφαλο εφήβων και ενηλίκων επίμυων, σε περιοχές που εμπλέκονται στην αντιμετώπιση του στρες, στη μνήμη, τη μάθηση, το συναίσθημα και την ανταμοιβή, όπως ο προμετωπιαίος φλοιός, η αμυγδαλή, ο ιππόκαμπος, το ραβδωτό σώμα και ο επικλινής πυρήνας. Σύμφωνα με το παρόν πρωτόκολλο νεογνικού χειρισμού, κάθε νεογνό απομακρυνόταν από τη φωλιά για 15 λεπτά καθημερινά από την πρώτη μεταγεννητική ημέρα μέχρι τον απογαλακτισμό του, τρεις εβδομάδες μετά. Χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του υβριδισμού in situ για την εντόπιση και ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA των υποδοχέων CB1 και η μέθοδος της ποσοτικής αυτοραδιογραφίας in vitro για την μέτρηση των επιπέδων δέσμευσης του υποδοχέα. Τα αποτελέσματά της έρευνας έδειξαν ότι ο νεογνικός χειρισμός προκάλεσε μεταβολές στην έκφραση των υποδοχέων CB1, με τρόπο ειδικό σε κάθε περιοχή και συχνά διαφορετικό στους εφήβους και στους ενήλικες επίμυες. Πιο συγκεκριμένα, οι έφηβοι επίμυες με χειρισμό παρουσίασαν αυξημένα, ενώ οι ενήλικες μειωμένα επίπεδα δέσμευσης των υποδοχέων CB1 στις περιοχές του προμετωπιαίου φλοιού και του επικλινούς πυρήνα. Επιπρόσθετα, ο νεογνικός χειρισμός επέφερε αύξηση τόσο των επιπέδων mRNA όσο και των επιπέδων δέσμευσης στο ραβδωτό σώμα των εφήβων επίμυων. Αντίθετα, οι ενήλικες επίμυες που είχαν υποστεί χειρισμό παρουσίασαν μείωση στα επίπεδα του mRNA στο ραβδωτό σώμα, χωρίς μεταβολή στα επίπεδα του λειτουργικού υποδοχέα στη συγκεκριμένη περιοχή. Στην αμυγδαλή, ο νεογνικός χειρισμός προκάλεσε αύξηση στα επίπεδα του mRNA ανεξάρτητα από την ηλικία, η οποία ακολουθήθηκε από αύξηση στα επίπεδα δέσμευσης του υποδοχέα CB1 μόνο στους εφήβους επίμυες με χειρισμό, ενώ οι ενήλικες δεν παρουσίασαν στατιστικώς σημαντική μεταβολή. Οι μεταβολές στην έκφραση του υποδοχέα CB1 θεωρούμε ότι συντελούνται μέσω επιγενετικής ρύθμισης ως αποτέλεσμα του νεογνικού χειρισμού και συνιστούν μια αντισταθμιστική απάντηση στη μεταβολή της ανάδρομης ενδοκανναβινοειδούς σηματοδότησης. Έτσι, το αποτέλεσμά μας στον προμετωπιαίο φλοιό, είναι πιθανόν να αντανακλά την ενίσχυση (στους ενήλικες) ή την αποδυνάμωση (στους εφήβους) της αρνητικής ανάδρομης ρύθμισης των κορτικοειδών στον άξονα του στρες, δεδομένων των αντίρροπων μεταβολών στα επίπεδα δέσμευσης του υποδοχέα CB1 στις δύο διαφορετικές ηλικίες. Τα αποτελέσματα στην αμυγδαλή, τον επικλινή πυρήνα και το ραβδωτό σώμα υποδηλώνουν αφενός μια διαφορετική «τονική» ρύθμιση του άξονα του στρες στα έφηβα ζώα με χειρισμό, και αφετέρου μια πιθανή εξασθένιση των λειτουργιών της ανταμοιβής και της δημιουργίας συνηθειών, η οποία ίσως να οδηγεί σε μειωμένη ευαισθησία στην εμφάνιση εθισμού. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η έκφραση των υποδοχέων CB1 μεταβάλλεται από το νεογνικό χειρισμό, ένα μοντέλο πρώιμης εμπειρίας, με τρόπο ειδικό ανά περιοχή και σε κάποιες περιπτώσεις διαφορετικό στους εφήβους από τους ενήλικες επίμυες. Αυτή η επίδραση του νεογνικού χειρισμού μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που συμβάλλουν στην αυξημένη πλαστικότητα του εγκεφάλου των ζώων που έχουν υποστεί νεογνικό χειρισμό, η οποία εκδηλώνεται τόσο σε κυτταρικό όσο και στο συμπεριφορικό επίπεδο. / Neonatal handling, an experimental model of early-life experience, is known to affect the hypothalamic-pituitary-adrenal axis function, improving adaptability, coping with stress, cognitive abilities and in general brain plasticity-related processes. Previous studies have shown that neonatal handling modifies the serotonergic, the dopaminergic and the glutaminergic pathway, the major excitatory pathway in the brain, through selective effects in both NMDA and AMPA receptors in rat brain. The endocannabinoid system of the brain, acting through CB1 receptors, is critically involved in maintaining homeostasis and energy body balance and it seems to have "anxiolytic" role regulating behaviors such as eating, fear and anxiety, feeling of reward and euphoria. It also plays a specific role in neural development, guiding the establishment of cortical-subcortical connections. It is a dynamic system which can be modified by experience and its function varies at different developmental stages, with the highest changes occuring during the period of adolescence. The present study addressed the question of whether neonatal handling might affect the endocannabinoid system and whether this effect is different in adolescence than adulthood. Thus, we investigated the expression of CB1 receptors in the adolescent and adult rat brain, looking in areas involved in coping with stress, learning and memory, emotion and reward, such as prefrontal cortex, amygdala, hippocampus, striatum and nucleus accumbens. According to the current neonatal handling protocol, each pup of a litter was removed from the nest for 15 min daily from the first postnatal day (PND1) until weaning (PND22). In situ hybridization and in vitro receptor autoradiography were used in order to localize and quantify CB1 receptor mRNA levels and receptor binding levels, respectively. We found that neonatal handling leads to changes in CB1 receptor expression, depending on brain region, which were different in adolescent and adult rats. More specifically, adolescent handled rats showed increased, while adults showed decreased CB1 receptor binding levels in prefrontal cortex and nucleus accumbens. In addition, neonatal handling induced an increase in both mRNA and binding levels in striatum of adolescents. However, adult handled rats had decreased mRNA levels in striatum, without a change in receptor binding levels in this region. In amygdala, neonatal handling brought an increase in mRNA levels regardless of age, which was followed by an increase in CB1 receptor binding levels only in adolescent handled rats, while adults showed no statistically significant change. The observed changes in CB1 receptor expression are thought to occur via epigenetic regulation in response to neonatal handling and may constitute a compensatory response to the change of retrograde endocannabinoid signaling. Thus, our result in the prefrontal cortex, may reflect strengthening (in adults) or weakening (in adolescents) of negative feedback on stress axis through corticosteroids, due to the opposite changes observed in CB1 receptor binding levels in the two different ages. The results in amygdala, nucleus accumbens and striatum suggest a different "tonic" regulation on the stress axis in adolescent handled animals, and also a reduced reward and habit formation function, which may lead to reduced susceptibility to addiction. In conclusion, in the present study we have shown that neonatal handling, an early-life experience model, leads to changes in CB1 receptor expression in a region- and age-specific manner. This effect of handling could be one of the factors underlying the increased blain plasticity of neonatally handled animals, which is manifested both at the cellular and at the behavioural/systemic level.